Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Vladimir Ponomarev per aver condiviso i costrutti di luciferasi utilizzati negli esperimenti descritti nella sezione dei risultati rappresentativi di questo articolo.

Le seguenti procedure sono state valutate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Memorial Sloan Kettering.
1. Trasfezione di cellule 293T con luciferasi e prelievo di surnatante virale
<ol><li>Coltura di cellule 293T<ol><li>Preparare i terreni aggiungendo quanto segue a un litro di DMEM ciascuno: 110 ml di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 11 ml di penicillina-streptomicina.</li>
		<li>Scongelare 5 x 106 293T e ...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

Mentre il T-BsAb blinatumomab è stato approvato per le neoplasie ematologiche CD19-positive, l'implementazione di successo di T-BsAbs nei tumori solidi si è dimostrata molto più difficile. Catumaxomab, un T-BsAb diretto contro la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EPCAM), è stato approvato per il trattamento dell'ascite maligna in pazienti con cancro ovarico, ma la produzione del farmaco è stata successivamente interrotta per motivi commerciali19. Nessun altro T-BsAbs è stato app...

Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono anticorpi ingegnerizzati utilizzati per fornire specificità artificiale alle cellule T policlonali coinvolgendo le cellule T attraverso un braccio legante e un antigene tumorale attraverso un altro braccio legante. Questa tecnologia è stata applicata con successo ai tumori ematologici (CD19-targeting blinatumomab1), e numerosi T-BsAb sono in fase di sviluppo preclinico e clinico per una varietà di tumori solidi così come2. I T-BsAb coinvolgono le cellule T policlonali in modo indipendente dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), e quindi anche i tumori che sottoregolano gli antigeni dei leucociti umani (HLA) sono suscettibili a questo tipo di terapia 3,4. I T-BsAb sono stati sviluppati in dozzine di formati diversi, con differenze nella valenza e nella disposizione spaziale delle cellule T e dei bracci leganti il tumore, le distanze interdomini e l'inclusione di un dominio Fc, che influenza l'emivita e può indurre funzioni effettrici se presente5. Precedenti lavori nel nostro laboratorio hanno dimostrato che questi fattori influenzano significativamente l'efficacia antitumorale di T-BsAbs, con differenze fino a 1.000 volte nella potenza6. Attraverso questo lavoro, abbiamo identificato il formato IgG-[L]-scFv come la piattaforma ideale per T-BsAbs (vedere la sezione Risultati rappresentativi per maggiori dettagli sui formati T-BsAb) e abbiamo applicato questa piattaforma a target tra cui GD2 (neuroblastoma), HER2 (cancro al seno e osteosarcoma), GPA33 (cancro del colon-retto), STEAP1 (sarcoma di Ewing), CD19 (tumori maligni delle cellule B) e CD33 (tumori maligni delle cellule B)7, 8,9,10,11,12,13.
Una delle principali sfide per implementare con successo la terapia T-BsAb nei tumori solidi è superare un microambiente tumorale immunosoppressivo (TME) per guidare il traffico di cellule T verso i tumori14. I fattori che influenzano l'efficacia di T-BsAb sopra descritti hanno un impatto significativo sulla capacità di T-BsAbs di indurre efficacemente l'homing delle cellule T ai tumori, ma questo effetto è difficile da valutare in un sistema in vivo in tempo reale. Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata dell'uso delle cellule T trasdotte dalla luciferasi negli studi preclinici di T-BsAbs per valutare il traffico di cellule T verso vari tessuti in modelli murini immunocompromessi sperimentali durante il trattamento. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un mezzo per valutare l'infiltrazione delle cellule T nei tumori e in altri tessuti, nonché una visione in tempo reale della cinetica e della persistenza delle cellule T, senza la necessità di sacrificare animali durante il trattamento. Per il crescente numero di ricercatori che si concentrano sulle immunoterapie cellulari, la capacità di tracciare le cellule T in vivo in modelli animali preclinici è fondamentale. Miriamo a fornire una descrizione completa e dettagliata del metodo che abbiamo impiegato per tracciare le cellule T trasdotte dalla luciferasi per consentire ad altri ricercatori di replicare facilmente questa tecnica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono in varie fasi di sviluppo preclinico e test clinici per i tumori solidi. Fattori come la valenza, la disposizione spaziale, la distanza interdominio e le mutazioni Fc influenzano l'efficacia antitumorale di queste terapie, comunemente influenzando l'homing delle cellule T nei tumori, che rimane una grande sfida. Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane attivate con luciferasi, consentendo il tracciamento in vivo delle cellule T durante gli studi di terapia T-BsAb. La capacità di T-BsAbs di reindirizzare le cellule T ai tumori può essere valutata quantitativamente in più punti temporali durante il trattamento, consentendo ai ricercatori di correlare l'efficacia antitumorale di T-BsAbs e altri interventi con la persistenza delle cellule T nei tumori. Questo metodo allevia la necessità di sacrificare gli animali durante il trattamento per valutare istologicamente l'infiltrazione delle cellule T e può essere ripetuto in più punti temporali per determinare la cinetica del traffico di cellule T durante e dopo il trattamento.

Come descritto nella fase 4.3, i topi possono essere orientati in diverse posizioni durante l'imaging per valutare la presenza di cellule T in diversi tessuti. Il posizionamento supino consente la valutazione delle cellule T nei polmoni, che è comune nei primi punti temporali dopo l'iniezione. Il posizionamento laterale con lo xenotrapianto sottocutaneo rivolto verso l'alto viene utilizzato per valutare al meglio il traffico di cellule T verso il tumore. Topi femmina C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug...

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Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane con luciferasi per facilitare il monitoraggio in vivo del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici ai tumori in studi per valutare l'efficacia antitumorale e il meccanismo degli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T.

Monitoraggio del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule T umane trasdotte dalla luciferasi

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Questo metodo consente agli utenti di tracciare facilmente le cellule T in vivo per valutare la cinetica dell'homing e monitorare la persistenza delle cellule T. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere ripetuta in più punti temporali sullo stesso animale senza richiedere sacrifici nella citometria a flusso o nell'immunoistochimica. Questa tecnica potrebbe essere modificata per tracciare anche altri tipi di cellule immunitarie.Per coltivare le cellule 293T, preparare un litro di DMEM aggiungendo 110 millilitri di siero bovino fetale inattivato dal calore e 11 millilitri di streptomicina penicillina. Scongelare cinque volte 10 fino alla sesta cella 293T e trasferirle in un matraccio T175 contenente DMEM. Dividere le cellule da una a 10 ogni tre giorni per sei giorni prima che le cellule diventino più del 90% confluenti.Per la trasfezione, trasferire 1,5 millilitri di supporto in due tubi da 50 millilitri utilizzando una pipetta. A un tubo, aggiungere 10 microgrammi di plasmide VSVG, 20 microgrammi di gag pol e 20 microgrammi di click beetle red TDtomato o CBRTDR luciferasi plasmide e mescolare. Aggiungere 100 microlitri di reagente di trasfezione in vitro del DNA in un'altra provetta e mescolare.Incubare entrambi i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti. Trasferire il mezzo contenente il reagente di trasfezione in vitro del DNA goccia a goccia sulla provetta contenente i plasmidi del DNA e mescolare delicatamente con una pipetta. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.Durante l'incubazione, staccare le cellule 293T aggiungendo da cinque a 10 millilitri di tripsina allo 0,05%. Una volta staccate le cellule, aggiungere 10 millilitri di terreno e centrifugare a 800 G per cinque minuti. Risospendere le celle in 1,5 millilitri di supporto.Aggiungere i mezzi contenenti il reagente di trasfezione in vitro del DNA e i plasmidi del DNA alle cellule 293T e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione in un matraccio T175. Aggiungere 18 millilitri di supporto e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, aspirare con cura il supporto con una pipetta di vetro senza staccare le celle e sostituirlo con 18 millilitri di mezzi freschi. Ancora una volta, incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, rimuovere il surnatante virale usando una pipetta messa su ghiaccio e centrifugare a 800 G per cinque minuti per pellettare le cellule e i detriti.Filtrare il surnatante virale utilizzando un filtro da 0,22 micron e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio. Per l'attivazione in vitro di cellule T umane, aggiungere 10 millilitri di PBS contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina o BSA e due EDTA millimolari a un tubo sterile da 15 millilitri. Quindi per lavare le perline, aggiungere perline in un tubo e posizionare il tubo in un rack magnetico.Dopo due minuti, rimuovere il PBS dal tubo. Dopo aver preparato DMEM, aggiungere perline lavate e interleuchina-2 o IL-2 a una concentrazione finale di 30 unità internazionali per millilitro. Contare le cellule T usando un emocitometro e una colorazione blu di Trypan.Dopo il conteggio, aggiungere il numero desiderato di cellule T al mezzo e capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. Piastra 2,5 millilitri di terreno contenente due milioni di cellule T, perline e IL-2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Coltura a 37 gradi Celsius in anidride carbonica umidificata al 5%.Esaminare le cellule T sotto un obiettivo 20X ogni giorno per tre giorni per determinare quando trasdurre con luciferasi. Successivamente, per preparare una piastra RetroNectin, aggiungere due millilitri di 20 microgrammi per millilitro di RetroNectin in PBS a un pozzetto di una piastra a sei pozzetti non trattata e incubare per due ore a temperatura ambiente. Aspirare il RetroNectin senza graffiare il fondo della piastra e aggiungere tre millilitri di 2% BSA in PBS per pozzetto nella piastra a sei pozzetti.Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, per la spinoculazione, aspirare la BSA e lavare i pozzetti una volta con tre millilitri di PBS. Continuare o sostituire con PBS fresco e lasciare la piastra coperta a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, aggiungere due millilitri di supernatante virale CBRTDR luciferasi per pozzetto e centrifugare a 1.240 G per 90 minuti a 32 gradi Celsius. Per la trasduzione, dopo aver contato le cellule T, aspirare il surnatante virale e placcare due milioni di cellule T per pozzetto in sei millilitri di DMEM contenente 30 unità internazionali per millilitro di IL-2 umano. Esaminare le cellule T per due giorni.Quando le cellule sono quasi confluenti, lavarle delicatamente dal fondo della piastra usando una pipetta e trasferire ciascun pozzetto in un matraccio T75 separato. Aggiungere nove millilitri di supporto per un volume totale di 15 millilitri per pallone. Il giorno successivo, aggiungere 15 millilitri di mezzi e confermare la trasduzione corretta eseguendo la citometria a flusso.Dopo aver anestetizzato il topo, utilizzando un ago calibro 26, iniettare 20 milioni di cellule T in 100 microlitri di terreno retroorbitalmente. Somministrare 1.000 unità di IL-2 ricombinante per via sottocutanea per supportare la sopravvivenza delle cellule T in vivo. Quindi somministrare l'anticorpo bispecifico retroorbitalmente o intraperitonealmente.Per l'imaging in vivo, somministrare 100 microlitri di tre milligrammi di D-luciferina mediante iniezione retroorbitale con un ago calibro 26 in un topo anestetizzato. Per acquisire immagini, posizionare il mouse nella camera a tenuta di luce dell'imager in modo che il fianco che porta lo xenotrapianto sia rivolto verso la fotocamera. Utilizzando il pannello di controllo dell'acquisizione, selezionare luminescente, fotografia e sovrapposizione.Imposta il tempo di esposizione su auto, il binning su medio e f-stop su uno e acquisisci immagini. Dopo la prima immagine, impostare il tempo di esposizione in modo che corrisponda a quello calcolato automaticamente per la prima immagine in modo che le immagini successive possano essere confrontate direttamente. Prendi un'altra serie di immagini con il topo supino per valutare la presenza di cellule T nei polmoni.Le cellule T armate trafficavano verso il tumore più velocemente delle cellule T disarmate, lasciando i polmoni due giorni prima. La quantificazione dell'infiltrazione delle cellule T nei tumori nel tempo è stata misurata mediante bioluminescenza ed espressa come stormi totali o radianza per pixel integrato sul contorno tumorale. Il traffico delle cellule T potrebbe essere monitorato per 28 giorni dopo l'iniezione delle cellule T trasdotte dalla luciferasi, consentendo di tracciare l'homing e la persistenza delle cellule T durante il trattamento.Viene mostrato il traffico di cellule T in xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario umano HER2 positivo in topi DKO. Il trattamento con l'anticorpo bispecifico HER2 con FC non silenziata non ha avuto alcun effetto sulla crescita tumorale rispetto a un anticorpo bispecifico controllato. Al contrario, il trattamento con l'anticorpo bispecifico HER2 contenente la mutazione N297A da solo o in combinazione con una mutazione K322A è stato in grado di arrestare completamente la crescita tumorale.Per i gruppi con mutazioni silenzianti, il segnale di luminescenza delle cellule T ha raggiunto un picco più elevato il terzo giorno dopo l'iniezione e persisteva a un livello più elevato rispetto all'anticorpo bispecifico controllato e all'anticorpo bispecifico HER2 non silenziato. I topi portatori di xenotrapianti derivati da pazienti affetti da neuroblastoma hanno dimostrato che la deplezione dei macrofagi positivi a Ly6C ha aumentato significativamente l'homing delle cellule T nei tumori, con conseguente diminuzione della crescita tumorale e sopravvivenza prolungata. L'effetto era più pronunciato negli xenotrapianti derivati da pazienti affetti da osteosarcoma.Tra gli anticorpi bispecifici mirati all'antigene tumorale STEAP1, il formato IGGL SCFV ha determinato un'infiltrazione di cellule T significativamente maggiore il sesto giorno dopo la prima dose di cellule T che è persistita per tutta la durata del trattamento. Tali osservazioni non sono state previste da saggi di citotossicità in vitro. Dopo aver monitorato le cellule T in vivo, gli utenti possono ancora eseguire l'immunoistochimica per determinare più specificamente dove si trovano le cellule T all'interno del tumore o di altri tessuti normali.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

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Ricerca sul cancro

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule T in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modello di linfoma della B-cellula Syngeneic del topo per la valutazione pre-clinica delle cellule di T di CD19 auto

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Preparazione degli esosomi per siRNA consegna alle cellule tumorali

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolamento ed espansione delle cellule T Killer citotokine indotte da citokine per il trattamento del cancro

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...