Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Vladimir Ponomarev for å dele luciferase-konstruksjonene som brukes i forsøkene beskrevet i delen om representative resultater i denne artikkelen.

Følgende prosedyrer er evaluert og godkjent av Memorial Sloan Ketterings Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Transfeksjon av 293T-celler med luciferase og høsting av viral supernatant
<ol><li>Kultur av 293T-celler<ol><li>Forbered media ved å legge følgende til en liter DMEM hver: 110 ml varmeinaktivert føtal bovint serum (FBS), 11 ml penicillin-streptomycin.</li>
		<li>Tine 5 x 106 293T-celler og overføre dem til en T175-kolbe med mediet klargjor...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

Mens T-BsAb blinatumomab er godkjent for CD19-positive hematologiske maligniteter, har vellykket implementering av T-BsAbs i solide tumorer vist seg mye vanskeligere. Catumaxomab, et T-BsAb rettet mot epitelcelleadhesjonsmolekyl (EPCAM), ble godkjent for behandling av ondartede ascites hos eggstokkreftpasienter, men produksjonen av legemidlet ble senere stanset av kommersielle årsaker19. Ingen andre T-BsAbs har blitt godkjent for solide svulster, noe som understreker utfordringene forbundet med d...

T-celleengasjerende bispesifikke antistoffer (T-BsAbs) er konstruerte antistoffer som brukes til å gi kunstig spesifisitet til polyklonale T-celler ved å engasjere T-celler gjennom en bindende arm og et tumorantigen gjennom en annen bindende arm. Denne teknologien har blitt brukt på hematologiske kreftformer (CD19-målrettede blinatumomab1), og mange T-BsAbs er i preklinisk og klinisk utvikling for en rekke solide svulster også2. T-BsAbs engasjerer polyklonale T-celler på en viktig histokompatibilitetskompleks (MHC) -uavhengig måte, og derfor er selv svulster som nedregulerer humane leukocyttantigener (HLA) utsatt for denne typen terapi 3,4. T-BsAbs har blitt utviklet i dusinvis av forskjellige formater, med forskjeller i valens og romlig arrangement av T-celle- og tumorbindende armer, interdomeneavstander og inkludering av et Fc-domene, som påvirker halveringstiden og kan indusere effektorfunksjoner hvis de er tilstede5. Tidligere arbeid i vårt laboratorium har vist at disse faktorene signifikant påvirker antitumoreffekten av T-BsAbs, med opptil 1000 ganger forskjeller i potens6. Gjennom dette arbeidet identifiserte vi IgG-[L]-scFv-formatet som den ideelle plattformen for T-BsAbs (se avsnittet Representative resultater for mer informasjon om T-BsAb-formater), og har brukt denne plattformen på mål inkludert GD2 (neuroblastom), HER2 (brystkreft og osteosarkom), GPA33 (kolorektal kreft), STEAP1 (Ewing sarkom), CD19 (B-celle maligniteter) og CD33 (B-celle maligniteter)7, 8,9,10,11,12,13.
En av de store utfordringene for å lykkes med å implementere T-BsAb-terapi i solide svulster er å overvinne et immunosuppressivt tumormikromiljø (TME) for å drive T-celletrafikk til svulster14. Faktorene som påvirker T-BsAb-effekten beskrevet ovenfor har en signifikant innvirkning på T-BsAbs evne til effektivt å indusere T-cellehoming til svulster, men denne effekten er vanskelig å evaluere i et in vivo-system i sanntid. Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av bruken av luciferase-transduserte T-celler i prekliniske studier av T-BsAbs for å evaluere T-celletrafikk til forskjellige vev i eksperimentelle immunkompromitterte musemodeller under behandling. Det overordnede målet med denne metoden er å gi et middel til å evaluere T-celleinfiltrasjon i svulster og annet vev, samt sanntidsinnsikt i T-celle homing kinetikk og utholdenhet, uten å måtte ofre dyr under behandling. For det økende antall forskere som fokuserer på cellulære immunterapier, er evnen til å spore T-celler in vivo i prekliniske dyremodeller avgjørende. Vi tar sikte på å gi en grundig, detaljert beskrivelse av metoden vi har brukt for å spore luciferase-transducerte T-celler for å gjøre det mulig for andre forskere å enkelt replikere denne teknikken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

T-celleengasjerende bispesifikke antistoffer (T-BsAbs) er i ulike stadier av preklinisk utvikling og klinisk testing for solide svulster. Faktorer som valens, romlig arrangement, interdomain avstand og Fc-mutasjoner påvirker antitumoreffekten av disse terapiene, ofte ved å påvirke homing av T-celler til svulster, noe som fortsatt er en stor utfordring. Her beskriver vi en metode for å transdusere aktiverte humane T-celler med luciferase, noe som tillater in vivo-sporing av T-celler under T-BsAb-terapistudier. T-BsAbs evne til å omdirigere T-celler til svulster kan kvantitativt evalueres på flere tidspunkter under behandlingen, slik at forskere kan korrelere antitumoreffekten av T-BsAbs og andre inngrep med utholdenheten av T-celler i svulster. Denne metoden lindrer behovet for å ofre dyr under behandling for histologisk å vurdere T-celleinfiltrasjon og kan gjentas på flere tidspunkter for å bestemme kinetikken til T-cellehandel under og etter behandling.

Som beskrevet i trinn 4.3, kan mus orienteres i forskjellige posisjoner under avbildning for å evaluere tilstedeværelsen av T-celler i forskjellige vev. Liggende posisjonering gjør det mulig å vurdere T-celler i lungene, noe som er vanlig tidlig etter injeksjon. Lateral posisjonering med subkutan xenograft vendt opp brukes for best å vurdere T-celletrafikk til svulsten. Kvinnelige C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac mus ble brukt til alle eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet. <s...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Her beskriver vi en metode for å transdusere humane T-celler med luciferase for å lette in vivo-sporing av bispesifikk antistoffindusert T-celletrafikk til svulster i studier for å evaluere antitumoreffekten og mekanismen til T-celleengasjerende bispesifikke antistoffer.

Sporing av bispesifikk antistoffindusert T-cellehandel ved bruk av Luciferase-transducerte humane T-celler

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Denne metoden lar brukerne enkelt spore T-celler in vivo for å evaluere kinetikken til homing og for å overvåke T-cellenes utholdenhet. Den største fordelen med denne teknikken er at den kan gjentas på flere tidspunkter på samme dyr uten å kreve ofre i flowcytometri eller immunhistokjemi. Denne teknikken kan modifiseres for å spore andre typer immunceller også.For å dyrke 293T-celler, lag en liter DMEM ved å tilsette 110 ml varmeinaktivert føtal bovint serum og 11 ml penicillin streptomycin. Tine fem ganger 10 til den sjette 293T-cellen og overfør dem til en T175-kolbe som inneholder DMEM. Del cellene en til 10 hver tredje dag i seks dager før cellene blir mer enn 90% sammenflytende.For transfeksjon, overfør 1,5 ml media til to 50 milliliter rør ved hjelp av en pipette. Til ett rør, tilsett 10 mikrogram VSVG-plasmid, 20 mikrogram gag pol og 20 mikrogram klikkbillerød TDtomato eller CBRTDR luciferaseplasmid og bland. Tilsett 100 mikroliter DNA in vitro transfeksjonsreagens til et annet rør og bland.Inkuber begge rørene ved romtemperatur i fem minutter. Overfør mediet som inneholder DNA in vitro transfeksjonsreagenset dråpevis til røret som inneholder DNA-plasmidene og bland forsiktig med en pipette. Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter.Under inkubasjon, løsne 293T-cellene ved å legge til fem til 10 milliliter 0, 05% trypsin. Når cellene har løsnet, tilsett 10 ml media og sentrifuge ved 800 G i fem minutter. Resuspender cellene i 1, 5 ml media.Tilsett mediet som inneholder DNA in vitro transfeksjonsreagens og DNA-plasmidene til 293T-cellene og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Etter inkubering, overfør suspensjonen til en T175-kolbe. Tilsett 18 milliliter media og inkuber ved 37 grader Celsius over natten.Neste dag, aspirer mediet forsiktig med en glasspipette uten å løsne cellene og erstatt den med 18 ml ferske medier. Igjen, ruge over natten ved 37 grader Celsius. Neste dag, fjern den virale supernatanten ved hjelp av en pipette satt på is og sentrifuge ved 800 G i fem minutter for å pelletere cellene og ruskene.Filtrer den virale supernatanten ved hjelp av et 0,22 mikron filter og legg den umiddelbart på is. For in vitro aktivering av humane T-celler, tilsett 10 ml PBS inneholdende 0,1% bovint serumalbumin eller BSA og to millimolar EDTA til et sterilt 15 milliliter rør. For å vaske perlene, legg deretter perler i et rør og legg røret i et magnetisk stativ.Etter to minutter, fjern PBS fra røret. Etter å ha forberedt DMEM, tilsett vasket perler og interleukin-2 eller IL-2 til en endelig konsentrasjon på 30 internasjonale enheter per milliliter. Tell T-cellene ved hjelp av et hemocytometer og Trypan-blå flekk.Etter telling, tilsett ønsket antall T-celler til mediet og inverter forsiktig røret for å blande. Plate 2, 5 milliliter media som inneholder to millioner T-celler, perler og IL-2 i hver brønn i en 24-brønns vevskulturplate. Kultur ved 37 grader Celsius i fuktet 5% karbondioksid.Undersøk T-cellene under et 20X objektiv hver dag i tre dager for å bestemme når du skal transdusere med luciferase. For å forberede en RetroNectin-plate, tilsett deretter to milliliter 20 mikrogram per milliliter RetroNectin i PBS til en brønn med en ubehandlet seksbrønnplate og inkuber i to timer ved romtemperatur. Aspirer RetroNectin uten å skrape bunnen av platen og tilsett tre milliliter 2% BSA i PBS per brønn i seksbrønnsplaten.Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Neste, for spinoculation, aspirer BSA og vask brønnene en gang med tre milliliter PBS. Fortsett eller erstatt med fersk PBS og la platen være dekket ved fire grader Celsius over natten.Neste dag, tilsett to milliliter CBRTDR luciferase viral supernatant per brønn og sentrifuge ved 1.240 G i 90 minutter ved 32 grader Celsius. For transduksjon, etter å ha talt T-cellene, aspirer den virale supernatanten og plate to millioner T-celler per brønn i seks milliliter DMEM som inneholder 30 internasjonale enheter per milliliter humant IL-2. Undersøk T-cellene i to dager.Når cellene er nesten sammenflytende, vask dem forsiktig av bunnen av platen med en pipette og overfør hver brønn til en separat T75-kolbe. Tilsett ni milliliter medier for totalt 15 milliliter volum per kolbe. Neste dag, tilsett 15 ml media og bekreft vellykket transduksjon ved å utføre flowcytometri.Etter bedøvelse av musen, ved hjelp av en 26 gauge nål, injiser 20 millioner T-celler i 100 mikroliter media retroorbitalt. Administrer 1 000 enheter rekombinant IL-2 subkutant for å støtte T-celleoverlevelse in vivo. Deretter administreres det bispesifikke antistoffet retroorbitalt eller intraperitonealt.For in vivo avbildning, administrer 100 mikroliter av tre milligram D-luciferin ved retroorbital injeksjon med en 26 gauge nål i en bedøvet mus. For å ta bilder, plasser musen i det lyse, tette kammeret til bildeapparatet slik at flanken som bærer xenograftet, vender opp mot kameraet. Bruk oppkjøpskontrollpanelet til å velge luminescerende, fotografi og overlegg.Still inn eksponeringstiden til auto, binning til medium og f-stop til én og hent bilder. Etter det første bildet stiller du inn eksponeringstiden slik at den samsvarer med den som automatisk beregnes for det første bildet, slik at påfølgende bilder kan sammenlignes direkte. Ta et annet sett med bilder med musen liggende for å evaluere T-celle tilstedeværelse i lungene.Væpnede T-celler trafikkerte til svulsten raskere enn ubevæpnede T-celler, og forlot lungene to dager tidligere. Kvantifisering av T-celleinfiltrasjon i svulster over tid ble målt ved bioluminescens og uttrykt som totale flokker eller utstråling per piksel integrert over tumorkonturen. T-cellehandel kunne overvåkes i 28 dager etter injeksjon av luciferase-transducerte T-celler, noe som muliggjorde sporing av T-cellehus og utholdenhet gjennom hele behandlingen.T-celletrafikk til HER2-positive humane brystkreftpasienter med pasientavledede xenotransplantater i DKO-mus er vist. Behandling med HER2 bispesifikt antistoff med udempet FC hadde ingen effekt på tumorvekst sammenlignet med et kontrollert bispesifikt antistoff. I motsetning til dette var behandling med HER2 bispesifikt antistoff inneholdende N297A-mutasjon alene eller i kombinasjon med en K322A-mutasjon i stand til å stoppe tumorveksten helt.For grupper med mutasjonene for deaktivering nådde T-celleluminescenssignalet en høyere topp på dag tre etter injeksjon og vedvarte på et høyere nivå sammenlignet med det kontrollerte bispesifikke antistoffet og det ulydige HER2 bispesifikke antistoffet. Musbærende nevroblastom pasientderiverte xenotransplantater viste uttømming av Ly6C positive makrofager økte signifikant T-cellehoming til svulster, noe som resulterte i redusert tumorvekst og forlenget overlevelse. Effekten var mer uttalt ved osteosarkom pasientderiverte xenotransplantater.Blant bispesifikke antistoffer rettet mot tumorantigenet STEAP1 resulterte IGGL SCFV-formatet i signifikant mer T-celleinfiltrasjon på dag seks etter den første dosen av T-celler som vedvarte så lenge behandlingen varte. Slike observasjoner ble ikke forutsagt ved hjelp av in vitro cytotoksisitetstester. Etter sporing av T-celler in vivo, kan brukerne fortsatt utføre immunhistokjemi for å bestemme mer spesifikt hvor T-cellene befinner seg i svulsten eller annet normalt vev.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En Portal Vein Injection modell for å studere levermetastaser fra brystkreft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fargelysfluorescensimmunohistokjemi av T-celle-subpopulasjoner i Archival Formalin-fikserte, paraffin-innebygde humane Orofaryngeale Squamous Cell Karsinomeksempler

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatt CD8 T-lymfocytter i menneskelig lunge svulst skiver bruker AC Confocal mikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

En Syngeneic mus B-celle lymfom modell for pre-klinisk evaluering av CD19 bil T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En Spheroid drapet analysen av bilen T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Utarbeidelse av Exosomes for siRNA levering til kreftceller

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Bruke CRISPR/Cas9 å Knock Out GM-CSF i CAR-T celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fremstilling chimeric antigen reseptor (CAR) T celler for adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolasjon og utvidelse av cytotoktoktokin-indusert killer T-celler for kreftbehandling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...