Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
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Los autores desean agradecer al Dr. Vladimir Ponomarev por compartir las construcciones de luciferasa utilizadas en los experimentos descritos en la sección de resultados representativos de este artículo.

Los siguientes procedimientos han sido evaluados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Memorial Sloan Kettering.
1. Transfección de células 293T con luciferasa y recolección de sobrenadante viral
<ol><li>Cultivo de células 293T<ol><li>Prepare los medios agregando lo siguiente a un litro de DMEM cada uno: 110 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 11 ml de penicilina-estreptomicina.</li>
		<li>Descongelar 5 x 106...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

Si bien el Blinatumomab T-BsAb ha sido aprobado para neoplasias hematológicas CD19 positivas, la implementación exitosa de T-BsAbs en tumores sólidos ha demostrado ser mucho más difícil. El catumaxomab, un T-BsAb dirigido contra la molécula de adhesión de células epiteliales (EPCAM), fue aprobado para el tratamiento de la ascitis maligna en pacientes con cáncer de ovario, pero la producción del fármaco se detuvo posteriormente por razones comerciales19. No se han aprobado otros T-BsAb p...

Los anticuerpos biespecíficos que se involucran con células T (T-BsAbs) son anticuerpos diseñados que se usan para proporcionar especificidad artificial a las células T policlonales al involucrar a las células T a través de un brazo de unión y un antígeno tumoral a través de otro brazo de unión. Esta tecnología se ha aplicado con éxito a cánceres hematológicos (blinatumomab1 dirigido a CD19), y numerosos T-BsAbs están en desarrollo preclínico y clínico para una variedad de tumores sólidos también2. Los T-BsAbs involucran a las células T policlonales de una manera independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y, por lo tanto, incluso los tumores que regulan negativamente los antígenos leucocitarios humanos (HLA) son susceptibles a este tipo de terapia 3,4. Los T-BsAbs se han desarrollado en docenas de formatos diferentes, con diferencias en la valencia y disposición espacial de los brazos de unión de células T y tumores, distancias entre dominios y la inclusión de un dominio Fc, que afecta la vida media y puede inducir funciones efectoras si están presentes5. Trabajos previos en nuestro laboratorio han demostrado que estos factores afectan significativamente la eficacia antitumoral de T-BsAbs, con diferencias de hasta 1.000 veces en la potencia6. A través de este trabajo, identificamos el formato IgG-[L]-scFv como la plataforma ideal para T-BsAbs (consulte la sección Resultados representativos para obtener más detalles sobre los formatos T-BsAb), y hemos aplicado esta plataforma a objetivos que incluyen GD2 (neuroblastoma), HER2 (cáncer de mama y osteosarcoma), GPA33 (cáncer colorrectal), STEAP1 (sarcoma de Ewing), CD19 (neoplasias malignas de células B) y CD33 (neoplasias malignas de células B)7, 8,9,10,11,12,13.
Uno de los principales desafíos para implementar con éxito la terapia T-BsAb en tumores sólidos es superar un microambiente tumoral inmunosupresor (TME) para conducir el tráfico de células T a los tumores14. Los factores que afectan la eficacia de T-BsAb descritos anteriormente tienen un impacto significativo en la capacidad de T-BsAbs para inducir eficazmente la orientación de células T a los tumores, pero este efecto es difícil de evaluar en un sistema in vivo en tiempo real. Este manuscrito proporciona una descripción detallada del uso de células T transducidas por luciferasa en estudios preclínicos de T-BsAbs para evaluar el tráfico de células T a diversos tejidos en modelos experimentales de ratones inmunocomprometidos durante el tratamiento. El objetivo general de este método es proporcionar un medio para evaluar la infiltración de células T en tumores y otros tejidos, así como información en tiempo real sobre la cinética y persistencia de las células T, sin la necesidad de sacrificar animales durante el tratamiento. Para el creciente número de investigadores que se centran en las inmunoterapias celulares, la capacidad de rastrear las células T in vivo en modelos animales preclínicos es crucial. Nuestro objetivo es proporcionar una descripción exhaustiva y detallada del método que hemos empleado para rastrear las células T transducidas por luciferasa para permitir que otros investigadores puedan replicar fácilmente esta técnica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

Los anticuerpos biespecíficos que se involucran con células T (T-BSABS) se encuentran en varias etapas de desarrollo preclínico y pruebas clínicas para tumores sólidos. Factores como la valencia, la disposición espacial, la distancia entre dominios y las mutaciones Fc afectan la eficacia antitumoral de estas terapias, comúnmente al influir en la orientación de las células T a los tumores, lo que sigue siendo un desafío importante. Aquí, describimos un método para transducir células T humanas activadas con luciferasa, lo que permite el seguimiento in vivo de las células T durante los estudios de terapia T-BsAb. La capacidad de los T-BsAbs para redirigir las células T a los tumores se puede evaluar cuantitativamente en múltiples puntos temporales durante el tratamiento, lo que permite a los investigadores correlacionar la eficacia antitumoral de los T-BsAbs y otras intervenciones con la persistencia de las células T en los tumores. Este método alivia la necesidad de sacrificar animales durante el tratamiento para evaluar histológicamente la infiltración de células T y puede repetirse en múltiples puntos de tiempo para determinar la cinética del tráfico de células T durante y después del tratamiento.

Como se describe en el paso 4.3, los ratones pueden orientarse en diferentes posiciones durante la obtención de imágenes para evaluar la presencia de células T en diferentes tejidos. La posición supina permite la evaluación de las células T en los pulmones, que es común en los primeros momentos después de la inyección. El posicionamiento lateral con el xenoinjerto subcutáneo hacia arriba se utiliza para evaluar mejor el tráfico de células T al tumor. Se utilizaron ratones hembra C.Cg-Rag2tm1Fwa </sup...

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Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Aquí, describimos un método para transducir células T humanas con luciferasa para facilitar el seguimiento in vivo del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos a tumores en estudios para evaluar la eficacia antitumoral y el mecanismo de anticuerpos biespecíficos que involucran a las células T.

Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Este método permite a los usuarios rastrear fácilmente las células T in vivo para evaluar la cinética del homing y monitorear la persistencia de las células T. La principal ventaja de esta técnica es que puede repetirse en múltiples puntos de tiempo en el mismo animal sin requerir sacrificio en citometría de flujo o inmunohistoquímica. Esta técnica podría modificarse para rastrear otros tipos de células inmunes también.Para cultivar células 293T, prepare un litro de DMEM agregando 110 mililitros de suero bovino fetal inactivado por calor y 11 mililitros de estreptomicina de penicilina. Descongele cinco veces 10 a la sexta célula 293T y transfiéralas a un matraz T175 que contenga DMEM. Divida las células de una a 10 cada tres días durante seis días antes de que las células se vuelvan más del 90% confluentes.Para la transfección, transfiera 1,5 mililitros de medios a dos tubos de 50 mililitros con una pipeta. A un tubo, agregue 10 microgramos de plásmido VSVG, 20 microgramos de gag pol y 20 microgramos de plásmido de luciferasa rojo de escarabajo clic o plásmido CBRTDR y mezcle. Agregue 100 microlitros de reactivo de transfección in vitro de ADN a otro tubo y mezcle.Incubar ambos tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfiera el medio que contiene el reactivo de transfección in vitro de ADN gota a gota al tubo que contiene los plásmidos de ADN y mezcle suavemente con una pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.Durante la incubación, separe las células 293T agregando de cinco a 10 mililitros de tripsina al 0,05%. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue 10 mililitros de medio y centrifugar a 800 G durante cinco minutos. Resuspender las células en 1,5 mililitros de medio.Agregue los medios que contienen el reactivo de transfección in vitro de ADN y los plásmidos de ADN a las células 293T e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, transferir la suspensión a un matraz T175. Agregue 18 mililitros de medios e incube a 37 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, aspire cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio sin separar las células y reemplácelo con 18 mililitros de medios frescos. Nuevamente, incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, retire el sobrenadante viral con una pipeta sobre hielo y centrifugar a 800 G durante cinco minutos para granular las células y los desechos.Filtre el sobrenadante viral con un filtro de 0,22 micras y colóquelo inmediatamente en hielo. Para la activación in vitro de células T humanas, agregue 10 mililitros de PBS que contengan 0,1% de albúmina sérica bovina o BSA y dos EDTA milimolares a un tubo estéril de 15 mililitros. Luego, para lavar las cuentas, agregue las perlas en un tubo y coloque el tubo en una rejilla magnética.Después de dos minutos, retire el PBS del tubo. Después de preparar DMEM, agregue perlas lavadas e interleucina-2 o IL-2 a una concentración final de 30 unidades internacionales por mililitro. Cuente las células T usando un hemocitómetro y tinción azul de tripano.Después de contar, agregue el número deseado de células T al medio e invierta suavemente el tubo para mezclar. Placa de 2,5 mililitros de medios que contienen dos millones de células T, perlas e IL-2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Cultivo a 37 grados centígrados en dióxido de carbono humidificado al 5%.Examine las células T bajo un objetivo de 20X todos los días durante tres días para determinar cuándo transducir con luciferasa. Luego, para preparar una placa de RetroNectin, agregue dos mililitros de 20 microgramos por mililitro de RetroNectin en PBS a un pocillo de una placa de seis pocillos sin tratar e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Aspire el RetroNectin sin rayar el fondo de la placa y agregue tres mililitros de BSA al 2% en PBS por pocillo en la placa de seis pocillos.Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, para la espinoculación, aspire el BSA y lave los pocillos una vez con tres mililitros de PBS. Continúe o reemplace con PBS fresco y deje el plato cubierto a cuatro grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, agregue dos mililitros de sobrenadante viral de luciferasa CBRTDR por pocillo y centrifugar a 1, 240 G durante 90 minutos a 32 grados centígrados. Para la transducción, después de contar las células T, aspirar el sobrenadante viral y colocar en placa dos millones de células T por pocillo en seis mililitros de DMEM que contienen 30 unidades internacionales por mililitro de IL-2 humana. Examine las células T durante dos días.Cuando las células estén casi confluentes, lávelas suavemente del fondo de la placa con una pipeta y transfiera cada pocillo a un matraz T75 separado. Añadir nueve mililitros de medios para un total de 15 mililitros de volumen por matraz. Al día siguiente, agregue 15 mililitros de medios y confirme la transducción exitosa realizando una citometría de flujo.Después de anestesiar al ratón, usando una aguja de calibre 26, inyecte 20 millones de células T en 100 microlitros de medios retroorbitalmente. Administrar 1, 000 unidades de IL-2 recombinante por vía subcutánea para apoyar la supervivencia de las células T in vivo. Luego administre el anticuerpo biespecífico retroorbital o intraperitonealmente.Para imágenes in vivo, administrar 100 microlitros de tres miligramos de D-luciferina por inyección retroorbitaria con una aguja de calibre 26 en un ratón anestesiado. Para capturar imágenes, coloque el ratón en la cámara hermética a la luz del generador de imágenes de modo que el flanco que lleva el xenoinjerto esté orientado hacia la cámara. Con el panel de control de adquisición, seleccione luminiscente, fotografía y superposición.Establezca el tiempo de exposición en automático, el binning en medio y f-stop en uno y adquiera imágenes. Después de la primera imagen, establezca el tiempo de exposición para que coincida con el calculado automáticamente para la primera imagen para que las imágenes posteriores se puedan comparar directamente. Tome otro conjunto de imágenes con el ratón en decúbito supino para evaluar la presencia de células T en los pulmones.Las células T armadas traficaron al tumor más rápido que las células T desarmadas, dejando los pulmones dos días antes. La cuantificación de la infiltración de células T en los tumores a lo largo del tiempo se midió mediante bioluminiscencia y se expresó como bandadas totales o resplandor por píxel integrado sobre el contorno tumoral. El tráfico de células T podría monitorizarse durante 28 días después de la inyección de las células T transducidas por luciferasa, lo que permite rastrear la localización y la persistencia de las células T durante todo el tratamiento.Se muestra el tráfico de células T en xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama humano HER2 positivo en ratones DKO. El tratamiento con el anticuerpo biespecífico HER2 con una CF sin silenciamiento no tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral en comparación con un anticuerpo biespecífico controlado. Por el contrario, el tratamiento con anticuerpos biespecíficos HER2 que contienen la mutación N297A sola o en combinación con una mutación K322A fue capaz de detener completamente el crecimiento tumoral.Para los grupos con las mutaciones de silenciamiento, la señal de luminiscencia de las células T alcanzó un pico más alto en el tercer día después de la inyección y persistió en un nivel más alto en comparación con el anticuerpo biespecífico controlado y el anticuerpo biespecífico HER2 sin silenciar. Los ratones portadores de xenoinjertos derivados de pacientes con neuroblastoma demostraron que el agotamiento de los macrófagos positivos para Ly6C aumentó significativamente la orientación de las células T a los tumores, lo que resultó en una disminución del crecimiento tumoral y una supervivencia prolongada. El efecto fue más pronunciado en los xenoinjertos derivados de pacientes con osteosarcoma.Entre los anticuerpos biespecíficos dirigidos al antígeno tumoral STEAP1, el formato IGGL SCFV dio lugar a una infiltración de células T significativamente mayor en el sexto día después de la primera dosis de células T que persistió durante la duración del tratamiento. Tales observaciones no fueron predichas por ensayos de citotoxicidad in vitro. Después de rastrear las células T in vivo, los usuarios aún pueden realizar inmunohistoquímica para determinar más específicamente dónde se encuentran las células T dentro del tumor u otros tejidos normales.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

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Investigación

Investigación sobre el cáncer

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Preparación de exosomas siRNA entrega a las células cancerosas

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Uso de CRISPR/Cas9 para noquear GM-CSF en células CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Uso de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la generación de células T específicas de antígenos tumorales

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Aislamiento y expansión de células T asesinas inducidas por citoquinas citotóxicas para el tratamiento del cáncer

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...