Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr. Vladimir Ponomarev för att dela luciferaskonstruktionerna som används i experimenten som beskrivs i det representativa resultatavsnittet i denna artikel.

Följande procedurer har utvärderats och godkänts av Memorial Sloan Ketterings Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Transfektion av 293T-celler med luciferas och skörd av viral supernatant
<ol><li>Odling av 293T-celler<ol><li>Bered media genom att tillsätta följande till en liter DMEM vardera: 110 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 11 ml penicillin-streptomycin.</li>
		<li>Tina 5 x 106 293T celler och överför dem till en T175-kolv me...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

Medan T-BsAb blinatumomab har godkänts för CD19-positiva hematologiska maligniteter, har den framgångsrika implementeringen av T-BsAbs i solida tumörer visat sig vara mycket svårare. Catumaxomab, en T-BsAb riktad mot epitelcelladhesionsmolekyl (EPCAM), godkändes för behandling av maligna ascites hos patienter med äggstockscancer, men produktionen av läkemedlet stoppades därefter av kommersiella skäl19. Inga andra T-BsAbs har godkänts för solida tumörer, vilket understryker de utmanin...

T-cellengagerande bispecifika antikroppar (T-BsAbs) är konstruerade antikroppar som används för att ge artificiell specificitet till polyklonala T-celler genom att engagera T-celler genom en bindningsarm och ett tumörantigen genom en annan bindningsarm. Denna teknik har framgångsrikt tillämpats på hematologiska cancerformer (CD19-riktad blinatumomab1), och många T-BsAbs är i preklinisk och klinisk utveckling för en mängd solida tumörer samt2. T-BsAbs engagerar polyklonala T-celler på ett stort histokompatibilitetskomplex (MHC)-oberoende sätt, och därför är även tumörer som nedreglerar humana leukocytantigener (HLA) mottagliga för denna typ av terapi 3,4. T-BsAbs har utvecklats i dussintals olika format, med skillnader i valens och rumsliga arrangemang av T-cellen och tumörbindande armar, interdomänavstånd och införandet av en Fc-domän, vilket påverkar halveringstiden och kan inducera effektorfunktioner om de finns5. Tidigare arbete i vårt laboratorium har visat att dessa faktorer signifikant påverkar antitumöreffekten av T-BsAbs, med upp till 1000-faldiga skillnader i styrka6. Genom detta arbete identifierade vi IgG-[L]-scFv-formatet som den perfekta plattformen för T-BsAbs (se avsnittet Representativa resultat för mer information om T-BsAb-format) och har tillämpat denna plattform på mål inklusive GD2 (neuroblastom), HER2 (bröstcancer och osteosarkom), GPA33 (kolorektal cancer), STEAP1 (Ewing sarkom), CD19 (B-cellmaligniteter) och CD33 (B-cellmaligniteter)7, 8,9,10,11,12,13.
En av de stora utmaningarna för att framgångsrikt implementera T-BsAb-terapi i solida tumörer är att övervinna en immunsuppressiv tumörmikromiljö (TME) för att driva T-cellshandel till tumörer14. De faktorer som påverkar T-BsAb-effekten som beskrivs ovan har en signifikant inverkan på T-BsAbs förmåga att effektivt inducera T-cellhoming till tumörer, men denna effekt är svår att utvärdera i ett in vivo-system i realtid. Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av användningen av luciferastransducerade T-celler i prekliniska studier av T-BsAbs för att utvärdera T-cellshandel till olika vävnader i experimentella immunsupprimerade musmodeller under behandling. Det övergripande målet med denna metod är att tillhandahålla ett sätt att utvärdera T-cellinfiltration i tumörer och andra vävnader, samt realtidsinsikt i T-cellhoming-kinetik och uthållighet, utan att behöva offra djur under behandlingen. För det ökande antalet forskare som fokuserar på cellulära immunterapier är förmågan att spåra T-celler in vivo i prekliniska djurmodeller avgörande. Vi strävar efter att ge en grundlig och detaljerad beskrivning av den metod vi har använt för att spåra luciferastransducerade T-celler för att göra det möjligt för andra forskare att enkelt replikera denna teknik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

T-cellengagerande bispecifika antikroppar (T-BsAbs) befinner sig i olika stadier av preklinisk utveckling och klinisk testning för solida tumörer. Faktorer som valens, rumsligt arrangemang, interdomänavstånd och Fc-mutationer påverkar antitumöreffekten av dessa terapier, vanligtvis genom att påverka homing av T-celler till tumörer, vilket fortfarande är en stor utmaning. Här beskriver vi en metod för att transducera aktiverade humana T-celler med luciferas, vilket möjliggör in vivo-spårning av T-celler under T-BsAb-terapistudier. T-BsAbs förmåga att omdirigera T-celler till tumörer kan utvärderas kvantitativt vid flera tidpunkter under behandlingen, vilket gör det möjligt för forskare att korrelera antitumöreffekten av T-BsAbs och andra ingrepp med T-cellernas uthållighet i tumörer. Denna metod lindrar behovet av att offra djur under behandling för att histologiskt bedöma T-cellinfiltration och kan upprepas vid flera tidpunkter för att bestämma kinetiken för T-cellshandel under och efter behandlingen.

Som beskrivs i steg 4.3 kan möss orienteras i olika positioner under avbildning för att utvärdera närvaron av T-celler i olika vävnader. Liggande positionering möjliggör bedömning av T-celler i lungorna, vilket är vanligt vid tidiga tidpunkter efter injektionen. Lateral positionering med det subkutana xenograft uppåt används för att bäst bedöma T-cellhandel till tumören. Kvinnliga C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac möss användes för alla experiment som beskrivs i detta man...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Här beskriver vi en metod för att transducera humana T-celler med luciferas för att underlätta in vivo-spårning av bispecifik antikroppsinducerad T-cellshandel till tumörer i studier för att utvärdera antitumöreffekten och mekanismen för T-cellengagerande bispecifika antikroppar.

Spårning av bispecifik antikroppsinducerad T-cellhandel med hjälp av Luciferas-transducerade humana T-celler

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Denna metod gör det möjligt för användare att enkelt spåra T-celler in vivo för att utvärdera kinetiken för homing och för att övervaka T-cellens persistens. Den största fördelen med denna teknik är att den kan upprepas vid flera tidpunkter på samma djur utan att kräva offer i flödescytometri eller immunhistokemi. Denna teknik kan modifieras för att spåra andra typer av immunceller också.För att odla 293T-celler, förbered en liter DMEM genom att tillsätta 110 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 11 ml penicillinstreptomycin. Tina fem gånger 10 till de sjätte 293T-cellerna och överför dem till en T175-kolv innehållande DMEM. Dela cellerna en till 10 var tredje dag i sex dagar innan cellerna blir mer än 90% sammanflytande.För transfektion, överför 1,5 ml media till två 50 ml rör med en pipett. Tillsätt 10 mikrogram VSVG-plasmid, 20 mikrogram gag pol och 20 mikrogram klickbagge röd TDtomat eller CBRTDR luciferasplasmid till ett rör och blanda. Tillsätt 100 mikroliter DNA in vitro-transfektionsreagens till ett annat rör och blanda.Inkubera båda rören vid rumstemperatur i fem minuter. Överför droppvis mediet som innehåller DNA-transfektionsreagenset in vitro till röret som innehåller DNA-plasmiderna och blanda försiktigt med pipett. Inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter.Under inkubation, lossa 293T-cellerna genom att tillsätta fem till 10 ml 0,05% trypsin. När cellerna har lossnat, tillsätt 10 ml media och centrifugera vid 800 G i fem minuter. Resuspendera cellerna i 1,5 ml media.Tillsätt mediet som innehåller DNA-transfektionsreagenset in vitro och DNA-plasmiderna till 293T-cellerna och inkubera vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Efter inkubation överför suspensionen till en T175-kolv. Tillsätt 18 ml media och inkubera vid 37 grader Celsius över natten.Nästa dag, sug försiktigt mediet med en glaspipett utan att lossa cellerna och ersätt det med 18 ml färskt media. Inkubera igen över natten vid 37 grader Celsius. Följande dag, ta bort virussupernatanten med en pipett som läggs på is och centrifugera vid 800 G i fem minuter för att pellet cellerna och skräpet.Filtrera viral supernatant med ett 0,22 mikron filter och placera det omedelbart på is. För in vitro-aktivering av humana T-celler, tillsätt 10 ml PBS innehållande 0,1% bovint serumalbumin eller BSA och två millimolar EDTA till ett sterilt 15 ml rör. För att tvätta pärlorna, lägg pärlorna i ett rör och placera röret i ett magnetställ.Efter två minuter, ta bort PBS från röret. Efter beredning av DMEM, tillsätt tvättade pärlor och interleukin-2 eller IL-2 till en slutlig koncentration av 30 internationella enheter per milliliter. Räkna T-cellerna med en hemocytometer och Trypan blå fläck.Efter räkning, tillsätt önskat antal T-celler till mediet och vänd försiktigt röret för att blanda. Platta 2,5 ml media innehållande två miljoner T-celler, pärlor och IL-2 i varje brunn i en 24-brunns vävnadsodlingsplatta. Kultur vid 37 grader Celsius i fuktad 5% koldioxid.Undersök T-cellerna under ett 20X-mål varje dag i tre dagar för att avgöra när man ska transducera med luciferas. Därefter, för att förbereda en RetroNektin-platta, tillsätt två milliliter 20 mikrogram per milliliter RetroNectin i PBS till en brunn av en obehandlad sexbrunnsplatta och inkubera i två timmar vid rumstemperatur. Aspirera RetroNectin utan att repa botten av plattan och tillsätt tre milliliter 2% BSA i PBS per brunn i sexbrunnsplattan.Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Därefter, för spinokulation, aspirera BSA och tvätta brunnarna en gång med tre milliliter PBS. Fortsätt eller ersätt med färsk PBS och låt plattan täckas vid fyra grader Celsius över natten.Nästa dag tillsätt två milliliter CBRTDR luciferase viral supernatant per brunn och centrifugera vid 1 240 G i 90 minuter vid 32 grader Celsius. För transduktion, efter att ha räknat T-cellerna, aspirera virussupernatanten och platta två miljoner T-celler per brunn i sex milliliter DMEM innehållande 30 internationella enheter per milliliter human IL-2. Undersök T-cellerna i två dagar.När cellerna är nästan sammanflytande, tvätta dem försiktigt från botten av plattan med en pipett och överför varje brunn till en separat T75-kolv. Tillsätt nio ml media för totalt 15 ml volym per kolv. Nästa dag, tillsätt 15 ml media och bekräfta framgångsrik transduktion genom att utföra flödescytometri.Efter bedövning av musen, med hjälp av en 26 gauge nål, injicera 20 miljoner T-celler i 100 mikroliter media retroorbitalt. Administrera 1 000 enheter rekombinant IL-2 subkutant för att stödja T-cellöverlevnad in vivo. Administrera sedan den bispecifika antikroppen retroorbitalt eller intraperitonealt.För in vivo-avbildning, administrera 100 mikroliter tre milligram D-luciferin genom retroorbital injektion med en 26 gauge nål i en bedövad mus. För att ta bilder, placera musen i kamerans ljustäta kammare så att flanken som bär xenograft är vänd uppåt mot kameran. Använd kontrollpanelen för förvärv och välj självlysande, fotografi och överlägg.Ställ in exponeringstiden på auto, binning till medium och f-stop till en och hämta bilder. Efter den första bilden ställer du in exponeringstiden så att den matchar den som beräknats automatiskt för den första bilden så att efterföljande bilder kan jämföras direkt. Ta en annan uppsättning bilder med musen liggande för att utvärdera T-cellnärvaron i lungorna.Beväpnade T-celler smugglade till tumören snabbare än obeväpnade T-celler och lämnade lungorna två dagar tidigare. Kvantifiering av T-cellsinfiltration i tumörer över tid mättes genom bioluminiscens och uttrycktes som totala flockar eller utstrålning per pixel integrerad över tumörkonturen. T-cellshandel kan övervakas i 28 dagar efter injektion av luciferastransducerade T-celler, vilket möjliggör spårning av T-cellhoming och uthållighet under hela behandlingen.T-cellshandel med HER2-positiva humana bröstcancerpatient-härledda xenotransplantat hos DKO-möss visas. Behandling med den bispecifika antikroppen HER2 med en otystad FC hade ingen effekt på tumörtillväxt jämfört med en kontrollerad bispecifik antikropp. Däremot kunde behandling med HER2 bispecifik antikropp innehållande N297A-mutation ensam eller i kombination med en K322A-mutation stoppa tumörtillväxten helt.För grupper med ljuddämpande mutationer nådde T-cellluminiscenssignalen en högre topp dag tre efter injektionen och kvarstod på en högre nivå jämfört med den kontrollerade bispecifika antikroppen och den otystade bispecifika HER2-antikroppen. Möss som bär neuroblastom patient-derived xenografts visade utarmning av Ly6C-positiva makrofager ökade signifikant T-cellhoming till tumörer, vilket resulterade i minskad tumörtillväxt och förlängd överlevnad. Effekten var mer uttalad i osteosarkom patient-derived xenografts.Bland bispecifika antikroppar riktade mot tumörantigenet STEAP1 resulterade IGGL SCFV-formatet i signifikant mer T-cellinfiltration på dag sex efter den första dosen T-celler som kvarstod under hela behandlingen. Sådana observationer förutsågs inte genom cytotoxicitetsanalyser in vitro. Efter att ha spårat T-celler in vivo kan användare fortfarande utföra immunhistokemi för att bestämma mer specifikt var T-cellerna finns i tumören eller andra normala vävnader.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En portådern Injection modell för att studera levermetastaser av bröstcancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fyra färgfluorescensimmunohistokemi av T-cell-subpopuleringar i Archival Formalin-fixade, paraffin-inbäddade humana orofaryngeala Squamous Cell Carcinomprover

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatta CD8 T-lymfocyter i Human Lung tumör skivor med konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngena mus B-cells lymfom modell för preklinisk utvärdering av CD19 CAR T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En sfäroid dödande analys av CAR T-celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Beredning av Exosomes för siRNA leverans till cancerceller

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Använda CRISPR/Cas9 för att slå ut GM-CSF i CAR-T-celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Tillverkning chimeric antigen receptor (bil) T celler för adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolering och expansion av cytotoxiska Cytokin-inducerad Killer T-celler för cancerbehandling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...