Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
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Die Autoren danken Dr. Vladimir Ponomarev für die Bereitstellung der Luciferase-Konstrukte, die in den Experimenten verwendet wurden, die im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" dieses Artikels beschrieben sind.

Die folgenden Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Memorial Sloan Kettering bewertet und genehmigt.
1. Transfektion von 293T-Zellen mit Luciferase und Entnahme des viralen Überstands
<ol><li>Kultur von 293T-Zellen<ol><li>Bereiten Sie das Medium vor, indem Sie jeweils einem Liter DMEM Folgendes hinzufügen: 110 ml hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FBS), 11 ml Penicillin-Streptomycin.</li>
		<li>5 x 106 293T-Zellen auftauen u...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

Während das T-BsAb Blinatumomab für CD19-positive hämatologische Malignome zugelassen ist, hat sich die erfolgreiche Implementierung von T-BsAbs bei soliden Tumoren als deutlich schwieriger erwiesen. Catumaxomab, ein T-BsAb, das gegen das Epithelzelladhäsionsmolekül (EPCAM) gerichtet ist, wurde für die Behandlung von malignem Aszites bei Patientinnen mit Eierstockkrebs zugelassen, die Produktion des Medikaments wurde jedoch aus kommerziellen Gründen gestoppt19. Für solide Tumore sind keine...

T-Zell-aktivierende bispezifische Antikörper (T-BsAbs) sind technisch hergestellte Antikörper, die verwendet werden, um polyklonalen T-Zellen eine künstliche Spezifität zu verleihen, indem T-Zellen durch einen Bindungsarm und ein Tumorantigen durch einen anderen Bindungsarm angegriffen werden. Diese Technologie wurde erfolgreich bei hämatologischen Krebserkrankungen eingesetzt (CD19-gerichtetes Blinatumomab1), und zahlreiche T-BsAbs befinden sich auch für eine Vielzahl solider Tumore in der präklinischen und klinischen Entwicklung2. T-BsAbs binden polyklonale T-Zellen auf eine vom Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) unabhängige Weise, und daher sind auch Tumore, die humane Leukozytenantigene (HLAs) herunterregulieren, für diese Artder Therapie anfällig 3,4. T-BsAbs wurden in Dutzenden von verschiedenen Formaten entwickelt, mit Unterschieden in der Wertigkeit und räumlichen Anordnung der T-Zell- und Tumorbindungsarme, den Interdomänenabständen und dem Einschluss einer Fc-Domäne, die die Halbwertszeit beeinflusst und Effektorfunktionen induzieren kann, falls vorhanden5. Frühere Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass diese Faktoren die Anti-Tumor-Wirksamkeit von T-BsAbs signifikant beeinflussen, mit bis zu 1.000-fachen Unterschieden in der Potenz6. Durch diese Arbeit haben wir das IgG-[L]-scFv-Format als ideale Plattform für T-BsAbs identifiziert (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse für weitere Details zu T-BsAb-Formaten) und haben diese Plattform auf Ziele wie GD2 (Neuroblastom), HER2 (Brustkrebs und Osteosarkom), GPA33 (Darmkrebs), STEAP1 (Ewing-Sarkom), CD19 (B-Zell-Malignome) und CD33 (B-Zell-Malignome) angewendet7. 8,9,10,11,12,13.
Eine der größten Herausforderungen bei der erfolgreichen Implementierung der T-BsAb-Therapie bei soliden Tumoren ist die Überwindung einer immunsuppressiven Tumormikroumgebung (TME), die den Transport von T-Zellen zu Tumoren fördert14. Die oben beschriebenen Faktoren, die die Wirksamkeit von T-BsAb beeinflussen, haben einen signifikanten Einfluss auf die Fähigkeit von T-BsAbs, T-Zell-Homing zu Tumoren effektiv zu induzieren, aber dieser Effekt ist in einem In-vivo-System in Echtzeit schwer zu bewerten. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Beschreibung der Verwendung von Luciferase-transduzierten T-Zellen in präklinischen Studien mit T-BsAbs zur Bewertung des T-Zell-Transports in verschiedene Gewebe in experimentellen immungeschwächten Mausmodellen während der Behandlung. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Mittel zur Bewertung der T-Zell-Infiltration in Tumoren und anderen Geweben sowie einen Echtzeit-Einblick in die Kinetik und Persistenz von T-Zellen zu erhalten, ohne dass Tiere während der Behandlung geopfert werden müssen. Für die zunehmende Zahl von Forschern, die sich auf zelluläre Immuntherapien konzentrieren, ist die Fähigkeit, T-Zellen in vivo in präklinischen Tiermodellen zu verfolgen, von entscheidender Bedeutung. Unser Ziel ist es, eine gründliche, detaillierte Beschreibung der Methode zu liefern, die wir zur Verfolgung von Luciferase-transduzierten T-Zellen verwendet haben, damit andere Forscher diese Technik leicht replizieren können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

T-Zell-bindende bispezifische Antikörper (T-BsAbs) befinden sich in verschiedenen Stadien der präklinischen Entwicklung und klinischen Erprobung solider Tumore. Faktoren wie Valenz, räumliche Anordnung, Interdomänendistanz und Fc-Mutationen beeinflussen die Anti-Tumor-Wirksamkeit dieser Therapien, in der Regel durch die Beeinflussung des Homings von T-Zellen zu Tumoren, was nach wie vor eine große Herausforderung darstellt. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Transduktion aktivierter humaner T-Zellen mit Luciferase, die es ermöglicht, in vivo T-Zellen während T-BsAb-Therapiestudien zu verfolgen. Die Fähigkeit von T-BsAbs, T-Zellen zu Tumoren umzuleiten, kann zu mehreren Zeitpunkten während der Behandlung quantitativ bewertet werden, was es den Forschern ermöglicht, die Anti-Tumor-Wirksamkeit von T-BsAbs und anderen Interventionen mit der Persistenz von T-Zellen in Tumoren zu korrelieren. Diese Methode verringert die Notwendigkeit, Tiere während der Behandlung zu opfern, um die T-Zell-Infiltration histologisch zu beurteilen, und kann zu mehreren Zeitpunkten wiederholt werden, um die Kinetik des T-Zell-Transports während und nach der Behandlung zu bestimmen.

Wie in Schritt 4.3 beschrieben, können Mäuse während der Bildgebung in verschiedenen Positionen orientiert werden, um das Vorhandensein von T-Zellen in verschiedenen Geweben zu beurteilen. Die Lagerung in Rückenlage ermöglicht die Beurteilung von T-Zellen in der Lunge, was zu frühen Zeitpunkten nach der Injektion üblich ist. Die laterale Positionierung mit dem subkutanen Xenotransplantat nach oben wird verwendet, um den T-Zelltransport zum Tumor am besten zu beurteilen. Für alle in diesem Manuskript beschriebenen...

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Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Transduktion von humanen T-Zellen mit Luciferase, um die in vivo Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports zu Tumoren in Studien zur Evaluierung der Anti-Tumor-Wirksamkeit und des Mechanismus von T-Zell-bindenden bispezifischen Antikörpern zu ermöglichen.

Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports mit Luciferase-transduzierten menschlichen T-Zellen

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Diese Methode ermöglicht es Anwendern, T-Zellen einfach in vivo zu verfolgen, um die Kinetik des Homings zu bewerten und die Persistenz von T-Zellen zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zu mehreren Zeitpunkten am selben Tier wiederholt werden kann, ohne dass Abstriche bei der Durchflusszytometrie oder Immunhistochemie erforderlich sind. Diese Technik könnte modifiziert werden, um auch andere Arten von Immunzellen zu verfolgen.Um 293T-Zellen zu kultivieren, bereiten Sie einen Liter DMEM vor, indem Sie 110 Milliliter hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum und 11 Milliliter Penicillin-Streptomycin hinzufügen. Tauen Sie fünfmal 10 bis zu den sechsten 293T-Zellen auf und überführen Sie sie in einen T175-Kolben, der DMEM enthält. Teilen Sie die Zellen sechs Tage lang alle drei Tage um eins bis 10, bevor die Zellen zu mehr als 90 % zusammenfließen.Für die Transfektion werden 1,5 Milliliter Medien mit einer Pipette in zwei 50-Milliliter-Röhrchen überführt. In ein Röhrchen 10 Mikrogramm VSVG-Plasmid, 20 Mikrogramm Knebelpol und 20 Mikrogramm Schnellkäfer-Rot-TDtomato oder CBRTDR-Luciferase-Plasmid geben und mischen. Geben Sie 100 Mikroliter DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz in ein anderes Röhrchen und mischen Sie.Inkubieren Sie beide Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Das Medium mit dem DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz wird tropfenweise in das Röhrchen mit den DNA-Plasmiden überführt und vorsichtig mit einer Pipette vermischt. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Während der Inkubation werden die 293T-Zellen durch Zugabe von fünf bis 10 Millilitern 0,05%igem Trypsin abgetrennt. Sobald sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie 10 Milliliter Medien hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 800 G. Resuspendieren Sie die Zellen in 1,5 Millilitern Medien.Geben Sie das Medium mit dem DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz und den DNA-Plasmiden zu den 293T-Zellen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird die Suspension in einen T175-Kolben überführt. 18 Milliliter Medien zugeben und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Glaspipette ab, ohne die Zellen zu lösen, und ersetzen Sie es durch 18 Milliliter frisches Medium. Auch hier über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie am nächsten Tag den Virusüberstand mit einer Pipette, legen Sie sie auf Eis und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 800 G, um die Zellen und Trümmer zu pelletieren.Filtern Sie den viralen Überstand mit einem 0,22-Mikron-Filter und legen Sie ihn sofort auf Eis. Für die In-vitro-Aktivierung menschlicher T-Zellen werden 10 Milliliter PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin oder BSA und zwei Millimolaren EDTA in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen gegeben. Um die Perlen zu waschen, geben Sie die Perlen in ein Röhrchen und legen Sie das Röhrchen in ein Magnetgestell.Entfernen Sie das PBS nach zwei Minuten aus dem Röhrchen. Nach der Herstellung von DMEM werden gewaschene Kügelchen und Interleukin-2 oder IL-2 zu einer Endkonzentration von 30 internationalen Einheiten pro Milliliter hinzugefügt. Zählen Sie die T-Zellen mit einem Hämozytometer und einer Trypanblaufärbung.Geben Sie nach dem Zählen die gewünschte Anzahl von T-Zellen in das Medium und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um es zu mischen. Platte 2,5 Milliliter Medien mit zwei Millionen T-Zellen, Beads und IL-2 in jeder Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Kultur bei 37 Grad Celsius in befeuchtetem 5%igem Kohlendioxid.Untersuchen Sie die T-Zellen drei Tage lang täglich unter einem 20X-Objektiv, um zu bestimmen, wann sie mit Luciferase transduzieren müssen. Um eine RetroNektin-Platte herzustellen, geben Sie als Nächstes zwei Milliliter 20 Mikrogramm pro Milliliter RetroNektin in PBS in eine Vertiefung einer unbehandelten Sechs-Well-Platte und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das RetroNectin, ohne den Boden der Platte zu zerkratzen, und fügen Sie drei Milliliter 2 % BSA in PBS pro Vertiefung in die Sechs-Well-Platte hinzu.30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes saugen Sie für die Spinokulation die BSA ab und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit drei Millilitern PBS. Fahren Sie fort oder ersetzen Sie es durch frisches PBS und lassen Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius abgedeckt stehen.Am nächsten Tag zwei Milliliter CBRTDR-Luciferase-Virusüberstand pro Vertiefung hinzufügen und 90 Minuten lang bei 32 Grad Celsius bei 1.240 g zentrifugieren. Für die Transduktion wird nach der Zählung der T-Zellen der virale Überstand abgesaugt und zwei Millionen T-Zellen pro Well in sechs Milliliter DMEM mit 30 internationalen Einheiten pro Milliliter menschlichem IL-2 geplättet. Untersuchen Sie die T-Zellen zwei Tage lang.Wenn die Zellen fast konfluieren, waschen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette vom Boden der Platte ab und geben Sie jede Vertiefung in einen separaten T75-Kolben. Fügen Sie neun Milliliter Medien hinzu, um insgesamt 15 Milliliter Volumen pro Kolben zu erhalten. Fügen Sie am nächsten Tag 15 Milliliter Medium hinzu und bestätigen Sie die erfolgreiche Transduktion durch Durchflusszytometrie.Nachdem die Maus mit einer 26-Gauge-Nadel betäubt wurde, injizieren Sie retroorbital 20 Millionen T-Zellen in 100 Mikroliter Medien. Verabreichen Sie 1.000 Einheiten rekombinantes IL-2 subkutan, um das Überleben der T-Zellen in vivo zu unterstützen. Anschließend wird der bispezifische Antikörper retroorbital oder intraperitoneal verabreicht.Für die In-vivo-Bildgebung werden 100 Mikroliter von drei Milligramm D-Luciferin durch retroorbitale Injektion mit einer 26-Gauge-Nadel in eine anästhesierte Maus verabreicht. Um Bilder aufzunehmen, platzieren Sie die Maus so in der lichtdichten Kammer des Imagers, dass die Flanke mit dem Xenotransplantat nach oben zur Kamera zeigt. Wählen Sie in der Erfassungssteuerung die Optionen "Lumineszierend", "Foto" und "Überlagern" aus.Stellen Sie die Belichtungszeit auf automatisch, das Binning auf mittel und die Blende auf eins ein und nehmen Sie Bilder auf. Stellen Sie nach dem ersten Bild die Belichtungszeit so ein, dass sie mit der für das erste Bild automatisch berechneten Zeit übereinstimmt, so dass nachfolgende Bilder direkt verglichen werden können. Machen Sie eine weitere Reihe von Bildern mit der Maus in Rückenlage, um das Vorhandensein von T-Zellen in der Lunge zu bewerten.Bewaffnete T-Zellen schleusten schneller in den Tumor ein als unbewaffnete T-Zellen und verließen die Lunge zwei Tage früher. Die Quantifizierung der T-Zell-Infiltration in Tumore über die Zeit wurde mittels Biolumineszenz gemessen und als Gesamtflocken oder Strahldichte pro Pixel ausgedrückt, die über die Tumorkontur integriert sind. Der T-Zell-Transport konnte 28 Tage nach der Injektion der Luciferase-transduzierten T-Zellen überwacht werden, so dass das Homing und die Persistenz der T-Zellen während der gesamten Behandlung verfolgt werden konnten.Es wird gezeigt, wie T-Zellen in HER2-positive menschliche Brustkrebspatientinnen mit Xenotransplantaten in DKO-Mäusen transportiert werden. Die Behandlung mit dem bispezifischen HER2-Antikörper mit einem nicht silenced FC hatte im Vergleich zu einem kontrollierten bispezifischen Antikörper keinen Einfluss auf das Tumorwachstum. Im Gegensatz dazu konnte die Behandlung mit bispezifischen HER2-Antikörpern mit N297A-Mutation allein oder in Kombination mit einer K322A-Mutation das Tumorwachstum vollständig stoppen.Bei Gruppen mit den Silencing-Mutationen erreichte das T-Zell-Lumineszenzsignal am dritten Tag nach der Injektion einen höheren Höhepunkt und persistierte auf einem höheren Niveau als der kontrollierte bispezifische Antikörper und der nicht stummgeschaltete bispezifische HER2-Antikörper. Mäuse mit Xenotransplantaten von Neuroblastom-Patienten zeigten, dass die Depletion von Ly6C-positiven Makrophagen das Homing von T-Zellen zu Tumoren signifikant erhöhte, was zu einem verringerten Tumorwachstum und einem verlängerten Überleben führte. Der Effekt war bei Xenotransplantaten von Osteosarkompatienten ausgeprägter.Unter den bispezifischen Antikörpern, die gegen das Tumorantigen STEAP1 gerichtet sind, führte das IGGL-SCFV-Format zu einer signifikant höheren T-Zell-Infiltration am sechsten Tag nach der ersten Dosis von T-Zellen, die für die Dauer der Behandlung anhielt. Solche Beobachtungen wurden durch In-vitro-Zytotoxizitätsassays nicht vorhergesagt. Nach der Nachverfolgung von T-Zellen in vivo können Anwender immer noch eine Immunhistochemie durchführen, um genauer zu bestimmen, wo sich die T-Zellen im Tumor oder in anderen normalen Geweben befinden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Forschung

Krebsforschung

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Ein Phänomen B-Zell-Lymphom Mausmodell für präklinische Bewertung von CD19-Auto-T-Zellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Vorbereitung der Exosomen SiRNA Lieferung an Krebszellen

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolierung und Erweiterung zytotoxischer Cytokin-induzierter Killer-T-Zellen zur Krebsbehandlung

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...