Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לד"ר ולדימיר פונומרב על שיתוף מבני הלוציפראז המשמשים בניסויים המתוארים בסעיף התוצאות המייצגות במאמר זה.

ההליכים הבאים הוערכו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של Memorial Sloan Kettering.
1. טרנספקציה של תאי 293T עם לוציפראז וקציר של supernatant ויראלי
<ol><li>תרבית של 293T תאים<ol><li>הכן מדיה על ידי הוספת הדברים הבאים לליטר DMEM כל אחד: 110 מ"ל של סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 11 ?...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

בעוד T-BsAb blinatumomab אושר עבור ממאירויות המטולוגיות חיוביות CD19, היישום המוצלח של T-BsAbs בגידולים מוצקים הוכח הרבה יותר קשה. Catumaxomab, T-BsAb המכוון נגד מולקולת הידבקות תאי אפיתל (EPCAM), אושר לטיפול במיימת ממאירה בחולות סרטן השחלות, אך ייצור התרופה הופסק לאחר מכן מסיבות מסחריות19. T-BsAbs אחרים ל?...

נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T (T-BsAbs) הם נוגדנים מהונדסים המשמשים למתן ספציפיות מלאכותית לתאי T רב-שבטיים על ידי הפעלת תאי T דרך זרוע קשירה אחת ואנטיגן גידולי דרך זרוע קושרת אחרת. טכנולוגיה זו יושמה בהצלחה על סרטן המטולוגי (CD19-targeting blinatumomab1), ומספר רב של T-BsAbs נמצאים בפיתוח פרה-קליני וקליני עבור מגוון גידולים מוצקים כמו גם2. T-BsAbs מפעילים תאי T רב-שבטיים באופן בלתי תלוי בקומפלקס היסטו-תאימות (MHC), ולכן אפילו גידולים שמפחיתים את הרגולציה של אנטיגנים לויקוציטים אנושיים (HLAs) רגישים לסוג זה של טיפול 3,4. T-BsAbs פותחו בעשרות פורמטים שונים, עם הבדלים בערכיות ובסידור המרחבי של תא T וזרועות קשירת גידולים, מרחקים בין תחומים, והכללת תחום Fc, המשפיע על מחצית החיים ויכול לגרום לפונקציות אפקט אם קיים5. עבודות קודמות במעבדה שלנו הראו כי גורמים אלה משפיעים באופן משמעותי על היעילות נגד גידולים של T-BsAbs, עם הבדלים של עד פי 1,000 בעוצמה6. באמצעות עבודה זו, זיהינו את פורמט IgG-[L]-scFv כפלטפורמה האידיאלית עבור T-BsAbs (ראה סעיף תוצאות מייצגות לפרטים נוספים לגבי פורמטים של T-BsAb), ויישמנו פלטפורמה זו על מטרות כולל GD2 (נוירובלסטומה), HER2 (סרטן השד ואוסטאוסרקומה), GPA33 (סרטן המעי הגס), STEAP1 (יואינג סרקומה), CD19 (ממאירויות תאי B) ו- CD33 (ממאירויות תאי B)7, 8,9,10,11,12,13.
אחד האתגרים העיקריים ביישום מוצלח של טיפול T-BsAb בגידולים מוצקים הוא התגברות על מיקרו-סביבה של גידולים מדכאי חיסון (TME) כדי להניע סחר בתאי T לגידולים14. הגורמים המשפיעים על יעילות T-BsAb שתוארו לעיל משפיעים באופן משמעותי על היכולת של T-BsAbs לגרום ביעילות לביות תאי T לגידולים, אך קשה להעריך השפעה זו במערכת in vivo בזמן אמת. כתב יד זה מספק תיאור מפורט של השימוש בתאי T מותמרים לוציפראז במחקרים פרה-קליניים של T-BsAbs כדי להעריך סחר בתאי T לרקמות שונות במודלים ניסיוניים של עכברים מדוכאי חיסון במהלך הטיפול. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק אמצעי להערכת חדירת תאי T לגידולים ולרקמות אחרות, כמו גם תובנה בזמן אמת לגבי קינטיקה והתמדה של ביות תאי T, ללא צורך להקריב בעלי חיים במהלך הטיפול. עבור המספר ההולך וגדל של חוקרים המתמקדים באימונותרפיה תאית, היכולת לעקוב אחר תאי T in vivo במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים היא קריטית. אנו שואפים לספק תיאור יסודי ומפורט של השיטה בה השתמשנו למעקב אחר תאי T מותמרים של לוציפראז כדי לאפשר לחוקרים אחרים לשכפל בקלות טכניקה זו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T (T-BsAbs) נמצאים בשלבים שונים של פיתוח פרה-קליני ובדיקות קליניות לגידולים מוצקים. גורמים כגון ערכיות, סידור מרחבי, מרחק בין-תחומי ומוטציות Fc משפיעים על היעילות האנטי-סרטנית של טיפולים אלה, בדרך כלל על ידי השפעה על הביות של תאי T לגידולים, מה שנותר אתגר גדול. כאן, אנו מתארים שיטה להתמרה של תאי T אנושיים פעילים עם לוציפראז, המאפשרת מעקב in vivo של תאי T במהלך מחקרי טיפול T-BsAb. היכולת של T-BsAbs להפנות תאי T לגידולים ניתנת להערכה כמותית במספר נקודות זמן במהלך הטיפול, מה שמאפשר לחוקרים לקשר את היעילות האנטי-סרטנית של T-BsAbs והתערבויות אחרות עם ההתמדה של תאי T בגידולים. שיטה זו מקלה על הצורך להקריב בעלי חיים במהלך הטיפול כדי להעריך היסטולוגית את חדירת תאי T וניתן לחזור עליה במספר נקודות זמן כדי לקבוע את הקינטיקה של סחר בתאי T במהלך הטיפול ולאחריו.

כפי שמתואר בשלב 4.3, עכברים יכולים להיות מכוונים בתנוחות שונות במהלך ההדמיה כדי להעריך את נוכחותם של תאי T ברקמות שונות. מיקום שכיבה מאפשר הערכה של תאי T בריאות, דבר שכיח בנקודות זמן מוקדמות לאחר ההזרקה. מיקום רוחבי עם xenograft תת עורית פונה כלפי מעלה משמש כדי להעריך בצורה הטובה ביותר את הסחר בתא?...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

כאן, אנו מתארים שיטה להמרת תאי T אנושיים עם לוציפראז כדי להקל על מעקב in vivo אחר סחר בתאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים לגידולים במחקרים כדי להעריך את היעילות והמנגנון נגד גידולים של נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T.

מעקב אחר סחר בתאי T הנגרמים על ידי נוגדנים דו-ספציפיים באמצעות תאי T אנושיים מותמרים של לוציפראז

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

שיטה זו מאפשרת למשתמשים לעקוב בקלות אחר תאי T in vivo כדי להעריך את הקינטיקה של הביות ולנטר את ההתמדה של תאי T. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לחזור עליה במספר נקודות זמן על אותו בעל חיים מבלי לדרוש הקרבה בציטומטריית זרימה או אימונוהיסטוכימיה. טכניקה זו יכולה להיות שונה עבור מעקב אחר סוגים אחרים של תאים חיסוניים גם כן.לתרבית תאי 293T, הכינו ליטר אחד של DMEM על ידי הוספת 110 מיליליטר של נסיוב בקר עוברי מומת בחום ו-11 מיליליטר של פניצילין סטרפטומיצין. הפשירו חמש פעמים 10 עד 293T השישי והעבירו אותם לבקבוק T175 המכיל DMEM. פצל את התאים אחד עד 10 כל שלושה ימים במשך שישה ימים לפני שהתאים הופכים ליותר מ- 90% נפגשים.עבור transfection, להעביר 1.5 מיליליטר של מדיה לשני צינורות 50 מיליליטר באמצעות פיפטה. לצינור אחד, להוסיף 10 מיקרוגרם של פלסמיד VSVG, 20 מיקרוגרם של gag pol, ו 20 מיקרוגרם של חיפושית קליק אדום TDtomato או CBRTDR luciferase פלסמיד ולערבב. הוסף 100 מיקרוליטר של DNA מגיב transfection במבחנה לצינור אחר ולערבב.דוגרים על שני הצינורות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. מעבירים את המדיה המכילה את מגיב הטרנספקציה של הדנ"א במבחנה טיפתית לצינור המכיל את פלסמידים של הדנ"א ומערבבים בעדינות עם פיפטה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.במהלך הדגירה, נתקו את תאי 293T על ידי הוספת חמישה עד 10 מיליליטר של 0.05% טריפסין. לאחר ניתוק התאים, הוסיפו 10 מיליליטר מדיה וצנטריפוגה ב-800 גרם למשך חמש דקות. להשעות את התאים ב 1.5 מיליליטר של מדיה.הוסף את המדיה המכילה את מגיב הטרנספקציה של ה- DNA במבחנה ואת פלסמידים ה- DNA לתאי 293T ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, להעביר את המתלה לצלוחית T175. מוסיפים 18 מיליליטר של מדיה ודגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.למחרת, בזהירות לשאוף את התקשורת עם פיפטה זכוכית מבלי לנתק את התאים ולהחליף אותו עם 18 מיליליטר של מדיה טרייה. שוב, לדגור לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות פיפטה שהונחה על קרח וצנטריפוגה ב 800 גרם למשך חמש דקות כדי לזרוק את התאים והפסולת.סננו את הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות מסנן 0.22 מיקרון והניחו אותו מיד על קרח. עבור הפעלה חוץ גופית של תאי T אנושיים, הוסף 10 מיליליטר של PBS המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר או BSA ושני מילימולרים EDTA לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. לאחר מכן כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף חרוזים לתוך צינור ומניחים את הצינור במדף מגנטי.לאחר שתי דקות, הסר את PBS מהצינור. לאחר הכנת DMEM, להוסיף חרוזים שטופים אינטרלוקין-2 או IL-2 לריכוז סופי של 30 יחידות בינלאומיות למיליליטר. ספרו את תאי ה-T באמצעות ציטומטר המו וכתם כחול טריפאן.לאחר הספירה, הוסף את המספר הרצוי של תאי T למדיה והפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב. צלחת 2.5 מיליליטר של מדיה המכילה שני מיליון תאי T, חרוזים ו- IL-2 בכל באר של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני לח.בדוק את תאי T תחת מטרה 20X כל יום במשך שלושה ימים כדי לקבוע מתי להתמיר עם luciferase. לאחר מכן, כדי להכין צלחת RetroNectin, להוסיף שני מיליליטר של 20 מיקרוגרם למיליליטר RetroNectin ב PBS לבאר של צלחת שש בארות לא מטופל לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. שאפו את ה-RetroNectin מבלי לגרד את תחתית הצלחת והוסיפו שלושה מיליליטר של 2% BSA ב-PBS לכל באר בצלחת בעלת שש הקידוחים.דוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, עבור spinoculation, לשאוף את BSA ולשטוף את הבארות פעם אחת עם שלושה מיליליטר של PBS. המשיכו או החליפו ב-PBS טרי והשאירו את הצלחת מכוסה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.למחרת, להוסיף שני מיליליטר של CBRTDR luciferase supernatant נגיפי לכל באר צנטריפוגה ב 1, 240 G במשך 90 דקות ב 32 מעלות צלזיוס. לצורך התמרה, לאחר ספירת תאי T, שואפים את הסופרנאטנט הנגיפי ולוחצים שני מיליון תאי T לבאר בשישה מיליליטר DMEM המכילים 30 יחידות בינלאומיות למיליליטר של IL-2 אנושי. בדוק את תאי T במשך יומיים.כאשר התאים כמעט נפגשים, שטפו אותם בעדינות מתחתית הצלחת באמצעות פיפטה והעבירו כל באר לצלוחית T75 נפרדת. הוסף תשעה מיליליטר מדיה לקבלת נפח כולל של 15 מיליליטר לכל בקבוק. למחרת, להוסיף 15 מיליליטר של מדיה ולאשר התמרה מוצלחת על ידי ביצוע ציטומטריית זרימה.לאחר הרדמת העכבר, באמצעות מחט 26 מד, להזריק 20 מיליון תאי T ב 100 מיקרוליטר של מדיה רטרואורביטלית. לנהל 1, 000 יחידות של רקומביננטי IL-2 תת עורית כדי לתמוך בהישרדות תאי T in vivo. לאחר מכן לנהל את הנוגדן bispecific רטרוorbitally או intraperitoneally.עבור הדמיה in vivo, לנהל 100 מיקרוליטר של שלושה מיליגרם של D-luciferin על ידי הזרקה retroorbital עם מחט 26 מד בעכבר מורדם. כדי ללכוד תמונות, מקם את העכבר בתא ההדוק של מכונת הצילום, כך שהאגף הנושא את הקסנוגרפט פונה כלפי מעלה לכיוון המצלמה. באמצעות לוח הבקרה של הרכישה, בחר זוהר, צילום ושכבת-על.הגדר את זמן החשיפה לאוטומטי, את הקישור לבינוני ואת f-stop לאחד וקבל תמונות. לאחר התמונה הראשונה, הגדירו את זמן החשיפה כך שיתאים לזה שחושב אוטומטית לתמונה הראשונה, כך שניתן יהיה להשוות ישירות בין התמונות הבאות. צלם קבוצה נוספת של תמונות עם העכבר שכיבה כדי להעריך נוכחות תאי T בריאות.תאי T חמושים נסחרו לגידול מהר יותר מתאי T לא חמושים, ועזבו את הריאות יומיים מוקדם יותר. כימות חדירת תאי T לגידולים לאורך זמן נמדדה על ידי ביולומינסנציה והתבטאה כסך להקות או זוהר לפיקסל המשולב על פני מתאר הגידול. סחר בתאי T יכול להיות מנוטר במשך 28 ימים לאחר הזרקת תאי T מותמרים לוציפראז, המאפשר מעקב אחר ביות תאי T והתמדה לאורך כל הטיפול.מוצג סחר בתאי T לקסנוגרפטים שמקורם בסרטן שד אנושי חיובי ל-HER2 בעכברי DKO. לטיפול בנוגדן דו-ספציפי HER2 עם FC לא מושתק לא הייתה השפעה על צמיחת הגידול בהשוואה לנוגדן דו-ספציפי מבוקר. לעומת זאת, טיפול בנוגדן דו-ספציפי HER2 המכיל מוטציה N297A לבדו או בשילוב עם מוטציית K322A הצליח לעצור לחלוטין את צמיחת הגידול.עבור קבוצות עם מוטציות ההשתקה, אות ההארה של תאי T הגיע לשיא גבוה יותר ביום השלישי שלאחר ההזרקה ונשאר ברמה גבוהה יותר בהשוואה לנוגדן דו-ספציפי מבוקר ונוגדן דו-ספציפי HER2 שלא הושתק. עכברים שנשאו קסנוגרפטים שמקורם בחולה נוירובלסטומה הדגימו דלדול של מקרופאגים חיוביים ל-Ly6C שהגדילו באופן משמעותי את ביות תאי T לגידולים, וכתוצאה מכך ירידה בצמיחת הגידול והישרדות ממושכת. ההשפעה הייתה בולטת יותר בקסנוגרפטים שמקורם באוסטאוסרקומה.בקרב נוגדנים דו-ספציפיים המכוונים לאנטיגן הגידול STEAP1, פורמט IGGL SCFV הביא להחדרה משמעותית יותר של תאי T ביום השישי לאחר המנה הראשונה של תאי T שנמשכה למשך הטיפול. תצפיות כאלה לא נחזו על ידי מבחני ציטוטוקסיות חוץ גופית. לאחר מעקב אחר תאי T in vivo, משתמשים עדיין יכולים לבצע אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע באופן ספציפי יותר היכן תאי T ממוקמים בתוך הגידול או רקמות נורמליות אחרות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית ​​השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

עכבר Syngeneic B-Cell לימפומה מודל להערכת קליניים בתאי T המכונית CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

בידוד והתרחבות של Cy, ציטוטוקאין ציטוטופין המושרה הרוצח T תאים לטיפול בסרטן

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...