Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
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著者らは、この記事の代表的な結果のセクションで説明されている実験で使用されたルシフェラーゼ構築物を共有してくれたウラジミール・ポノマレフ博士に感謝したいと思います。

以下の手順は、メモリアルスローンケタリングの施設動物管理および使用委員会によって評価および承認されています。
1. 293T細胞へのルシフェラーゼのトランスフェクションとウイルス上清の回収
<ol><li>293T細胞の培養<ol><li>それぞれ1リットルのDMEMに以下を加えて培地を調製します:110 mLの熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、11 mLのペニシリン-ストレプトマイシン?...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

T-BsAbブリナツモマブはCD19陽性血液悪性腫瘍に対して承認されていますが、固形腫瘍へのT-BsAbsの実装の成功ははるかに困難であることが証明されています。上皮細胞接着分子(EPCAM)に対するT-BsAbであるカツマキソマブは、卵巣がん患者の悪性腹水の治療薬として承認されましたが、その後、商業上の理由で薬の生産が中止されました19。固形腫瘍に対して承認された他のT-BsAbs?...

T細胞関与二重特異性抗体(T-BsAbs)は、1つの結合アームを介してT細胞を関与させ、別の結合アームを介して腫瘍抗原を関与させることにより、ポリクローナルT細胞に人工的な特異性を提供するために使用される操作された抗体です。この技術は血液がん(CD19を標的とするブリナツモマブ1)への適用に成功しており、さまざまな固形腫瘍に対しても多数のT-BsAbが前臨床および臨床開発中です2。T-BsAbsは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)非依存的にポリクローナルT細胞に作用するため、ヒト白血球抗原(HLA)を下方制御する腫瘍でさえ、このタイプの治療を受けやすいのです3,4。T-BsAbsは数十の異なるフォーマットで開発されており、T細胞と腫瘍結合アームの原子価と空間配置、ドメイン間距離、および半減期に影響を与え、存在する場合はエフェクター機能を誘導できるFcドメインの包含に違いがあります5。私たちの研究室での以前の研究では、これらの要因がT-BsAbsの抗腫瘍効果に大きく影響し、効力に最大1,000倍の違いがあることが示されています6。この研究を通じて、IgG-[L]-scFvフォーマットがT-BsAbの理想的なプラットフォームであることを特定し(T-BsAbフォーマットの詳細については代表的な結果のセクションを参照)、GD2(神経芽細胞腫)、HER2(乳がんおよび骨肉腫)、GPA33(結腸直腸がん)、STEAP1(ユーイング肉腫)、CD19(B細胞悪性腫瘍)、CD33(B細胞悪性腫瘍)などの標的に適用しました7。 8,9,10,11,12,13。
固形腫瘍にT-BsAb療法を成功裏に実施するための主要な課題の1つは、免疫抑制性腫瘍微小環境(TME)を克服して腫瘍へのT細胞輸送を促進することです14。上記のT-BsAbの有効性に影響を与える因子は、T-BsAbsが腫瘍へのT細胞ホーミングを効果的に誘導する能力に大きな影響を与えますが、この効果を in vivo システムでリアルタイムで評価することは困難です。この原稿は、治療中の実験的免疫不全マウスモデルにおける様々な組織へのT細胞輸送を評価するためのT-BsAbsの前臨床試験におけるルシフェラーゼ形質導入T細胞の使用の詳細な説明を提供する。この方法の全体的な目標は、治療中に動物を犠牲にすることなく、腫瘍および他の組織におけるT細胞浸潤を評価する手段、ならびにT細胞ホーミング動態および持続性に関するリアルタイムの洞察を提供することである。細胞免疫療法に焦点を当てる研究者の数が増えているため、前臨床動物モデルで in vivo でT細胞を追跡する能力は非常に重要です。私たちは、ルシフェラーゼ形質導入T細胞を追跡するために採用した方法の徹底的で詳細な説明を提供し、他の研究者がこの技術を簡単に複製できるようにすることを目指しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

T細胞関与型二重特異性抗体(T-BsAbs)は、固形腫瘍の前臨床開発および臨床試験のさまざまな段階にあります。原子価、空間的配置、ドメイン間距離、およびFc変異などの要因は、一般に腫瘍へのT細胞のホーミングに影響を与えることによって、これらの治療法の抗腫瘍効果に影響を及ぼしますが、これは依然として大きな課題です。ここでは、活性化ヒトT細胞をルシフェラーゼで形質導入し、T-BsAb療法研究中のT細胞の in vivo 追跡を可能にする方法について説明します。T-BsAbsがT細胞を腫瘍にリダイレクトする能力は、治療中の複数の時点で定量的に評価できるため、研究者はT-BsAbsの抗腫瘍効果やその他の介入を腫瘍におけるT細胞の持続性と相関させることができます。この方法は、T細胞浸潤を組織学的に評価するために治療中に動物を犠牲にする必要性を軽減し、治療中および治療後のT細胞輸送の動態を決定するために複数の時点で繰り返すことができます。

ステップ4.3で説明したように、マウスは、異なる組織におけるT細胞の存在を評価するために、画像化中に異なる位置に配向され得る。仰臥位は、注射後の早い時点で一般的である肺のT細胞の評価を可能にする。皮下異種移植片を上に向けた横方向の位置配置は、腫瘍へのT細胞輸送を最もよく評価するために使用されます。雌の C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTacマウスを、こ...

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Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

ここでは、抗腫瘍効果とT細胞関与二重特異性抗体のメカニズムを評価する研究において、腫瘍への二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の in vivo 追跡を容易にするために、ルシフェラーゼでヒトT細胞を形質導入する方法について説明します。

ルシフェラーゼ形質導入ヒトT細胞を用いた二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の追跡(英語)

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

この方法により、ユーザーはin vivoでT細胞を簡単に追跡して、ホーミングの速度論を評価し、T細胞の持続性を監視できます。この技術の主な利点は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学において犠牲を必要とせずに、同じ動物上の複数の時点で繰り返すことができることである。この手法は、他の種類の免疫細胞を追跡するためにも変更できます。293T細胞を培養するには、110ミリリットルの熱不活化ウシ胎児血清と11ミリリットルのペニシリンストレプトマイシンを添加して1リットルのDMEMを調製します。6番目の293T細胞に10回5回解凍し、DMEMを含むT175フラスコに移します。細胞が90%以上コンフルエントになる前に、6日間、3日ごとに細胞を1〜10に分割します。トランスフェクションの場合は、ピペットを使用して1.5ミリリットルの培地を2本の50ミリリットルチューブに移します。1本のチューブに、10マイクログラムのVSVGプラスミド、20マイクログラムのギャグポール、および20マイクログラムのカブトムシレッドTDトマトまたはCBRTDRルシフェラーゼプラスミドを加えて混合します。100 マイクロリットルの DNA in vitro トランスフェクション試薬を別のチューブに添加して混合します。両方のチューブを室温で5分間インキュベートします。DNA in vitroトランスフェクション試薬を含む培地をDNAプラスミドを含むチューブに滴下し、ピペットで穏やかに混合します。室温で20分間インキュベートします。インキュベーション中に、5〜10ミリリットルの0.05%トリプシンを加えて293T細胞を剥離します。細胞が剥離したら、10ミリリットルの培地を加え、800 Gで5分間遠心分離します。細胞を1.5ミリリットルの培地に再懸濁する。DNA in vitroトランスフェクション試薬と DNA プラスミドを含む培地を 293T 細胞に加え、摂氏 37 度で 30 分間インキュベートします。インキュベーション後、懸濁液をT175フラスコに移します。18ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、細胞を剥離せずにガラスピペットで培地を注意深く吸引し、18ミリリットルの新鮮な培地と交換します。繰り返しますが、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、氷上に置いたピペットを用いてウイルス上清を除去し、800Gで5分間遠心分離して細胞および破片をペレット化した。0.22ミクロンのフィルターを使用してウイルス上清をろ過し、すぐに氷の上に置きます。ヒトT細胞のin vitro活性化のために、0.1%ウシ血清アルブミンまたはBSAと2ミリモルEDTAを含む10ミリリットルのPBSを滅菌15ミリリットルのチューブに加えます。次に、ビーズを洗浄するには、ビーズをチューブに追加し、チューブを磁気ラックに置きます。2分後、PBSをチューブから取り出します。DMEMを調製した後、洗浄ビーズとインターロイキン-2またはIL-2を最終濃度30国際単位/ミリリットルになるまで加えます。ヘモサイトメーターとトリパンブルー染色剤を用いてT細胞を計数します。カウント後、必要な数のT細胞を培地に加え、チューブを静かに反転させて混合します。200万個のT細胞、ビーズ、およびIL-2を含む2.5ミリリットルの培地を24ウェル組織培養プレートの各ウェルにプレートします。加湿した5%二酸化炭素中で摂氏37度で培養する。20倍の対物レンズでT細胞を3日間毎日調べて、ルシフェラーゼで形質導入するタイミングを決定します。次に、レトロネクチンプレートを作製し、PBS中のレトロネクチン1ミリリットル当たり20マイクログラムの2ミリリットルを未処理の6ウェルプレートのウェルに加え、室温で2時間インキュベートする。プレートの底を傷つけずにレトロネクチンを吸引し、6ウェルプレートにウェルあたりPBSで3ミリリットルの2%BSAを追加します。室温で30分間インキュベートします。次に、脊髄膜形成のために、BSAを吸引し、3ミリリットルのPBSでウェルを1回洗浄します。続行するか、新しいPBSと交換し、プレートを摂氏4度で一晩覆ったままにします。翌日、ウェルあたり2ミリリットルのCBRTDRルシフェラーゼウイルス上清を加え、1, 240 Gで32°Cで90分間遠心分離します。形質導入のために、T細胞を計数した後、ウイルス上清を吸引し、1ミリリットル当たり30国際単位のヒトIL-2を含む6ミリリットルのDMEM中にウェル当たり200万個のT細胞をプレートする。T細胞を2日間調べます。細胞がほぼコンフルエントになったら、ピペットを使用してプレートの底から細胞を静かに洗い流し、各ウェルを別々のT75フラスコに移します。9ミリリットルの培地を追加して、フラスコあたり合計15ミリリットルの容量にします。翌日、15ミリリットルの培地を加え、フローサイトメトリーを実施して形質導入が成功したことを確認します。マウスに麻酔をかけた後、26ゲージの針を用いて、眼窩後方向に100マイクロリットルの培地中に2000万個のT細胞を注入する。in vivoでのT細胞の生存をサポートするために、1, 000単位の組換えIL-2を皮下投与する。次いで二重特異性抗体を眼窩後または腹腔内に投与する。in vivoイメージングでは、麻酔をかけたマウスに26ゲージの針で眼窩後注射により、100マイクロリットルの3ミリグラムのD-ルシフェリンを投与します。画像をキャプチャするには、異種移植片を支える側面がカメラに向かって上を向くように、イメージャーの光密チャンバーにマウスを置きます。取り込みコントロールパネルを使用して、発光、写真、オーバーレイを選択します。露光時間をオート、ビニングを中、Fストップを1に設定して画像を取得します。最初の画像の後、最初の画像に対して自動的に計算された露出時間と一致するように露出時間を設定して、後続の画像を直接比較できるようにします。マウス仰臥位で別の画像を撮影して、肺におけるT細胞の存在を評価します。武装T細胞は非武装T細胞よりも早く腫瘍に輸送され、2日早く肺を離れました。経時的な腫瘍へのT細胞浸潤の定量は、生物発光によって測定され、腫瘍輪郭にわたって積分されたピクセルあたりの総フロックまたは放射輝度として表されました。T細胞輸送は、ルシフェラーゼ形質導入T細胞の注射後28日間モニターすることができ、治療中のT細胞のホーミングと持続性を追跡することができます。DKOマウスにおけるHER2陽性ヒト乳癌患者由来異種移植片へのT細胞輸送が示されている。無サイレンシングFCによるHER2二重特異性抗体による治療は、対照された二重特異性抗体と比較して腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった。対照的に、N297A変異のみを含むHER2二重特異性抗体による治療、またはK322A変異との併用は、腫瘍の成長を完全に停止させることができました。サイレンシング変異を有するグループの場合、T細胞発光シグナルは注射後3日目により高いピークに達し、対照二重特異性抗体および無消音HER2二重特異性抗体と比較してより高いレベルで持続した。神経芽細胞腫患者由来の異種移植片を有するマウスは、Ly6C陽性マクロファージの枯渇を示し、腫瘍へのT細胞ホーミングを有意に増加させ、腫瘍増殖の減少および生存期間の延長をもたらした。この効果は、骨肉腫患者由来の異種移植片でより顕著でした。腫瘍抗原STEAP1を標的とする二重特異性抗体の中で、IGGL SCFVフォーマットは、治療期間中持続したT細胞の初回投与後6日目に有意に多くのT細胞浸潤をもたらしました。このような観察は、インビトロ細胞毒性アッセイによって予測されなかった。in vivoでT細胞を追跡した後でも、ユーザーは免疫組織化学を実行して、T細胞が腫瘍または他の正常組織内のどこにあるかをより具体的に特定できます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

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Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト卵黄扁平上皮癌試料におけるT細胞亜集団の四色蛍光免疫組織化学

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

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同系マウス B 細胞リンパ腫モデル CD19 車 T 細胞の前臨床評価

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Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

がん細胞への siRNA のエクソソームの準備

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CRISPR/Cas9を使用してCAR-TセルのGM-CSFをノックアウト

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子免疫療法用

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

癌治療のための細胞傷害性サイトカイン誘発キラーT細胞の分離と拡張

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...