Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
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저자는 이 기사의 대표 결과 섹션에 설명된 실험에 사용된 루시페라아제 구조를 공유해 주신 Vladimir Ponomarev 박사에게 감사드립니다.

다음 절차는 Memorial Sloan Kettering의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 평가하고 승인했습니다.
1. 루시페라아제를 이용한 293T 세포의 형질주입 및 바이러스 상청액 수확
<ol><li>293T 세포의 배양<ol><li>열 불활성화 소 태아 혈청(FBS) 110mL, 페니실린-스트렙토마이신 11mL를 각각 1리터의 DMEM에 추가하여 배지를 준비합니다.</li>
		<li>5 x 106 293T 세포를 해동하고, 상?...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

T-BsAb 블리나투모맙이 CD19 양성 혈액 악성 종양에 대해 승인되었지만 고형 종양에서 T-BsAb를 성공적으로 구현하는 것은 훨씬 더 어려운 것으로 입증되었습니다. 상피세포 부착 분자(EPCAM)에 대한 T-BsAb인 카투막소맙(Catumaxomab)은 난소암 환자의 악성 복수 치료제로 승인되었으나, 이후 상업적 이유로 약물 생산이 중단되었다19. 다른 T-BsAb는 고형 종양에 대해 승인되지 않았으며, 이는 ...

T 세포 참여 이중특이적 항체(T-BsAbs)는 하나의 결합 아암을 통해 T 세포를 결합시키고 다른 결합 아암을 통해 종양 항원을 결합시킴으로써 다클론 T 세포에 인공 특이성을 제공하는 데 사용되는 조작된 항체입니다. 이 기술은 혈액암(CD19 표적 블리나투모맙1)에 성공적으로 적용되었으며, 수많은 T-BsAb가 다양한 고형 종양에 대한 전임상 및 임상 개발 중에 있습니다2. T-BsAbs는 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 무관한 방식으로 다클론 T 세포에 관여하므로 인간 백혈구 항원(HLA)을 하향 조절하는 종양도 이러한 유형의 치료에 취약합니다 3,4. T-BsAbs는 T 세포와 종양 결합군의 원자가 및 공간 배열, 도메인 간 거리, 반감기에 영향을 미치고 존재하는 경우 이펙터 기능을 유도할 수 있는 Fc 도메인의 포함에 차이가 있는 수십 가지 다양한 형식으로 개발되었다5. 본 연구실의 이전 연구에서는 이러한 요인들이 T-BsAb의 항종양 효능에 상당한 영향을 미치며, 효능 차이는 최대 1,000배에 달하는 것으로 나타났다6. 이 작업을 통해 우리는 IgG-[L]-scFv 형식이 T-BsAb에 이상적인 플랫폼임을 확인했으며(T-BsAb 형식에 대한 자세한 내용은 대표 결과 섹션 참조), 이 플랫폼을 GD2(신경모세포종), HER2(유방암 및 골육종), GPA33(결장직장암), STEAP1(유잉 육종), CD19(B 세포 악성 종양) 및 CD33(B 세포 악성 종양)7, 8,9,10,11,12,13.
고형 종양에서 T-BsAb 요법을 성공적으로 시행하기 위한 주요 과제 중 하나는 면역억제 종양 미세환경(TME)을 극복하여 종양으로의 T 세포 이동을 유도하는 것입니다14. 상술한 T-BsAb 효능에 영향을 미치는 인자는 종양에 대한 T 세포 귀환을 효과적으로 유도하는 T-BsAb의 능력에 상당한 영향을 미치지만, 이 효과는 생체 내 시스템에서 실시간으로 평가하기 어렵다. 이 원고는 치료 중 실험적 면역저하 마우스 모델에서 다양한 조직으로의 T 세포 이동을 평가하기 위해 T-BsAb의 전임상 연구에서 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 사용에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 치료 중 동물을 희생할 필요 없이 종양 및 기타 조직에서 T 세포 침윤을 평가할 수 있는 수단뿐만 아니라 T 세포 귀환 동역학 및 지속성에 대한 실시간 통찰력을 제공하는 것입니다. 세포 면역 요법에 중점을 둔 연구자의 수가 증가함에 따라 전임상 동물 모델에서 생체 내에서 T 세포를 추적하는 능력이 중요합니다. 우리는 다른 연구자들이 이 기술을 쉽게 복제할 수 있도록 루시페라아제 형질도입 T 세포를 추적하기 위해 사용한 방법에 대한 철저하고 상세한 설명을 제공하는 것을 목표로 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

T 세포 참여 이중특이성 항체(T-BsAbs)는 고형 종양에 대한 전임상 개발 및 임상 시험의 다양한 단계에 있습니다. 원자가, 공간 배열, 도메인 간 거리 및 Fc 돌연변이와 같은 요인은 일반적으로 T 세포가 종양으로 귀환하는 데 영향을 미침으로써 이러한 치료법의 항종양 효능에 영향을 미치며, 이는 여전히 주요 과제로 남아 있습니다. 여기에서는 활성화된 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하여 T-BsAb 요법 연구 동안 T 세포를 생체 내 추적할 수 있는 방법을 설명합니다. T 세포를 종양으로 리디렉션하는 T-BsAbs의 능력은 치료 중 여러 시점에서 정량적으로 평가될 수 있으므로 연구자들은 T-BsAb의 항종양 효능 및 기타 개입을 종양에서 T 세포의 지속성과 연관시킬 수 있습니다. 이 방법은 T 세포 침윤을 조직학적으로 평가하기 위해 치료 동안 동물을 희생할 필요성을 완화하고, 치료 중 및 치료 후에 T 세포 밀매의 동역학을 결정하기 위해 여러 시점에서 반복될 수 있습니다.

단계 4.3에 기술된 바와 같이, 마우스는 상이한 조직에서의 T 세포의 존재를 평가하기 위해 영상화 동안 상이한 위치에 배향될 수 있다. 앙와위 자세는 폐의 T 세포를 평가할 수 있게 하며, 이는 주사 후 초기 시점에서 일반적입니다. 피하 이종이편이 위를 향하도록 하는 측면 위치는 종양으로의 T 세포 이동을 가장 잘 평가하는 데 사용됩니다. 암컷 C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac ...

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Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

여기에서 우리는 T 세포 참여 이중특이적 항체의 항종양 효능 및 메커니즘을 평가하기 위한 연구에서 종양에 대한 이중특이적 항체 유도 T 세포 이동의 생체 내 추적을 용이하게 하기 위해 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하는 방법을 설명합니다.

루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

이 방법을 통해 사용자는 생체 내에서 T 세포를 쉽게 추적하여 귀환 동역학을 평가하고 T 세포 지속성을 모니터링할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유세포 분석이나 면역조직화학에서 희생할 필요 없이 동일한 동물에서 여러 시점에서 반복될 수 있다는 것입니다. 이 기술은 다른 유형의 면역 세포도 추적하기 위해 수정될 수 있습니다.293T 세포를 배양하기 위해, 110 밀리리터의 열-불활성화 태아 소 혈청 및 11 밀리리터의 페니실린 스트렙토마이신을 첨가하여 1 리터의 DMEM을 준비한다. 6번째 293T 세포를 10회 5회 해동하고 DMEM이 포함된 T175 플라스크에 옮깁니다. 세포가 90% 이상 융합되기 전에 6일 동안 3일마다 세포를 1-10개로 분할합니다.트랜스펙션의 경우 피펫을 사용하여 1.5 밀리리터의 배지를 두 개의 50 밀리리터 튜브에 옮깁니다. 하나의 튜브에 10 마이크로그램의 VSVG 플라스미드, 20 마이크로그램의 개그 폴, 20 마이크로그램의 클릭 딱정벌레 레드 TDtomato 또는 CBRTDR 루시페라아제 플라스미드를 첨가하고 혼합합니다. 100 마이크로리터의 DNA in vitro transfection 시약을 다른 튜브에 첨가하고 혼합한다.두 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 시험관내 형질주입 시약을 함유하는 배지를 DNA 플라스미드가 들어 있는 튜브에 적하하고 피펫으로 부드럽게 혼합한다. 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.배양 중에 0.05% 트립신 5-10밀리리터를 첨가하여 293T 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 10 밀리리터의 배지를 추가하고 800G에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 1.5 밀리리터의 배지에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.DNA 시험관내 형질주입 시약 및 DNA 플라스미드를 함유하는 배지를 293T 세포에 첨가하고, 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 배양 후, 현탁액을 T175 플라스크로 옮긴다. 18 밀리리터의 배지를 넣고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.다음날, 세포를 분리하지 않고 유리 피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인하고 18 밀리리터의 신선한 배지로 교체하십시오. 다시 말하지만, 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 얼음 위에 놓은 피펫을 이용하여 바이러스 상층액을 제거하고 800G에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 파편을 펠릿화하였다.0.22 미크론 필터를 사용하여 바이러스 상청액을 여과하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 인간 T 세포의 시험관 내 활성화를 위해, 0.1% 소 혈청 알부민 또는 BSA 및 2밀리몰 EDTA를 함유하는 PBS 10밀리리터를 멸균된 15밀리리터 튜브에 첨가한다. 그런 다음 구슬을 씻으려면 구슬을 튜브에 넣고 튜브를 마그네틱 랙에 넣습니다.2분 후, 튜브로부터 PBS를 제거한다. DMEM을 준비한 후, 세척 된 비드와 인터루킨 -2 또는 IL-2를 밀리리터 당 30 국제 단위의 최종 농도로 첨가한다. T 세포를 헤모세포분석기 및 트리판 블루 염색을 이용하여 계수하였다.계수 후 원하는 수의 T 세포를 배지에 추가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 200만 개의 T 세포, 비드 및 IL-2를 함유하는 배지 2.5밀리리터를 플레이트에 넣었다. 섭씨 37도에서 가습 된 5 % 이산화탄소에서 배양하십시오.루시페라아제로 형질도입할 시기를 결정하기 위해 3일 동안 매일 20X 대물렌즈 하의 T 세포를 검사합니다. 다음으로, RetroNectin 플레이트를 준비하기 위해, PBS 중의 20 마이크로그램 RetroNectin 2밀리리터를 처리되지 않은 6웰 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 플레이트 바닥을 긁지 않고 RetroNectin을 흡인하고 6웰 플레이트에 웰당 PBS에 2% BSA 3밀리리터를 추가합니다.실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 다음으로, spinoculation을 위해, BSA를 흡인하고 PBS의 3 밀리리터로 우물을 한 번 세척한다. 계속하거나 새 PBS로 교체하고 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 덮어 둡니다.다음날, 웰 당 2 밀리리터의 CBRTDR 루시페라아제 바이러스 상청액을 첨가하고, 섭씨 32도에서 90 분 동안 1, 240 G에서 원심 분리한다. 형질도입을 위해, T 세포를 계수한 후, 바이러스 상청액을 흡인하고, 인간 IL-2의 밀리리터당 30개의 국제 단위를 함유하는 DMEM의 6밀리리터에서 웰 당 200만 개의 T 세포를 플레이트한다. 이틀 동안 T 세포를 검사한다.세포가 거의 융합되면 피펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 부드럽게 씻어내고 각 웰을 별도의 T75 플라스크로 옮깁니다. 플라스크당 총 15밀리리터 부피의 배지 9밀리리터를 추가합니다. 다음날 15 밀리리터의 배지를 추가하고 유세포 분석을 수행하여 성공적인 형질 도입을 확인합니다.마우스를 마취한 후, 26 게이지 바늘을 사용하여, 2,000만 개의 T 세포를 100 마이크로리터의 배지에 후안와적으로 주입한다. 생체 내에서 T 세포 생존을 지원하기 위해 1, 000 단위의 재조합 IL-2를 피하 투여한다. 그런 다음 이중특이적 항체를 후안와내 또는 복강내로 투여합니다.생체 내 이미징을 위해 마취된 마우스에 26게이지 바늘로 안와후 주사하여 3밀리그램의 D-루시페린 100마이크로리터를 투여합니다. 이미지를 캡처하려면 이종이식 베어링이 있는 측면이 카메라를 향하도록 이미저의 빛이 새지 않는 챔버에 마우스를 놓습니다. 획득 제어판을 사용하여 발광, 사진 및 오버레이를 선택합니다.노출 시간을 자동으로, 비닝을 중간으로, f-스톱을 1로 설정하여 이미지를 획득합니다. 첫 번째 이미지 이후에는 첫 번째 이미지에 대해 자동으로 계산된 노출 시간과 일치하도록 설정하여 후속 이미지를 직접 비교할 수 있습니다. 폐에서 T 세포 존재를 평가하기 위해 마우스 앙와위로 또 다른 이미지 세트를 촬영합니다.무장한 T 세포는 비무장 T 세포보다 더 빨리 종양으로 이동하여 이틀 더 빨리 폐를 떠났습니다. 시간 경과에 따른 종양 내로의 T 세포 침윤의 정량화는 생물발광에 의해 측정되었고, 종양 윤곽에 걸쳐 통합된 픽셀당 총 무리 또는 광도로서 표현되었다. T 세포 트래피킹은 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 주입 후 28일 동안 모니터링될 수 있었고, 치료 전반에 걸쳐 T 세포 귀환 및 지속성을 추적할 수 있었다.DKO 마우스에서 HER2 양성 인간 유방암 환자 유래 이종이식편으로의 T 세포 트래피킹이 도시되어 있다. 침묵되지 않은 FC를 사용한 HER2 이중특이적 항체에 의한 처리는 대조된 이중특이적 항체에 비해 종양 성장에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, N297A 돌연변이를 단독으로 또는 K322A 돌연변이와 조합하여 포함하는 HER2 이중특이성 항체로 처리하면 종양 성장을 완전히 정지시킬 수 있었습니다.침묵 돌연변이가 있는 그룹의 경우, T 세포 발광 신호는 주사 후 3일째에 더 높은 피크에 도달했고, 대조된 이중특이적 항체 및 침묵되지 않은 HER2 이중특이적 항체와 비교하여 더 높은 수준으로 지속되었습니다. 신경모세포종 환자 유래 이종이식편을 보유한 마우스는 Ly6C 양성 대식세포의 고갈이 종양에 대한 T 세포 귀환을 유의하게 증가시켜 종양 성장을 감소시키고 생존을 연장하는 것으로 나타났습니다. 그 효과는 골육종 환자 유래 이종이식편에서 더 두드러졌다.종양 항원 STEAP1을 표적으로 하는 이중특이적 항체 중에서, IGGL SCFV 형식은 치료 기간 동안 지속되는 T 세포의 첫 번째 투여 후 6일째에 유의하게 더 많은 T 세포 침윤을 초래했습니다. 이러한 관찰은 시험관내 세포독성 분석에 의해 예측되지 않았다. 생체 내에서 T 세포를 추적한 후에도 사용자는 면역조직화학을 수행하여 T 세포가 종양 또는 기타 정상 조직 내에서 어디에 위치하는지 보다 구체적으로 결정할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

연구

암 연구학

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

SiRNA 암 세포에 배달에 대 한 Exosomes의 준비

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다.

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

암 치료를 위한 사이토카인 유발 킬러 T 세포의 격리 및 확장

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...