Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Владимира Пономарева за то, что он поделился конструкциями люциферазы, используемыми в экспериментах, описанных в разделе репрезентативных результатов этой статьи.

Следующие процедуры были оценены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Memorial Sloan Kettering.
1. Трансфекция 293Т-клеток люциферазой и сбор вирусной надосадочной жидкости
<ol><li>Культура клеток 293Т<ol><li>Приготовьте среду, добавив в литр DMEM по 110 мл ина...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

В то время как B-BsAb блинатумомаб был одобрен для CD19-положительных гематологических злокачественных новообразований, успешное внедрение T-BsAb в солидных опухолях оказалось гораздо более трудным. Катумаксомаб, T-BsAb, направленный против молекулы адгезии эпителиальных клеток (EPCAM), был одобр...

Биспецифические антитела, вовлекающие Т-клетки (T-BsAbs), представляют собой сконструированные антитела, используемые для обеспечения искусственной специфичности к поликлональным Т-клеткам путем вовлечения Т-клеток через одно связывающее плечо и опухолевого антигена через другое связывающее звено. Эта технология была успешно применена к гематологическим раковым заболеваниям (блинатумомаб1, нацеленный на CD19), и многочисленные T-BsAb находятся в доклинической и клинической разработке для различных солидных опухолей2. T-BsAb вовлекают поликлональные Т-клетки независимым от основного комплекса гистосовместимости (MHC) образом, и поэтому даже опухоли, которые подавляют лейкоцитарные антигены человека (HLA), восприимчивы к этому типу терапии 3,4. T-BsAb были разработаны в десятках различных форматов, с различиями в валентности и пространственном расположении плеч связывания Т-клеток и опухоли, междоменных расстояниях и включении Fc-домена, который влияет на период полувыведения и может индуцировать эффекторные функции, если они присутствуют5. Предыдущая работа в нашей лаборатории показала, что эти факторы значительно влияют на противоопухолевую эффективность T-BsAbs, с 1000-кратными различиями в потенции6. В ходе этой работы мы определили формат IgG-[L]-scFv как идеальную платформу для T-BsAb (см. Раздел «Репрезентативные результаты» для получения более подробной информации о форматах T-BsAb) и применили эту платформу к мишеням, включая GD2 (нейробластома), HER2 (рак молочной железы и остеосаркома), GPA33 (колоректальный рак), STEAP1 (саркома Юинга), CD19 (злокачественные новообразования В-клеток) и CD33 (злокачественные новообразования В-клеток)7, 8,9,10,11,12,13.
Одной из основных проблем для успешного внедрения терапии T-BsAb в солидных опухолях является преодоление иммуносупрессивного микроокружения опухоли (TME) для стимулирования транспортировки Т-клеток к опухолям14. Факторы, влияющие на эффективность T-BsAb, описанные выше, оказывают значительное влияние на способность T-BsAb эффективно индуцировать самонаведение Т-клеток к опухолям, но этот эффект трудно оценить в системе in vivo в режиме реального времени. Эта рукопись содержит подробное описание использования трансдуцированных люциферазой Т-клеток в доклинических исследованиях T-BsAb для оценки трафика Т-клеток в различные ткани на экспериментальных моделях мышей с ослабленным иммунитетом во время лечения. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы предоставить средства для оценки инфильтрации Т-клеток в опухолях и других тканях, а также понимание кинетики и персистенции Т-клеток в режиме реального времени без необходимости приносить в жертву животных во время лечения. Для растущего числа исследователей, специализирующихся на клеточной иммунотерапии, способность отслеживать Т-клетки in vivo на доклинических моделях животных имеет решающее значение. Мы стремимся предоставить тщательное, подробное описание метода, который мы использовали для отслеживания Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, чтобы другие исследователи могли легко воспроизвести этот метод.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

Биспецифические антитела, вовлекающие Т-клетки (T-BsAbs), находятся на различных стадиях доклинической разработки и клинических испытаний на солидные опухоли. Такие факторы, как валентность, пространственное расположение, междоменное расстояние и мутации Fc, влияют на противоопухолевую эффективность этих методов лечения, обычно влияя на самонахождение Т-клеток в опухолях, что остается серьезной проблемой. Здесь мы описываем метод трансдукции активированных Т-клеток человека люциферазой, позволяющий in vivo отслеживать Т-клетки во время исследований терапии T-BsAb. Способность T-BsAb перенаправлять Т-клетки на опухоли может быть количественно оценена в несколько моментов времени во время лечения, что позволяет исследователям коррелировать противоопухолевую эффективность T-BsAbs и других вмешательств с персистенцией Т-клеток в опухолях. Этот метод избавляет от необходимости приносить в жертву животных во время лечения для гистологической оценки инфильтрации Т-клеток и может повторяться в несколько моментов времени для определения кинетики торговли Т-клетками во время и после лечения.

Как описано на шаге 4.3, мыши могут быть ориентированы в разных положениях во время визуализации для оценки присутствия Т-клеток в различных тканях. Положение лежа на спине позволяет оценить наличие Т-клеток в легких, что является обычным явлением в ранние моменты времени после инъекции....

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Здесь мы описываем метод трансдукции Т-клеток человека люциферазой для облегчения отслеживания in vivo индуцированного биспецифическими антителами транспорта Т-клеток к опухолям в исследованиях для оценки противоопухолевой эффективности и механизма биспецифических антител, вовлекающих Т-клетки.

Отслеживание индуцированного биспецифическими антителами трафика Т-клеток с использованием Т-клеток человека, трансдуцированных люциферазой

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Этот метод позволяет пользователям легко отслеживать Т-клетки in vivo, оценивать кинетику самонаведения и контролировать персистенцию Т-клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что его можно повторять в несколько моментов времени на одном и том же животном, не требуя жертв при проточной цитометрии или иммуногистохимии. Этот метод может быть модифицирован для отслеживания других типов иммунных клеток.Чтобы культивировать 293Т-клетки, приготовьте один литр DMEM, добавив 110 миллилитров инактивированной теплом эмбриональной бычьей сыворотки и 11 миллилитров пенициллина стрептомицина. Разморозьте пять раз по 10 до шестой ячейки 293T и перенесите их в колбу T175, содержащую DMEM. Разделяйте клетки от одного до 10 каждые три дня в течение шести дней, прежде чем клетки станут более чем на 90% сливающимися.Для трансфекции перенесите 1,5 миллилитра среды в две 50-миллилитровые пробирки с помощью пипетки. В одну пробирку добавьте 10 мкг плазмиды VSVG, 20 мкг gag pol и 20 мкг плазмиды люциферазы красного TDtomato или CBRTDR и перемешайте. Добавьте 100 микролитров реагента для трансфекции ДНК in vitro в другую пробирку и перемешайте.Инкубируйте обе пробирки при комнатной температуре в течение пяти минут. Перенесите среду, содержащую реагент для трансфекции ДНК in vitro, по каплям в пробирку, содержащую плазмиды ДНК, и аккуратно перемешайте пипеткой. Выдерживать при комнатной температуре 20 минут.Во время инкубации отделите клетки 293T, добавив от пяти до 10 миллилитров 0,05% трипсина. После того, как клетки отсоединились, добавьте 10 миллилитров среды и центрифугу при 800 G в течение пяти минут. Ресуспендируют клетки в 1,5 миллилитрах среды.Добавьте среду, содержащую реагент для трансфекции ДНК in vitro, и плазмиды ДНК в клетки 293T и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации переложите суспензию в колбу Т175. Добавьте 18 миллилитров среды и выдержите при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.На следующий день осторожно аспирируйте носитель стеклянной пипеткой, не отрывая клеток, и замените его 18 миллилитрами свежего носителя. Опять же, инкубируйте ночь при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующий день удалите вирусную надосадочную жидкость с помощью пипетки, помещенной на лед, и центрифугируйте при 800 г в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки и мусор.Отфильтруйте вирусную надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,22 микрона и сразу же поместите ее на лед. Для активации in vitro Т-клеток человека добавьте 10 миллилитров PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина или BSA, и два миллимоляра ЭДТА в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Затем, чтобы промыть бусины, добавьте бусины в тюбик и поместите тюбик в магнитную стойку.Через две минуты извлеките PBS из трубки. После приготовления DMEM добавьте промытые шарики и интерлейкин-2 или IL-2 до конечной концентрации 30 международных единиц на миллилитр. Подсчитайте Т-клетки с помощью гемоцитометра и окрашивания трипановым синим.После подсчета добавьте желаемое количество Т-клеток в среду и аккуратно переверните пробирку для перемешивания. Планшет 2,5 миллилитра среды, содержащей два миллиона Т-клеток, шариков и IL-2 в каждой лунке 24-луночной пластины для культивирования тканей. Культура при 37 градусах Цельсия в увлажненном 5%-ном углекислом газе.Исследуйте Т-клетки под 20-кратным объективом каждый день в течение трех дней, чтобы определить, когда проводить трансдукцию люциферазой. Затем, чтобы приготовить пластину RetroNectin, добавьте два миллилитра по 20 микрограммов на миллилитр RetroNectin in PBS в лунку необработанной шестилуночной пластины и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре. Аспирируйте RetroNectin, не царапая дно пластины, и добавьте три миллилитра 2% BSA в PBS на лунку в шестилуночную пластину.Выдерживать 30 минут при комнатной температуре. Затем для спинокуляции аспирируйте BSA и один раз промойте лунки тремя миллилитрами PBS. Продолжите или замените свежим PBS и оставьте тарелку покрытой при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.На следующий день добавьте два миллилитра надосадочной жидкости CBRTDR люциферазы на лунку и центрифугу в дозе 1 240 г в течение 90 минут при 32 градусах Цельсия. Для трансдукции, после подсчета Т-клеток, аспирируют вирусную надосадочную жидкость и помещают два миллиона Т-клеток в лунку в шесть миллилитров DMEM, содержащих 30 международных единиц на миллилитр человеческого IL-2. Исследуйте Т-клетки в течение двух дней.Когда ячейки почти сливаются, аккуратно смойте их со дна тарелки с помощью пипетки и переложите каждую лунку в отдельную колбу T75. Добавьте девять миллилитров среды, чтобы получить общий объем 15 миллилитров на колбу. На следующий день добавьте 15 миллилитров среды и подтвердите успешную трансдукцию, выполнив проточную цитометрию.После анестезии мыши с помощью иглы 26 калибра ретроорбитально вводят 20 миллионов Т-клеток в 100 микролитров среды. Подкожно вводят 1 000 единиц рекомбинантного IL-2 для поддержки выживания Т-клеток in vivo. Затем вводят биспецифическое антитело ретроорбитально или внутрибрюшинно.Для визуализации in vivo вводят 100 микролитров трех миллиграммов D-люциферина путем ретроорбитальной инъекции иглой 26 калибра анестезированной мыши. Для захвата изображений поместите мышь в светонепроницаемую камеру тепловизора так, чтобы бок, несущий ксенотрансплантат, был обращен вверх к камере. С помощью панели управления сбором данных выберите люминесцентный, фотографический и наложенный.Установите время экспозиции на «Авто», биннинг на «Средний» и диафрагму на единицу и получайте изображения. После первого изображения установите время экспозиции, соответствующее времени, автоматически рассчитанному для первого изображения, чтобы можно было напрямую сравнивать последующие изображения. Сделайте еще один набор снимков с мышью на спине, чтобы оценить присутствие Т-клеток в легких.Вооруженные Т-клетки доставлялись в опухоль быстрее, чем невооруженные Т-клетки, покидая легкие на два дня раньше. Количественное определение инфильтрации Т-клеток в опухоли с течением времени измерялось с помощью биолюминесценции и выражалось в виде общего количества флок или сияния на пиксель, интегрированный по контуру опухоли. Трафик Т-клеток можно контролировать в течение 28 дней после инъекции Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, что позволяет отслеживать самонахождение и персистенцию Т-клеток на протяжении всего лечения.Показана транспортировка Т-клеток в HER2-положительные ксенотрансплантаты, полученные из пациентов с раком молочной железы человека, у мышей DKO. Лечение биспецифическим антителом HER2 с немолчаливым FC не влияло на рост опухоли по сравнению с контролируемым биспецифическим антителом. Напротив, лечение биспецифическим антителом HER2, содержащим мутацию N297A, отдельно или в сочетании с мутацией K322A, смогло полностью остановить рост опухоли.Для групп с сайленсирующими мутациями сигнал люминесценции Т-клеток достиг более высокого пика на третий день после инъекции и сохранялся на более высоком уровне по сравнению с контролируемым биспецифическим антителом и немолчаливым биспецифическим антителом HER2. Мыши, несущие ксенотрансплантаты, полученные от пациентов с нейробластомой, продемонстрировали, что истощение Ly6C-положительных макрофагов значительно увеличило самонахождение Т-клеток в опухолях, что привело к снижению роста опухоли и увеличению выживаемости. Эффект был более выражен при ксенотрансплантатах, полученных пациентами с остеосаркомой.Среди биспецифических антител, нацеленных на опухолевый антиген STEAP1, формат IGGL SCFV приводил к значительно большей инфильтрации Т-клеток на шестой день после первой дозы Т-клеток, которая сохранялась в течение всего периода лечения. Такие наблюдения не были предсказаны анализами цитотоксичности in vitro. После отслеживания Т-клеток in vivo пользователи все еще могут выполнять иммуногистохимию, чтобы более точно определить, где Т-клетки расположены в опухоли или других нормальных тканях.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Воротной вены для инъекций модель для изучения печени метастазирования рака молочной железы

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Четырехцветная флуоресценция Иммуногистохимия субпопуляций Т-клеток в архивных формалиновых фиксированных, парафиновых встраиваемых образцах проксимальной клеточной карциномы человека

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Мышь сингенных B-клеточной лимфомы модель для предварительно клинической оценки CD19 автомобилей Т-клеток

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Убийство Assay сфероида клетками T автомобилей

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Подготовка Exosomes siRNA доставки раковых клеток

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Использование CRISPR/Cas9 для выбивания GM-CSF в клетках CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Изоляция и расширение цитотоксических цитотинов индуцированных Killer T-клеток для лечения рака

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...