Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

De auteurs willen Dr. Vladimir Ponomarev bedanken voor het delen van de luciferase-constructies die worden gebruikt in de experimenten die worden beschreven in de sectie representatieve resultaten van dit artikel.

De volgende procedures zijn geëvalueerd en goedgekeurd door memorial Sloan Kettering's Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Transfectie van 293T-cellen met luciferase en oogst van viraal supernatant
<ol><li>Kweek van 293T cellen<ol><li>Bereid media door het volgende toe te voegen aan een liter DMEM elk: 110 ml warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 11 ml penicilline-streptomycine.</li>
		<li>Ontdooi 5 x 106 293T cellen en breng ze over in een...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

Hoewel de T-BsAb blinatumomab is goedgekeurd voor CD19-positieve hematologische maligniteiten, is de succesvolle implementatie van T-BsAbs in solide tumoren veel moeilijker gebleken. Catumaxomab, een T-BsAb gericht tegen epitheliale celadhesiemolecuul (EPCAM), werd goedgekeurd voor de behandeling van kwaadaardige ascites bij patiënten met eierstokkanker, maar de productie van het geneesmiddel werd vervolgens om commerciële redenen stopgezet19. Er zijn geen andere T-BsAbs goedgekeurd voor solide ...

T-cel-engaging bispecifieke antilichamen (T-BsAbs) zijn gemanipuleerde antilichamen die worden gebruikt om kunstmatige specificiteit te bieden aan polyklonale T-cellen door T-cellen aan te spreken via de ene bindingsarm en een tumorantigeen via een andere bindingsarm. Deze technologie is met succes toegepast op hematologische kankers (CD19-targeting blinatumomab1), en talrijke T-BsAbs zijn in preklinische en klinische ontwikkeling voor een verscheidenheid aan solide tumoren en2. T-BsAbs betrekken polyklonale T-cellen op een belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC) -onafhankelijke manier, en daarom zijn zelfs tumoren die menselijke leukocytenantigenen (HLA's) downreguleren vatbaar voor dit type therapie 3,4. T-BsAbs zijn ontwikkeld in tientallen verschillende formaten, met verschillen in de valentie en ruimtelijke rangschikking van de T-cel en tumorbindende armen, interdomeinafstanden en de opname van een Fc-domein, dat de halfwaardetijd beïnvloedt en effectorfuncties kan induceren indien aanwezig5. Eerder werk in ons laboratorium heeft aangetoond dat deze factoren de anti-tumor werkzaamheid van T-BsAbs aanzienlijk beïnvloeden, met tot 1.000-voudige verschillen in potentie6. Door dit werk hebben we het IgG-[L]-scFv-formaat geïdentificeerd als het ideale platform voor T-BsAbs (zie de sectie Representatieve resultaten voor meer informatie over T-BsAb-formaten) en hebben we dit platform toegepast op doelen zoals GD2 (neuroblastoom), HER2 (borstkanker en osteosarcoom), GPA33 (colorectale kanker), STEAP1 (Ewing-sarcoom), CD19 (B-cel maligniteiten) en CD33 (B-cel maligniteiten)7, 8,9,10,11,12,13.
Een van de grootste uitdagingen voor het succesvol implementeren van T-BsAb-therapie in solide tumoren is het overwinnen van een immunosuppressieve tumormicro-omgeving (TME) om T-celhandel naar tumoren te drijven14. De hierboven beschreven factoren die de werkzaamheid van T-BsAb beïnvloeden, hebben een significante invloed op het vermogen van T-BsAbs om effectief T-cel homing aan tumoren te induceren, maar dit effect is moeilijk te evalueren in een in vivo systeem in realtime. Dit manuscript geeft een gedetailleerde beschrijving van het gebruik van luciferase-getransduceerde T-cellen in preklinische studies van T-BsAbs om T-celhandel naar verschillende weefsels in experimentele immuungecompromitteerde muismodellen tijdens de behandeling te evalueren. Het algemene doel van deze methode is om een middel te bieden om T-celinfiltratie in tumoren en andere weefsels te evalueren, evenals real-time inzicht in T-cel homing kinetiek en persistentie, zonder de noodzaak om dieren op te offeren tijdens de behandeling. Voor het toenemende aantal onderzoekers dat zich richt op cellulaire immunotherapieën, is het vermogen om T-cellen in vivo te volgen in preklinische diermodellen cruciaal. We streven ernaar een grondige, gedetailleerde beschrijving te geven van de methode die we hebben gebruikt voor het volgen van luciferase-getransduceerde T-cellen om andere onderzoekers in staat te stellen deze techniek gemakkelijk te repliceren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

T-cel-engaging bispecifieke antilichamen (T-BsAbs) bevinden zich in verschillende stadia van preklinische ontwikkeling en klinische testen voor solide tumoren. Factoren zoals valentie, ruimtelijke ordening, interdomeinafstand en Fc-mutaties beïnvloeden de anti-tumor werkzaamheid van deze therapieën, meestal door de homing van T-cellen naar tumoren te beïnvloeden, wat een grote uitdaging blijft. Hier beschrijven we een methode om geactiveerde menselijke T-cellen te transduceren met luciferase, waardoor in vivo tracking van T-cellen tijdens T-BsAb-therapiestudies mogelijk is. Het vermogen van T-BsAbs om T-cellen om te leiden naar tumoren kan kwantitatief worden geëvalueerd op meerdere tijdstippen tijdens de behandeling, waardoor onderzoekers de anti-tumor werkzaamheid van T-BsAbs en andere interventies kunnen correleren met de persistentie van T-cellen in tumoren. Deze methode verlicht de noodzaak om dieren tijdens de behandeling op te offeren om T-celinfiltratie histologisch te beoordelen en kan op meerdere tijdstippen worden herhaald om de kinetiek van T-celhandel tijdens en na de behandeling te bepalen.

Zoals beschreven in stap 4.3, kunnen muizen tijdens de beeldvorming in verschillende posities worden georiënteerd om de aanwezigheid van T-cellen in verschillende weefsels te evalueren. Liggende positionering maakt de beoordeling van T-cellen in de longen mogelijk, wat gebruikelijk is op vroege tijdstippen na injectie. Laterale positionering met de subcutane xenograft naar boven gericht wordt gebruikt om de handel van T-cellen naar de tumor het beste te beoordelen. Vrouwelijke C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Hier beschrijven we een methode voor het transduceren van menselijke T-cellen met luciferase om in vivo tracking van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel naar tumoren in studies te vergemakkelijken om de anti-tumor werkzaamheid en het mechanisme van T-cel-engaging bispecifieke antilichamen te evalueren.

Het volgen van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel met behulp van luciferase-getransduceerde menselijke T-cellen

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Met deze methode kunnen gebruikers eenvoudig T-cellen in vivo volgen om de kinetiek van homing te evalueren en de persistentie van T-cellen te controleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het op meerdere tijdstippen op hetzelfde dier kan worden herhaald zonder dat er offers nodig zijn in flowcytometrie of immunohistochemie. Deze techniek kan ook worden aangepast voor het volgen van andere soorten immuuncellen.Om 293T-cellen te kweken, bereidt u een liter DMEM voor door 110 milliliter warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 11 milliliter penicilline-streptomycine toe te voegen. Ontdooi vijf maal 10 tot de zesde 293T-cellen en breng ze over in een T175-kolf met DMEM. Splits de cellen één tot 10 om de drie dagen gedurende zes dagen voordat de cellen meer dan 90% confluent worden.Breng voor transfectie 1,5 milliliter media over naar twee buizen van 50 milliliter met behulp van een pipet. Voeg aan één buis 10 microgram VSVG-plasmide, 20 microgram gag pol en 20 microgram klikkever rode TDtomato of CBRTDR luciferaseplasmide toe en meng. Voeg 100 microliter DNA in vitro transfectiereagens toe aan een andere buis en meng.Incubeer beide buizen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng de media die het DNA in vitro transfectiereagens bevatten druppelsgewijs over naar de buis met de DNA-plasmiden en meng voorzichtig met een pipet. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Maak tijdens de incubatie de 293T-cellen los door vijf tot 10 milliliter 0,05% trypsine toe te voegen. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u 10 milliliter media toe en centrifugeert u gedurende vijf minuten op 800 G. Resuspendeer de cellen in 1,5 milliliter media.Voeg de media met het DNA in vitro transfectiereagens en de DNA-plasmiden toe aan de 293T-cellen en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Breng na incubatie de suspensie over in een T175-kolf. Voeg 18 milliliter media toe en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius.Zuig de media de volgende dag voorzichtig op met een glazen pipet zonder de cellen los te maken en vervang deze door 18 milliliter verse media. Nogmaals, incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Verwijder de volgende dag het virale supernatant met behulp van een pipet op ijs en centrifugeer gedurende vijf minuten op 800 G om de cellen en het puin te pelleteren.Filter het virale supernatant met een filter van 0,22 micron en plaats het onmiddellijk op ijs. Voeg voor in vitro activering van menselijke T-cellen 10 milliliter PBS met 0,1% runderserumalbumine of BSA en twee millimolaire EDTA toe aan een steriele buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens om de kralen te wassen kralen toe aan een buis en plaats de buis in een magnetisch rek.Verwijder na twee minuten de PBS uit de buis. Voeg na het bereiden van DMEM gewassen kralen en interleukine-2 of IL-2 toe aan een uiteindelijke concentratie van 30 internationale eenheden per milliliter. Tel de T-cellen met behulp van een hemocytometer en Trypan-blauwe vlek.Voeg na het tellen het gewenste aantal T-cellen toe aan de media en keer de buis voorzichtig om om te mengen. Plaat 2,5 milliliter media met twee miljoen T-cellen, kralen en IL-2 in elke put van een 24-well weefselkweekplaat. Kweek bij 37 graden Celsius in bevochtigd 5% koolstofdioxide.Onderzoek de T-cellen onder een 20X-doelstelling elke dag gedurende drie dagen om te bepalen wanneer te transduceren met luciferase. Voeg vervolgens, om een RetroNectine-plaat te bereiden, twee milliliter van 20 microgram per milliliter RetroNectin in PBS toe aan een put van een onbehandelde zesputplaat en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Zuig de RetroNectin aan zonder krassen op de bodem van de plaat en voeg drie milliliter 2% BSA in PBS per put toe aan de plaat met zes putjes.Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, voor spinoculatie, zuig de BSA op en was de putjes eenmaal met drie milliliter PBS. Ga door of vervang door verse PBS en laat de plaat een nacht afgedekt bij vier graden Celsius.Voeg de volgende dag twee milliliter CBRTDR luciferase viraal supernatant per put toe en centrifugeer op 1.240 G gedurende 90 minuten bij 32 graden Celsius. Voor transductie, na het tellen van de T-cellen, zuigt u het virale supernatant op en plaatst u twee miljoen T-cellen per put in zes milliliter DMEM met 30 internationale eenheden per milliliter menselijk IL-2. Onderzoek de T-cellen gedurende twee dagen.Wanneer de cellen bijna samenvloeien, spoelt u ze voorzichtig van de bodem van de plaat met behulp van een pipet en brengt u elk putje over in een aparte T75-kolf. Voeg negen milliliter media toe voor een totaal volume van 15 milliliter per kolf. Voeg de volgende dag 15 milliliter media toe en bevestig succesvolle transductie door flowcytometrie uit te voeren.Na het verdoven van de muis, met behulp van een naald van 26 gauge, injecteert u 20 miljoen T-cellen retroorbitaal in 100 microliter media. Dien 1.000 eenheden recombinant IL-2 subcutaan toe om de overleving van T-cellen in vivo te ondersteunen. Dien vervolgens het bispecifieke antilichaam retroorbitaal of intraperitoneaal toe.Voor in vivo beeldvorming, dien 100 microliter van drie milligram D-luciferine toe door retroorbitale injectie met een naald van 26 gauge in een verdoofde muis. Om beelden vast te leggen, plaatst u de muis in de lichtdichte kamer van de imager, zodat de flank met de xenograft naar boven naar de camera is gericht. Selecteer met behulp van het bedieningspaneel voor acquisitie lichtgevende, foto- en overlay.Stel de belichtingstijd in op automatisch, het binning op medium en f-stop op één en verkrijg afbeeldingen. Stel na de eerste afbeelding de belichtingstijd zo in dat deze overeenkomt met de automatisch berekende belichtingstijd voor de eerste afbeelding, zodat volgende afbeeldingen rechtstreeks kunnen worden vergeleken. Maak een andere reeks afbeeldingen met de muis in rugligging om de aanwezigheid van T-cellen in de longen te evalueren.Gewapende T-cellen smokkelden sneller naar de tumor dan ongewapende T-cellen, waardoor de longen twee dagen eerder werden verlaten. Kwantificering van T-celinfiltratie in tumoren in de loop van de tijd werd gemeten door bioluminescentie en uitgedrukt als totale koppels of uitstraling per pixel geïntegreerd over de tumorcontour. T-celhandel kon gedurende 28 dagen na injectie van de luciferase-getransduceerde T-cellen worden gevolgd, waardoor T-cel homing en persistentie tijdens de behandeling konden worden gevolgd.T-celhandel in HER2-positieve menselijke borstkankerpatiënt-afgeleide xenografts in DKO-muizen wordt getoond. Behandeling met het HER2 bispecifieke antilichaam met een niet-gedempt FC had geen effect op de tumorgroei in vergelijking met een gecontroleerd bispecifiek antilichaam. Daarentegen was behandeling met HER2 bispecifiek antilichaam met N297A-mutatie alleen of in combinatie met een K322A-mutatie in staat om de tumorgroei volledig te stoppen.Voor groepen met de uitschakelingsmutaties bereikte het T-cel luminescentiesignaal een hogere piek op dag drie na de injectie en bleef het op een hoger niveau in vergelijking met het gecontroleerde bispecifieke antilichaam en het niet-gesilenceerde HER2 bispecifieke antilichaam. Muizen met neuroblastoom patiënt-afgeleide xenografts toonden uitputting van Ly6C-positieve macrofagen significant verhoogde T-cel homing aan tumoren, wat resulteerde in verminderde tumorgroei en verlengde overleving. Het effect was meer uitgesproken bij osteosarcoom patiënt-afgeleide xenografts.Onder bispecifieke antilichamen gericht op het tumorantigeen STEAP1 resulteerde het IGGL SCFV-formaat in significant meer T-celinfiltratie op dag zes na de eerste dosis T-cellen die aanhield gedurende de duur van de behandeling. Dergelijke waarnemingen werden niet voorspeld door in vitro cytotoxiciteitstests. Na het volgen van T-cellen in vivo, kunnen gebruikers nog steeds immunohistochemie uitvoeren om specifieker te bepalen waar de T-cellen zich in de tumor of andere normale weefsels bevinden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Voorbereiding van Exosomes van siRNA levering aan kankercellen

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CRISPR/Cas9 gebruiken om GM-CSF uit te nemen in CAR-T-cellen

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolatie en uitbreiding van cytotoxische Cytokine-geïnduceerde Killer T-cellen voor kankerbehandeling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...