Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
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Les auteurs aimeraient remercier le Dr Vladimir Ponomarev d’avoir partagé les constructions de luciférase utilisées dans les expériences décrites dans la section des résultats représentatifs de cet article.

Les procédures suivantes ont été évaluées et approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Memorial Sloan Kettering.
1. Transfection de cellules 293T avec luciférase et récolte de surnageant viral
<ol><li>Culture de cellules 293T<ol><li>Préparer les milieux en ajoutant ce qui suit à un litre de DMEM chacun : 110 mL de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 11 mL de pénicilline-streptomycine.</li>
		<li>Décongeler ...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

Alors que le blinatumomab T-BsAb a été approuvé pour les hémopathies malignes CD19 positives, la mise en œuvre réussie des T-BsAbs dans les tumeurs solides s’est avérée beaucoup plus difficile. Le catumaxomab, un T-BsAb dirigé contre la molécule d’adhésion des cellules épithéliales (EPCAM), a été approuvé pour le traitement de l’ascite maligne chez les patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire, mais la production du médicament a ensuite été arrêtée pour des raisons commerciales<sup class=...

Les anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T (T-BsAbs) sont des anticorps modifiés utilisés pour fournir une spécificité artificielle aux lymphocytes T polyclonaux en engageant les lymphocytes T par un bras de liaison et un antigène tumoral par un autre bras de liaison. Cette technologie a été appliquée avec succès aux cancers hématologiques (blinatumomab1 ciblant CD19), et de nombreux T-BsAbs sont en développement préclinique et clinique pour une variété de tumeurs solides ainsi que2. Les T-BsAbs engagent les lymphocytes T polyclonaux d’une manière indépendante du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et, par conséquent, même les tumeurs qui régulent à la baisse les antigènes leucocytaires humains (HLA) sont sensibles à ce type de thérapie 3,4. Les T-BsAbs ont été développés dans des dizaines de formats différents, avec des différences dans la valence et la disposition spatiale des bras de liaison aux cellules T et aux tumeurs, les distances interdomaines et l’inclusion d’un domaine Fc, qui affecte la demi-vie et peut induire des fonctions effectrices si présent5. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire ont montré que ces facteurs affectent de manière significative l’efficacité antitumorale des T-BsAbs, avec des différences de puissance allant jusqu’à 1 000 fois6. Grâce à ce travail, nous avons identifié le format IgG-[L]-scFv comme la plateforme idéale pour les T-BsAbs (voir la section Résultats représentatifs pour plus de détails sur les formats T-BsAb), et nous avons appliqué cette plateforme à des cibles telles que GD2 (neuroblastome), HER2 (cancer du sein et ostéosarcome), GPA33 (cancer colorectal), STEAP1 (sarcome d’Ewing), CD19 (tumeurs malignes à cellules B) et CD33 (tumeurs malignes à cellules B)7. 8,9,10,11,12,13.
L’un des principaux défis pour réussir la mise en œuvre de la thérapie T-BsAb dans les tumeurs solides est de surmonter un microenvironnement tumoral immunosuppresseur (TME) pour conduire le trafic des lymphocytes T aux tumeurs14. Les facteurs affectant l’efficacité des T-BsAb décrits ci-dessus ont un impact significatif sur la capacité des T-BsAbs à induire efficacement le homing des lymphocytes T vers les tumeurs, mais cet effet est difficile à évaluer dans un système in vivo en temps réel. Ce manuscrit fournit une description détaillée de l’utilisation des lymphocytes T transduits par la luciférase dans les études précliniques des T-BsAbs pour évaluer le trafic des lymphocytes T vers divers tissus dans des modèles expérimentaux de souris immunodéprimées pendant le traitement. L’objectif global de cette méthode est de fournir un moyen d’évaluer l’infiltration des lymphocytes T dans les tumeurs et autres tissus, ainsi qu’un aperçu en temps réel de la cinétique et de la persistance de la localisation des lymphocytes T, sans avoir besoin de sacrifier des animaux pendant le traitement. Pour le nombre croissant de chercheurs qui se concentrent sur les immunothérapies cellulaires, la capacité de suivre les lymphocytes T in vivo dans des modèles animaux précliniques est cruciale. Notre objectif est de fournir une description complète et détaillée de la méthode que nous avons utilisée pour suivre les lymphocytes T transduits par la luciférase afin de permettre à d’autres chercheurs de reproduire facilement cette technique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

Les anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T (T-BsAbs) sont à différents stades de développement préclinique et d’essais cliniques pour les tumeurs solides. Des facteurs tels que la valence, l’arrangement spatial, la distance interdomaine et les mutations Fc affectent l’efficacité antitumorale de ces thérapies, généralement en influençant le ralliement des lymphocytes T aux tumeurs, ce qui reste un défi majeur. Ici, nous décrivons une méthode pour transduire les cellules T humaines activées avec la luciférase, permettant le suivi in vivo des cellules T pendant les études de thérapie T-BsAb. La capacité des T-BsAbs à rediriger les cellules T vers les tumeurs peut être évaluée quantitativement à plusieurs moments du traitement, ce qui permet aux chercheurs de corréler l’efficacité antitumorale des T-BsAbs et d’autres interventions avec la persistance des cellules T dans les tumeurs. Cette méthode atténue la nécessité de sacrifier des animaux pendant le traitement pour évaluer histologiquement l’infiltration des lymphocytes T et peut être répétée à plusieurs moments pour déterminer la cinétique du trafic des lymphocytes T pendant et après le traitement.

Comme décrit à l’étape 4.3, les souris peuvent être orientées dans différentes positions pendant l’imagerie pour évaluer la présence de lymphocytes T dans différents tissus. Le positionnement en décubitus dorsal permet d’évaluer les lymphocytes T dans les poumons, ce qui est courant aux premiers moments après l’injection. Le positionnement latéral avec la xénogreffe sous-cutanée tournée vers le haut est utilisé pour évaluer au mieux le trafic des lymphocytes T vers la tumeur. Des souris femelles...

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Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Ici, nous décrivons une méthode de transduction des lymphocytes T humains avec de la luciférase pour faciliter le suivi in vivo du trafic de lymphocytes T induit par les anticorps bispécifiques vers les tumeurs dans des études visant à évaluer l’efficacité antitumorale et le mécanisme des anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T.

Suivi du trafic de lymphocytes T induits par des anticorps bispécifiques à l’aide de lymphocytes T humains transduits par la luciférase

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Cette méthode permet aux utilisateurs de suivre facilement les lymphocytes T in vivo afin d’évaluer la cinétique du homing et de surveiller la persistance des lymphocytes T. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être répétée à plusieurs moments sur le même animal sans nécessiter de sacrifice en cytométrie de flux ou en immunohistochimie. Cette technique pourrait également être modifiée pour suivre d’autres types de cellules immunitaires.Pour cultiver des cellules 293T, préparez un litre de DMEM en ajoutant 110 millilitres de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 11 millilitres de streptomycine pénicilline. Décongeler cinq fois 10 à la sixième cellule 293T et les transférer dans une fiole T175 contenant du DMEM. Divisez les cellules une à 10 tous les trois jours pendant six jours avant que les cellules ne deviennent confluentes à plus de 90%.Pour la transfection, transférer 1,5 millilitre de média dans deux tubes de 50 millilitres à l’aide d’une pipette. Dans un tube, ajouter 10 microgrammes de plasmide VSVG, 20 microgrammes de pol bâillon et 20 microgrammes de TDtomate rouge de cliquetère ou de plasmide luciférase CBRTDR et mélanger. Ajouter 100 microlitres de réactif de transfection in vitro d’ADN dans un autre tube et mélanger.Incuber les deux tubes à température ambiante pendant cinq minutes. Transférer goutte à goutte le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN dans le tube contenant les plasmides d’ADN et mélanger doucement à l’aide d’une pipette. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes.Pendant l’incubation, détacher les cellules 293T en ajoutant cinq à 10 millilitres de trypsine à 0,05%. Une fois les cellules détachées, ajoutez 10 millilitres de média et centrifugez à 800 G pendant cinq minutes. Remettez les cellules en suspension dans 1,5 millilitre de média.Ajouter le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN et les plasmides d’ADN aux cellules 293T et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après incubation, transférer la suspension dans une fiole T175. Ajouter 18 millilitres de média et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, aspirez soigneusement le média avec une pipette en verre sans détacher les cellules et remplacez-le par 18 millilitres de média frais. Encore une fois, incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, retirer le surnageant viral à l’aide d’une pipette placée sur de la glace et centrifuger à 800 G pendant cinq minutes pour enduire les cellules et les débris.Filtrez le surnageant viral à l’aide d’un filtre de 0,22 micron et placez-le immédiatement sur de la glace. Pour l’activation in vitro des lymphocytes T humains, ajoutez 10 millilitres de PBS contenant 0,1% d’albumine sérique bovine ou BSA et deux EDTA millimolaires dans un tube stérile de 15 millilitres. Ensuite, pour laver les perles, ajoutez des perles dans un tube et placez le tube dans une grille magnétique.Après deux minutes, retirez le PBS du tube. Après avoir préparé DMEM, ajouter des billes lavées et de l’interleukine-2 ou de l’IL-2 à une concentration finale de 30 unités internationales par millilitre. Comptez les cellules T à l’aide d’un cytomètre hémologique et d’une coloration bleue de trypan.Après le comptage, ajoutez le nombre souhaité de lymphocytes T dans le milieu et inversez doucement le tube pour mélanger. Plaque de 2,5 millilitres de milieu contenant deux millions de lymphocytes T, des billes et de l’IL-2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Culture à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone humidifié à 5%.Examinez les lymphocytes T sous un objectif 20X tous les jours pendant trois jours pour déterminer quand transduire avec la luciférase. Ensuite, pour préparer une plaque de rétroNectine, ajoutez deux millilitres de 20 microgrammes par millilitre de rétroNectine dans du PBS à un puits d’une plaque à six puits non traitée et incuber pendant deux heures à température ambiante. Aspirez la RetroNectin sans rayer le fond de la plaque et ajoutez trois millilitres de 2% BSA dans PBS par puits dans la plaque de six puits.Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, pour la spinoculation, aspirez le BSA et lavez les puits une fois avec trois millilitres de PBS. Continuer ou remplacer par du PBS frais et laisser la plaque couverte à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, ajouter deux millilitres de surnageant viral CBRTDR luciférase par puits et centrifuger à 1 240 G pendant 90 minutes à 32 degrés Celsius. Pour la transduction, après avoir compté les cellules T, aspirer le surnageant viral et plaquer deux millions de cellules T par puits dans six millilitres de DMEM contenant 30 unités internationales par millilitre d’IL-2 humaine. Examinez les lymphocytes T pendant deux jours.Lorsque les cellules sont presque confluentes, les laver délicatement du fond de la plaque à l’aide d’une pipette et transférer chaque puits dans une fiole T75 séparée. Ajouter neuf millilitres de média pour un volume total de 15 millilitres par fiole. Le lendemain, ajoutez 15 millilitres de milieu et confirmez la réussite de la transduction en effectuant une cytométrie en flux.Après avoir anesthésié la souris, à l’aide d’une aiguille de calibre 26, injecter rétroorbitalement 20 millions de lymphocytes T dans 100 microlitres de média. Administrer 1 000 unités d’IL-2 recombinante par voie sous-cutanée pour soutenir la survie des lymphocytes T in vivo. Ensuite, administrer l’anticorps bispécifique rétroorbitalement ou intrapéritonéale.Pour l’imagerie in vivo, administrer 100 microlitres de trois milligrammes de D-luciférine par injection rétroorbitale avec une aiguille de calibre 26 dans une souris anesthésiée. Pour capturer des images, placez la souris dans la chambre étanche à la lumière de l’imageur de sorte que le flanc portant la xénogreffe soit orienté vers le haut vers la caméra. À l’aide du panneau de contrôle d’acquisition, sélectionnez luminescent, photographie et superposition.Réglez le temps d’exposition sur auto, le binning sur moyen et f-stop sur un et acquérir des images. Après la première image, définissez le temps d’exposition pour qu’il corresponde à celui calculé automatiquement pour la première image afin que les images suivantes puissent être comparées directement. Prenez une autre série d’images avec la souris en décubitus dorsal pour évaluer la présence de lymphocytes T dans les poumons.Les lymphocytes T armés ont trafiqué vers la tumeur plus rapidement que les lymphocytes T non armés, quittant les poumons deux jours plus tôt. La quantification de l’infiltration des lymphocytes T dans les tumeurs au fil du temps a été mesurée par bioluminescence et exprimée en troupeaux totaux ou en radiance par pixel intégré sur le contour tumoral. Le trafic des lymphocytes T a pu être surveillé pendant 28 jours après l’injection des lymphocytes T transduits par la luciférase, ce qui a permis de suivre l’homing et la persistance des lymphocytes T tout au long du traitement.Le trafic des lymphocytes T dans les xénogreffes de patients atteints de cancer du sein humain HER2 positifs chez des souris DKO est montré. Le traitement par l’anticorps bispécifique HER2 avec un FC non silencieux n’a eu aucun effet sur la croissance tumorale par rapport à un anticorps bispécifique contrôlé. En revanche, le traitement avec un anticorps bispécifique HER2 contenant la mutation N297A seul ou en combinaison avec une mutation K322A a permis d’arrêter complètement la croissance tumorale.Pour les groupes présentant les mutations silençantes, le signal de luminescence des lymphocytes T a atteint un pic plus élevé le troisième jour après l’injection et a persisté à un niveau plus élevé que l’anticorps bispécifique contrôlé et l’anticorps bispécifique HER2 non silencieux. Les souris portant des xénogreffes dérivées de patients atteints de neuroblastome ont démontré que l’épuisement des macrophages positifs au Ly6C augmentait significativement le homing des lymphocytes T vers les tumeurs, entraînant une diminution de la croissance tumorale et une survie prolongée. L’effet était plus prononcé dans les xénogreffes dérivées de patients atteints d’ostéosarcome.Parmi les anticorps bispécifiques ciblant l’antigène tumoral STEAP1, le format IGGL SCFV a entraîné une infiltration significativement plus importante des lymphocytes T le sixième jour après la première dose de lymphocytes T qui a persisté pendant toute la durée du traitement. De telles observations n’ont pas été prédites par des essais de cytotoxicité in vitro. Après avoir suivi les cellules T in vivo, les utilisateurs peuvent toujours effectuer une immunohistochimie pour déterminer plus précisément où les cellules T sont situées dans la tumeur ou d’autres tissus normaux.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Une injection Modèle Portal Vein pour étudier le foie Métastases du cancer du sein

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

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Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Immunohistochimie à fluorescence à quatre couleurs des sous-populations de lymphocytes T dans des échantillons de carcinome épidermique humain ou opharyngé humain fixé à la formaline, à base de formaline

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modèle de lymphome de B-cellule souris syngénique pour évaluation préclinique des cellules de T de voiture CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Préparation des Exosomes des siARN livraison aux cellules cancéreuses

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer gm-CSF dans les cellules CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolement et expansion des cellules T tueuses cytotoxiques induites par Cytokine pour le traitement du cancer

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...