Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Vladimir Ponomarev for at dele luciferase-konstruktionerne, der anvendes i eksperimenterne beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater i denne artikel.

Følgende procedurer er blevet evalueret og godkendt af Memorial Sloan Ketterings Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Transfektion af 293T-celler med luciferase og høst af viral supernatant
<ol><li>Kultur af 293T-celler<ol><li>Forbered medier ved at tilføje følgende til en liter DMEM hver: 110 ml varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 11 ml penicillin-streptomycin.</li>
		<li>5 x 106 293T-celler optøs og overføres til en T175-kolbe med medie...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

Mens T-BsAb blinatumomab er blevet godkendt til CD19-positive hæmatologiske maligniteter, har den vellykkede implementering af T-BsAbs i solide tumorer vist sig meget vanskeligere. Catumaxomab, en T-BsAb rettet mod epitelcelleadhæsionsmolekyle (EPCAM), blev godkendt til behandling af ondartede ascites hos ovariecancerpatienter, men produktionen af lægemidlet blev efterfølgende stoppet af kommercielle årsager19. Ingen andre T-BsAbs er blevet godkendt til solide tumorer, hvilket understreger ud...

T-celleengagerende bispecifikke antistoffer (T-BsAbs) er konstruerede antistoffer, der anvendes til at tilvejebringe kunstig specificitet til polyklonale T-celler ved at engagere T-celler gennem en bindingsarm og et tumorantigen gennem en anden bindingsarm. Denne teknologi er med succes blevet anvendt til hæmatologiske kræftformer (CD19-målrettet blinatumomab1), og adskillige T-BsAbs er også i præklinisk og klinisk udvikling for en række solide tumorer2. T-BsAbs engagerer polyklonale T-celler på en større histokompatibilitetskompleks (MHC) -uafhængig måde, og derfor er selv tumorer, der nedregulerer humane leukocytantigener (HLA'er), modtagelige for denne type terapi 3,4. T-BsAbs er udviklet i snesevis af forskellige formater med forskelle i valens og rumligt arrangement af T-celle- og tumorbindingsarme, interdomæneafstande og inkludering af et Fc-domæne, hvilket påvirker halveringstiden og kan fremkalde effektorfunktioner, hvis de er til stede5. Tidligere arbejde i vores laboratorium har vist, at disse faktorer signifikant påvirker antitumoreffekten af T-BsAbs, med op til 1.000 gange forskelle i styrke6. Gennem dette arbejde identificerede vi IgG-[L]-scFv-formatet som den ideelle platform til T-BsAbs (se afsnittet Repræsentative resultater for flere detaljer om T-BsAb-formater) og har anvendt denne platform til mål, herunder GD2 (neuroblastom), HER2 (brystkræft og osteosarkom), GPA33 (kolorektal cancer), STEAP1 (Ewing Sarcoma), CD19 (B-cellemaligniteter) og CD33 (B-cellemaligniteter)7, 8,9,10,11,12,13.
En af de største udfordringer for en vellykket implementering af T-BsAb-terapi i solide tumorer er at overvinde et immunsuppressivt tumormikromiljø (TME) for at drive T-cellehandel til tumorer14. De faktorer, der påvirker T-BsAb-effekten beskrevet ovenfor, har en betydelig indvirkning på T-BsAbs evne til effektivt at inducere T-celle homing til tumorer, men denne effekt er vanskelig at evaluere i et in vivo-system i realtid. Dette manuskript giver en detaljeret beskrivelse af brugen af luciferase-transducerede T-celler i prækliniske studier af T-BsAbs til evaluering af T-cellehandel til forskellige væv i eksperimentelle immunkompromitterede musemodeller under behandlingen. Det overordnede mål med denne metode er at give et middel til at evaluere T-celleinfiltration i tumorer og andre væv samt realtidsindsigt i T-celle homing kinetik og persistens uden behov for at ofre dyr under behandlingen. For det stigende antal forskere, der fokuserer på cellulære immunterapier, er evnen til at spore T-celler in vivo i prækliniske dyremodeller afgørende. Vi tilstræber at give en grundig, detaljeret beskrivelse af den metode, vi har anvendt til sporing af luciferase-transducerede T-celler, så andre forskere nemt kan replikere denne teknik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

T-celleengagerende bispecifikke antistoffer (T-BsAbs) er i forskellige stadier af præklinisk udvikling og klinisk test for solide tumorer. Faktorer som valens, rumligt arrangement, interdomain afstand og Fc-mutationer påvirker antitumoreffektiviteten af disse terapier, almindeligvis ved at påvirke homing af T-celler til tumorer, hvilket fortsat er en stor udfordring. Her beskriver vi en metode til at transducere aktiverede humane T-celler med luciferase, hvilket muliggør in vivo-sporing af T-celler under T-BsAb-terapistudier. T-BsAbs evne til at omdirigere T-celler til tumorer kan kvantitativt evalueres på flere tidspunkter under behandlingen, så forskere kan korrelere antitumoreffektiviteten af T-BsAbs og andre interventioner med persistensen af T-celler i tumorer. Denne metode lindrer behovet for at ofre dyr under behandlingen for histologisk at vurdere T-celleinfiltration og kan gentages på flere tidspunkter for at bestemme kinetikken af T-cellehandel under og efter behandlingen.

Som beskrevet i trin 4.3 kan mus orienteres i forskellige positioner under billeddannelse for at evaluere tilstedeværelsen af T-celler i forskellige væv. Liggende positionering muliggør vurdering af T-celler i lungerne, hvilket er almindeligt på tidlige tidspunkter efter injektion. Lateral positionering med den subkutane xenograft opad bruges til bedst at vurdere T-cellehandel til tumoren. Hunmus C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac blev brugt til alle eksperimenter beskrevet i dette manu...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Her beskriver vi en metode til transducering af humane T-celler med luciferase for at lette in vivo-sporing af bispecifik antistofinduceret T-cellehandel til tumorer i undersøgelser for at evaluere antitumoreffekten og mekanismen for T-celleengagerende bispecifikke antistoffer.

Sporing af bispecifik antistofinduceret T-cellehandel ved hjælp af luciferase-transducerede humane T-celler

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Denne metode giver brugerne mulighed for nemt at spore T-celler in vivo for at evaluere kinetikken ved homing og overvåge T-cellepersistens. Den største fordel ved denne teknik er, at den kan gentages på flere tidspunkter på det samme dyr uden at kræve ofre i flowcytometri eller immunhistokemi. Denne teknik kan også ændres til sporing af andre typer immunceller.Til dyrkning af 293T-celler fremstilles en liter DMEM ved at tilsætte 110 ml varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 11 ml penicillin streptomycin. Optø fem gange 10 til de sjette 293T-celler og overfør dem til en T175-kolbe indeholdende DMEM. Opdel cellerne en til 10 hver tredje dag i seks dage, før cellerne bliver mere end 90% sammenflydende.Til transfektion overføres 1,5 ml medier til to 50 ml rør ved hjælp af en pipette. Til et rør tilsættes 10 mikrogram VSVG-plasmid, 20 mikrogram gag pol og 20 mikrogram klikbillerød TDtomato eller CBRTDR luciferase plasmid og blandes. Tilsæt 100 mikroliter DNA in vitro transfektionsreagens til et andet rør og bland.Inkuber begge rør ved stuetemperatur i fem minutter. Substratet indeholdende DNA in vitro transfektionsreagenset overføres dråbevis til røret indeholdende DNA-plasmiderne og blandes forsigtigt med en pipette. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.Under inkubation løsnes 293T-cellerne ved at tilsætte fem til 10 ml 0,05% trypsin. Når cellerne har løsnet sig, tilsættes 10 ml medier og centrifugeres ved 800 G i fem minutter. Resuspender cellerne i 1,5 ml medier.Tilsæt mediet indeholdende DNA in vitro transfektionsreagens og DNA-plasmiderne til 293T-cellerne og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Efter inkubation overføres suspensionen til en T175-kolbe. Tilsæt 18 ml medier og inkuber ved 37 grader Celsius natten over.Den næste dag skal du forsigtigt aspirere medierne med en glaspipette uden at løsne cellerne og erstatte den med 18 ml friske medier. Igen, inkubere natten over ved 37 grader Celsius. Den følgende dag fjernes virussupernatanten ved hjælp af en pipette, lægges på is og centrifugeres ved 800 G i fem minutter for at pelletere cellerne og snavsene.Den virale supernatant filtreres ved hjælp af et 0,22 mikron filter og lægges straks på is. Til in vitro-aktivering af humane T-celler tilsættes 10 ml PBS indeholdende 0,1% bovin serumalbumin eller BSA og to millimolær EDTA til et sterilt 15 ml rør. For at vaske perlerne skal du tilføje perler i et rør og placere røret i et magnetisk stativ.Efter to minutter fjernes PBS fra røret. Efter fremstilling af DMEM tilsættes vaskede perler og interleukin-2 eller IL-2 til en endelig koncentration på 30 internationale enheder pr. Milliliter. Tæl T-cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og Trypan-blå plet.Efter tælling tilsættes det ønskede antal T-celler til mediet og inverteres forsigtigt røret for at blande. Plade 2,5 ml medier indeholdende to millioner T-celler, perler og IL-2 i hver brønd i en 24-brønds vævskulturplade. Kultur ved 37 grader Celsius i befugtet 5% kuldioxid.Undersøg T-cellerne under et 20X-mål hver dag i tre dage for at bestemme, hvornår de skal transduceres med luciferase. Dernæst tilsættes to milliliter 20 mikrogram pr. milliliter RetroNectin i PBS til en brønd med en ubehandlet seksbrøndplade for at forberede en RetroNectin-plade for at forberede en RetroNectin-plade og inkuberes i to timer ved stuetemperatur. Opsug RetroNectin uden at ridse bunden af pladen, og tilsæt tre milliliter 2% BSA i PBS pr. Brønd i seksbrøndpladen.Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Dernæst aspireres BSA til spinokulation og vask brøndene en gang med tre ml PBS. Fortsæt eller udskift med frisk PBS, og lad pladen være dækket ved fire grader Celsius natten over.Den næste dag tilsættes to ml CBRTDR luciferase viral supernatant pr. Brønd og centrifugeres ved 1.240 G i 90 minutter ved 32 grader Celsius. Til transduktion aspireres den virale supernatant efter tælling af T-cellerne og plade to millioner T-celler pr. Brønd i seks ml DMEM indeholdende 30 internationale enheder pr. milliliter humant IL-2. Undersøg T-cellerne i to dage.Når cellerne er næsten sammenflydende, vaskes de forsigtigt af bunden af pladen med en pipette og overføres hvert hul til en separat T75-kolbe. Tilsæt ni ml medier til i alt 15 ml volumen pr. kolbe. Den næste dag tilsættes 15 ml medier og bekræfter vellykket transduktion ved at udføre flowcytometri.Efter bedøvelse af musen injiceres 20 millioner T-celler i 100 mikroliter medier retroorbitalt ved hjælp af en 26 gauge nål. Administrer 1.000 enheder rekombinant IL-2 subkutant for at understøtte T-celleoverlevelse in vivo. Administrer derefter det bispecifikke antistof retroorbitalt eller intraperitonealt.Til in vivo-billeddannelse administreres 100 mikroliter tre milligram D-luciferin ved retroorbital injektion med en 26 gauge nål i en bedøvet mus. For at tage billeder skal du placere musen i kameraets lystætte kammer, så flanken, der bærer xenograften, vender opad mod kameraet. Brug kontrolpanelet til anskaffelse til at vælge selvlysende, fotografi og overlejring.Indstil eksponeringstiden til auto, binning til medium og blændet til en, og hent billeder. Efter det første billede skal du indstille eksponeringstiden, så den svarer til den, der automatisk beregnes for det første billede, så efterfølgende billeder kan sammenlignes direkte. Tag et andet sæt billeder med musen liggende for at evaluere T-celle tilstedeværelse i lungerne.Bevæbnede T-celler handles hurtigere til tumoren end ubevæbnede T-celler, hvilket forlader lungerne to dage tidligere. Kvantificering af T-celleinfiltration i tumorer over tid blev målt ved bioluminescens og udtrykt som samlede flokke eller udstråling pr. pixel integreret over tumorkonturen. T-cellehandel kunne overvåges i 28 dage efter injektion af luciferase-transducerede T-celler, hvilket muliggør sporing af T-cellehoming og persistens under hele behandlingen.T-cellehandel til HER2-positive humane brystkræftpatientafledte xenotransplantater i DKO-mus vises. Behandling med det bispecifikke HER2-antistof med en ikke-tavs FC havde ingen effekt på tumorvækst sammenlignet med et kontrolleret bispecifikt antistof. I modsætning hertil var behandling med HER2 bispecifikt antistof indeholdende N297A-mutation alene eller i kombination med en K322A-mutation i stand til at standse tumorvækst fuldstændigt.For grupper med hæmningsmutationerne nåede T-celleluminescenssignalet en højere top på dag tre efter injektion og fortsatte på et højere niveau sammenlignet med det kontrollerede bispecifikke antistof og det ikke-tavse HER2 bispecifikke antistof. Mus, der bærer neuroblastom patientafledte xenotransplantater, viste udtømning af Ly6C-positive makrofager signifikant øget T-celle homing til tumorer, hvilket resulterede i nedsat tumorvækst og langvarig overlevelse. Effekten var mere udtalt i osteosarkom patientafledte xenotransplantater.Blandt bispecifikke antistoffer rettet mod tumorantigenet STEAP1 resulterede IGGL SCFV-formatet i signifikant mere T-celleinfiltration på dag seks efter den første dosis T-celler, som varede ved under behandlingen. Sådanne observationer blev ikke forudsagt ved in vitro cytotoksicitetsassays. Efter sporing af T-celler in vivo kan brugerne stadig udføre immunhistokemi for at bestemme mere specifikt, hvor T-cellerne er placeret i tumoren eller andre normale væv.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En Portal Vein Injection Model at studere levermetastaser af brystkræft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Four-Color Fluorescence Immunohistochemistry af T-Cell Subpopulations i Archival Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Billeddannelse af hjemmehørende CD8 T-lymfocytter i menneskelige lunge Tumor skiver bruger konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngeneic musen B-celle lymfom Model for præ-klinisk evaluering af CD19 bil T celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En klumpformet drab Assay af bil T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Forberedelse af Exosomes til siRNA levering til kræftceller

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Brug af CRISPR/Cas9 til at udskære GM-CSF i bil-T-celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fremstilling af Chimeric antigen receptor (bil) T-celler til adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolering og udvidelse af cytotoksiske cytokin-induceret Killer T Celler til kræftbehandling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...