Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Vladimir Ponomarev por compartilhar os construtos de luciferase usados nos experimentos descritos na seção de resultados representativos deste artigo.

Os procedimentos a seguir foram avaliados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Memorial Sloan Kettering.
1. Transfecção de células 293T com luciferase e colheita do sobrenadante viral
<ol><li>Cultura de células 293T<ol><li>Preparar o meio adicionando a um litro de DMEM cada: 110 mL de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor, 11 mL de penicilina-estreptomicina.</li>
		<li>Descongelar células 5 x 106 293T e transferi-las p...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

Enquanto o T-BsAb blinatumomab foi aprovado para neoplasias hematológicas CD19-positivas, a implementação bem-sucedida de T-BsAbs em tumores sólidos tem se mostrado muito mais difícil. O catumaxomabe, um T-BsAb dirigido contra a molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM), foi aprovado para o tratamento de ascite maligna em pacientes com câncer de ovário, mas a produção do fármaco foi posteriormente interrompida por razões comerciais19. Nenhum outro T-BsAbs foi aprovado para tum...

Os anticorpos biespecíficos que envolvem células T (T-BsAbs) são anticorpos projetados usados para fornecer especificidade artificial às células T policlonais, engajando as células T através de um braço de ligação e um antígeno tumoral através de outro braço de ligação. Essa tecnologia tem sido aplicada com sucesso em cânceres hematológicos (blinatumomab1 direcionado para CD19), e numerosos T-BsAbs estão em desenvolvimento pré-clínico e clínico para uma variedade de tumores sólidos também2. Os T-BsAbs envolvem células T policlonais de maneira independente do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e, portanto, mesmo tumores que regulam negativamente os antígenos leucocitários humanos (HLAs) são suscetíveis a esse tipo de terapia 3,4. Os T-BsAbs foram desenvolvidos em dezenas de formatos diferentes, com diferenças na valência e arranjo espacial dos braços de ligação de células T e tumores, distâncias interdomínios e a inclusão de um domínio Fc, que afeta a meia-vida e pode induzir funções efetoras sepresente5. Trabalhos anteriores em nosso laboratório mostraram que esses fatores afetam significativamente a eficácia antitumoral dos T-BsAbs, com diferenças de até 1.000 vezes napotência6. Através deste trabalho, identificamos o formato IgG-[L]-scFv como a plataforma ideal para T-BsAbs (veja a seção Resultados Representativos para mais detalhes sobre os formatos T-BsAb), e aplicamos essa plataforma a alvos incluindo GD2 (neuroblastoma), HER2 (câncer de mama e osteossarcoma), GPA33 (câncer colorretal), STEAP1 (sarcoma de Ewing), CD19 (malignidades de células B) e CD33 (malignidades de células B)7, 8,9,10,11,12,13.
Um dos principais desafios para implementar com sucesso a terapia com T-BsAb em tumores sólidos é superar um microambiente tumoral imunossupressor (TME) para direcionar o tráfego de células T para tumores14. Os fatores que afetam a eficácia do T-BsAb descritos acima têm um impacto significativo na capacidade dos T-BsAbs de induzir efetivamente o homing de células T para tumores, mas esse efeito é difícil de avaliar em um sistema in vivo em tempo real. Este manuscrito fornece uma descrição detalhada do uso de células T transduzidas por luciferase em estudos pré-clínicos de T-BsAbs para avaliar o tráfego de células T para vários tecidos em modelos experimentais de camundongos imunocomprometidos durante o tratamento. O objetivo geral deste método é fornecer um meio para avaliar a infiltração de células T em tumores e outros tecidos, bem como informações em tempo real sobre a cinética e persistência de células T, sem a necessidade de sacrificar animais durante o tratamento. Para o número crescente de pesquisadores com foco em imunoterapias celulares, a capacidade de rastrear células T in vivo em modelos animais pré-clínicos é crucial. Nosso objetivo é fornecer uma descrição completa e detalhada do método que empregamos para rastrear células T transduzidas por luciferase para permitir que outros pesquisadores repliquem facilmente esta técnica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

Os anticorpos biespecíficos que envolvem células T (T-BsAbs) estão em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e testes clínicos para tumores sólidos. Fatores como valência, arranjo espacial, distância entre domínios e mutações Fc afetam a eficácia antitumoral dessas terapias, comumente influenciando o homing de células T para tumores, o que continua sendo um grande desafio. Aqui, descrevemos um método para transduzir células T humanas ativadas com luciferase, permitindo o rastreamento in vivo de células T durante estudos de terapia com T-BsAb. A capacidade dos T-BsAbs de redirecionar células T para tumores pode ser avaliada quantitativamente em vários momentos durante o tratamento, permitindo que os pesquisadores correlacionem a eficácia antitumoral de T-BsAbs e outras intervenções com a persistência de células T em tumores. Este método alivia a necessidade de sacrificar animais durante o tratamento para avaliar histologicamente a infiltração de células T e pode ser repetido em vários pontos de tempo para determinar a cinética de tráfego de células T durante e após o tratamento.

Como descrito na etapa 4.3, camundongos podem ser orientados em diferentes posições durante a aquisição de imagens para avaliar a presença de células T em diferentes tecidos. O posicionamento supino permite a avaliação das células T nos pulmões, o que é comum nos primeiros momentos após a injeção. O posicionamento lateral com o xenoenxerto subcutâneo virado para cima é usado para melhor avaliar o tráfego de células T para o tumor. Camundongos fêmeas C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug...

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Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Aqui, descrevemos um método para transdução de células T humanas com luciferase para facilitar o rastreamento in vivo do tráfego de células T induzido por anticorpos biespecíficos para tumores em estudos para avaliar a eficácia antitumoral e o mecanismo de anticorpos biespecíficos que envolvem células T.

Rastreando o Tráfico de Células T Induzido por Anticorpos Biespecíficos Usando Células T Humanas Transduzidas por Luciferase

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Este método permite que os usuários rastreiem facilmente as células T in vivo para avaliar a cinética de homing e monitorar a persistência das células T. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser repetida em vários momentos no mesmo animal sem a necessidade de sacrifício em citometria de fluxo ou imunohistoquímica. Essa técnica também pode ser modificada para rastrear outros tipos de células imunológicas.Para cultivar células 293T, preparar um litro de DMEM adicionando 110 mililitros de soro fetal bovino inativado pelo calor e 11 mililitros de estreptomicina com penicilina. Descongelar cinco vezes 10 até a sexta célula 293T e transferi-las para um frasco T175 contendo DMEM. Divida as células de uma a 10 a cada três dias por seis dias antes que as células se tornem mais de 90% confluentes.Para transfecção, transfira 1,5 mililitros de meio para dois tubos de 50 mililitros usando uma pipeta. Para um tubo, adicione 10 microgramas de plasmídeo VSVG, 20 microgramas de pol de mordaça e 20 microgramas de plasma de escaravelho vermelho ou CBRTDR luciferase plasmídeo e misture. Adicionar 100 microlitros de DNA in vitro transfecção reagente a outro tubo e misturar.Incubar ambos os tubos à temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfira o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA gota a gota para o tubo contendo os plasmídeos de DNA e misture suavemente com uma pipeta. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos.Durante a incubação, destacar as células 293T adicionando cinco a 10 mililitros de tripsina a 0,05%. Depois que as células se desprenderem, adicione 10 mililitros de meio e centrifugue a 800 G por cinco minutos. Ressuspenda as células em 1,5 mililitros de meio.Adicionar o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA e os plasmídeos de DNA às células 293T e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, transferir a suspensão para um balão T175. Adicione 18 mililitros de mídia e incube a 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta de vidro sem desprender as células e substituí-lo por 18 mililitros de meio fresco. Novamente, incube durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova o sobrenadante viral usando uma pipeta colocada no gelo e centrifuga a 800 G por cinco minutos para peletizar as células e detritos.Filtre o sobrenadante viral usando um filtro de 0,22 mícron e coloque-o imediatamente no gelo. Para ativação in vitro de células T humanas, adicionar 10 mililitros de PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino ou BSA e dois EDTA milimolares a um tubo estéril de 15 mililitros. Em seguida, para lavar as contas, adicione contas em um tubo e coloque o tubo em um rack magnético.Após dois minutos, retire o PBS do tubo. Após o preparo do DMEM, adicionar as esferas lavadas e a interleucina-2 ou IL-2 a uma concentração final de 30 unidades internacionais por mililitro. Conte as células T usando um hemocitômetro e coloração com azul de Trypan.Após a contagem, adicione o número desejado de células T ao meio e inverta suavemente o tubo para misturar. Placa de 2,5 mililitros de meio contendo dois milhões de células T, contas e IL-2 em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Cultura a 37 graus Celsius em dióxido de carbono umidificado a 5%.Examinar as células T sob uma objetiva de 20X todos os dias durante três dias para determinar quando transduzir com luciferase. Em seguida, para preparar uma placa de RetroNectina, adicione dois mililitros de 20 microgramas por mililitro de RetroNectina em PBS a um poço de uma placa de seis poços não tratada e incube por duas horas à temperatura ambiente. Aspirar a RetroNectina sem riscar o fundo da placa e adicionar três mililitros de 2% BSA em PBS por poço na placa de seis poços.Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, para espinoculação, aspirar a BSA e lavar os poços uma vez com três mililitros de PBS. Continue ou substitua por PBS fresco e deixe a placa coberta a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, adicione dois mililitros de sobrenadante viral CBRTDR luciferase por poço e centrífuga a 1.240 G por 90 minutos a 32 graus Celsius. Para a transdução, após a contagem das células T, aspirar o sobrenadante viral e placa dois milhões de células T por poço em seis mililitros de DMEM contendo 30 unidades internacionais por mililitro de IL-2 humana. Examine as células T por dois dias.Quando as células estiverem quase confluentes, lave-as suavemente do fundo da placa usando uma pipeta e transfira cada poço para um balão T75 separado. Adicionar nove mililitros de meio para um volume total de 15 mililitros por frasco. No dia seguinte, adicione 15 mililitros de meio e confirme o sucesso da transdução realizando citometria de fluxo.Após anestesiar o camundongo, com agulha calibre 26, injetar retroorbitalmente 20 milhões de células T em 100 microlitros de meio. Administrar 1.000 unidades de IL-2 recombinante por via subcutânea para apoiar a sobrevivência de células T in vivo. Em seguida, administrar o anticorpo biespecífico retroorbital ou intraperitonealmente.Para exames de imagem in vivo, administrar 100 microlitros de três miligramas de D-luciferina por injeção retroorbital com uma agulha calibre 26 em um camundongo anestesiado. Para capturar imagens, coloque o mouse na câmara apertada do imageador de tal forma que o flanco que suporta o xenoenxerto esteja voltado para cima em direção à câmera. Usando o painel de controle de aquisição, selecione luminescente, fotografia e sobreposição.Defina o tempo de exposição para automático, o binning para médio e f-stop para um e adquira imagens. Após a primeira imagem, defina o tempo de exposição para corresponder ao calculado automaticamente para a primeira imagem para que as imagens subsequentes possam ser comparadas diretamente. Tire outro conjunto de imagens com o camundongo em decúbito dorsal para avaliar a presença de células T nos pulmões.As células T armadas traficavam para o tumor mais rapidamente do que as células T desarmadas, deixando os pulmões dois dias mais cedo. A quantificação da infiltração de células T nos tumores ao longo do tempo foi medida por bioluminescência e expressa como bandos totais ou radiância por pixel integrada sobre o contorno tumoral. O tráfego de células T pode ser monitorado por 28 dias após a injeção das células T transduzidas pela luciferase, permitindo rastrear o homing de células T e a persistência durante todo o tratamento.O tráfico de células T para xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama humano HER2 positivo em camundongos DKO é mostrado. O tratamento com o anticorpo biespecífico HER2 com uma CF não silenciada não teve efeito sobre o crescimento tumoral em comparação com um anticorpo biespecífico controlado. Em contraste, o tratamento com o anticorpo biespecífico HER2 contendo a mutação N297A isoladamente ou em combinação com uma mutação K322A foi capaz de interromper completamente o crescimento do tumor.Para os grupos com as mutações silenciadoras, o sinal de luminescência das células T atingiu um pico mais alto no terceiro dia pós-injeção e persistiu em um nível mais alto em comparação com o anticorpo biespecífico controlado e o anticorpo biespecífico HER2 não silenciado. Camundongos portadores de xenoenxertos derivados de pacientes com neuroblastoma demonstraram que a depleção de macrófagos positivos para Ly6C aumentou significativamente o homing de células T para tumores, resultando em diminuição do crescimento tumoral e sobrevida prolongada. O efeito foi mais pronunciado nos xenoenxertos derivados de pacientes com osteossarcoma.Entre os anticorpos biespecíficos direcionados ao antígeno tumoral STEAP1, o formato IGGL SCFV resultou em significativamente mais infiltração de células T no sexto dia após a primeira dose de células T, que persistiu durante o tratamento. Tais observações não foram previstas por ensaios de citotoxicidade in vitro. Depois de rastrear as células T in vivo, os usuários ainda podem realizar imunohistoquímica para determinar mais especificamente onde as células T estão localizadas dentro do tumor ou outros tecidos normais.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Pesquisa do câncer

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Imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores das subpopulações de células T em amostras de carcinoma de células escamosas humano oftaríngeas fixadas em formalina, arquivadas, formadas por formalina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Um modelo de linfoma de célula B Syngeneic Mouse para avaliação pré-clínica de pilhas de T de carro CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Preparação do Exosomes de siRNA entrega para as células cancerosas

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolamento e Expansão de células T assassinas induzidas por citocina para tratamento de câncer

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...