Name: tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Yazarlar, bu makalenin temsili sonuçlar bölümünde açıklanan deneylerde kullanılan lusiferaz yapılarını paylaştığı için Dr. Vladimir Ponomarev'e teşekkür eder.

Aşağıdaki prosedürler Memorial Sloan Kettering'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından değerlendirilmiş ve onaylanmıştır.
1. 293T hücrelerinin lusiferaz ile transfeksiyonu ve viral süpernatan hasadı
<ol><li>293T hücrelerin kültürü<ol><li>Her biri bir litre DMEM'e aşağıdakileri ekleyerek ortam hazırlayın: 110 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 11 mL penisilin-streptomisin.</li>
		<li>5 x 106 293T ...

<ol>
	<li>G&#246;kbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).</li><li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-/CD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct.">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li><li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells.">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li><li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy.">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).</li><li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-[L]-scFv+T+cell+bispecific+antibodies.">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).</li><li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency.">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li><li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma.">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 172 (2020).</li><li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33/anti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers.">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li><li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).</li><li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies.">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).</li><li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia.">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li><li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).</li><li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics.">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap.">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li><li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release.">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).</li><li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response.">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 142 (2021).</li><li>Str&#246;hlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis.">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li><li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer.">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li><li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors:+Translational+implications.">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li></ol>

T-BsAb blinatumomab CD19 pozitif hematolojik maligniteler için onaylanmış olsa da, T-BsAbs'nin solid tümörlerde başarılı bir şekilde uygulanmasının çok daha zor olduğu kanıtlanmıştır. Epitel hücre adezyon molekülüne (EPCAM) karşı yönlendirilmiş bir T-BsAb olan Catumaxomab, yumurtalık kanseri hastalarında malign asitlerin tedavisi için onaylandı, ancak ilacın üretimi daha sonra ticari nedenlerle durduruldu19. Katı tümörler için başka hiçbir T-BsAb onaylanmamışt...

T hücresine bağlı bispesifik antikorlar (T-BsAbs), T hücrelerini bir bağlanma kolundan ve bir tümör antijenini başka bir bağlanma kolundan geçirerek poliklonal T hücrelerine yapay özgüllük sağlamak için kullanılan mühendislik antikorlarıdır. Bu teknoloji hematolojik kanserlere (CD19 hedefli blinatumomab1) başarıyla uygulanmıştır ve çok sayıda T-BsAb, çeşitli solid tümörler için preklinik ve klinik gelişim aşamasındadır2. T-BsAb'lar, poliklonal T hücrelerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) bağımsız bir şekilde meşgul eder ve bu nedenle insan lökosit antijenlerini (HLA'lar) aşağı regüle eden tümörler bile bu tür bir tedaviye duyarlıdır 3,4. T-BsAb'lar, T hücresinin ve tümör bağlama kollarının değerliği ve mekansal düzeni, alanlar arası mesafeler ve yarı ömrü etkileyen ve varsa efektör fonksiyonlarını indükleyebilen bir Fc alanının dahil edilmesindeki farklılıklarla düzinelerce farklı formatta geliştirilmiştir5. Laboratuvarımızdaki önceki çalışmalar, bu faktörlerin T-BsAbs'nin anti-tümör etkinliğini önemli ölçüde etkilediğini ve potens6'da 1.000 kata kadar farklılıklar olduğunu göstermiştir. Bu çalışma sayesinde, IgG-[L]-scFv formatını T-BsAbs için ideal platform olarak tanımladık (T-BsAb formatları hakkında daha fazla ayrıntı için Temsilci Sonuçlar bölümüne bakın) ve bu platformu GD2 (nöroblastom), HER2 (meme kanseri ve osteosarkom), GPA33 (kolorektal kanser), STEAP1 (Ewing Sarkomu), CD19 (B hücreli maligniteler) ve CD33 (B hücreli maligniteler)7 dahil olmak üzere hedeflere uyguladık. 8,9,10,11,12,13.
Katı tümörlerde T-BsAb tedavisinin başarılı bir şekilde uygulanmasındaki en büyük zorluklardan biri, tümörlere T hücresi kaçakçılığını sağlamak için immünosüpresif tümör mikroçevresinin (TME) üstesinden gelmektir14. Yukarıda tarif edilen T-BsAb etkinliğini etkileyen faktörler, T-BsAbs'nin tümörlere T hücresi homing'i etkili bir şekilde indükleme kabiliyeti üzerinde önemli bir etkiye sahiptir, ancak bu etkinin in vivo bir sistemde gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi zordur. Bu makalede, tedavi sırasında deneysel immün sistemi baskılanmış fare modellerinde çeşitli dokulara T hücre kaçakçılığını değerlendirmek için T-BsAbs'nin klinik öncesi çalışmalarında lusiferaz transdüne T hücrelerinin kullanımının ayrıntılı bir açıklaması sunulmaktadır. Bu yöntemin genel amacı, tümörlerde ve diğer dokularda T hücresi infiltrasyonunu değerlendirmek için bir araç sağlamanın yanı sıra, tedavi sırasında hayvanları feda etmeye gerek kalmadan T hücresi homing kinetiği ve kalıcılığı hakkında gerçek zamanlı bir bakış açısı sağlamaktır. Hücresel immünoterapilere odaklanan artan sayıda araştırmacı için, klinik öncesi hayvan modellerinde T hücrelerini in vivo olarak izleme yeteneği çok önemlidir. Diğer araştırmacıların bu tekniği kolayca çoğaltmalarını sağlamak için lusiferaz transdüne T hücrelerini izlemek için kullandığımız yöntemin kapsamlı ve ayrıntılı bir açıklamasını sunmayı amaçlıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 beads</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA in vitro transfection reagent (polyjet)</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag/pol plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150-DNA.cg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher)</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking bispecific antibody-induced t cell trafficking using luciferase-transduced human t cells

T hücresini tutan bispesifik antikorlar (T-BsAbs), solid tümörler için klinik öncesi gelişim ve klinik testlerin çeşitli aşamalarındadır. Değerlik, mekansal düzenleme, alanlar arası mesafe ve Fc mutasyonları gibi faktörler, bu tedavilerin anti-tümör etkinliğini, genellikle T hücrelerinin tümörlere yönlendirilmesini etkileyerek etkiler ve bu da büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, aktif insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tarif ediyoruz, bu da T-BsAb terapi çalışmaları sırasında T hücrelerinin in vivo izlenmesine izin veriyor. T-BsAbs'nin T hücrelerini tümörlere yönlendirme yeteneği, tedavi sırasında birden fazla zaman noktasında kantitatif olarak değerlendirilebilir ve araştırmacıların T-BsAbs'nin anti-tümör etkinliğini ve diğer müdahaleleri tümörlerdeki T hücrelerinin kalıcılığı ile ilişkilendirmelerini sağlar. Bu yöntem, T hücresi infiltrasyonunu histolojik olarak değerlendirmek için tedavi sırasında hayvanları kurban etme ihtiyacını hafifletir ve tedavi sırasında ve sonrasında T hücresi kaçakçılığının kinetiğinin belirlenmesi için birden fazla zaman noktasında tekrarlanabilir.

Adım 4.3'te açıklandığı gibi, fareler farklı dokulardaki T hücrelerinin varlığını değerlendirmek için görüntüleme sırasında farklı pozisyonlarda yönlendirilebilir. Sırtüstü konumlandırma, enjeksiyondan sonra erken zaman noktalarında yaygın olan akciğerlerdeki T hücrelerinin değerlendirilmesine izin verir. Subkutan ksenogreft yukarı bakacak şekilde lateral pozisyonlama, tümöre T hücre kaçakçılığını en iyi şekilde değerlendirmek için kullanılır. Bu makalede açıklanan tüm de...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells at JoVE.com

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Burada, T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorların anti-tümör etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için yapılan çalışmalarda, bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığının tümörlere in vivo izlenmesini kolaylaştırmak için insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Bu yöntem, kullanıcıların homing kinetiğini değerlendirmek ve T hücresi kalıcılığını izlemek için T hücrelerini in vivo olarak kolayca izlemelerini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, akış sitometrisinde veya immünohistokimyada fedakarlık gerektirmeden aynı hayvan üzerinde birden fazla zaman noktasında tekrarlanabilmesidir. Bu teknik, diğer bağışıklık hücresi türlerini izlemek için de değiştirilebilir.293T hücrelerini kültürlemek için, 110 mililitre ısıl inaktive fetal sığır serumu ve 11 mililitre penisilin streptomisin ekleyerek bir litre DMEM hazırlayın. Altıncı 293T hücrelerine beş kez 10 kez çözün ve bunları DMEM içeren bir T175 şişesine aktarın. Hücreler% 90'dan fazla birleşene gelmeden önce hücreleri altı gün boyunca her üç günde bir ila 10 arasında bölün.Transfeksiyon için, 1,5 mililitre ortamı bir pipet kullanarak iki adet 50 mililitrelik tüpe aktarın. Bir tüpe 10 mikrogram VSVG plazmid, 20 mikrogram gag pol ve 20 mikrogram tıklama böceği kırmızı Domates veya TCMBDR lusiferaz plazmidi ekleyin ve karıştırın. Başka bir tüpe 100 mikrolitre DNA in vitro transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırın.Her iki tüpü de oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. DNA in vitro transfeksiyon reaktifini içeren ortamı, DNA plazmidlerini içeren tüpe damla damla aktarın ve bir pipetle hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.Kuluçka sırasında, beş ila 10 mililitre% 0.05 tripsin ekleyerek 293T hücrelerini ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mililitre ortam ekleyin ve beş dakika boyunca 800 G'de santrifüj yapın. Hücreleri 1,5 mililitre ortamda yeniden askıya alın.DNA in vitro transfeksiyon reaktifini ve DNA plazmidlerini içeren ortamı 293T hücrelerine ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süspansiyonu bir T175 şişesine aktarın. 18 mililitre medya ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, hücreleri ayırmadan ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin ve 18 mililitre taze ortam ile değiştirin. Yine, gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, buza konan bir pipet kullanarak viral süpernatantı çıkarın ve hücreleri ve kalıntıları pellet etmek için beş dakika boyunca 800 G'de santrifüj yapın.Viral süpernatantı 0.22 mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyin ve hemen buzun üzerine yerleştirin. İnsan T hücrelerinin in vitro aktivasyonu için,% 0.1 sığır serum albümini veya BSA içeren 10 mililitre PBS ve steril 15 mililitrelik bir tüpe iki milimolar EDTA ekleyin. Daha sonra boncukları yıkamak için bir tüpe boncuk ekleyin ve tüpü manyetik bir rafa yerleştirin.İki dakika sonra, PBS'yi tüpten çıkarın. DMEM'i hazırladıktan sonra, yıkanmış boncukları ve interlökin-2 veya IL-2'yi mililitre başına 30 uluslararası birimlik son konsantrasyona ekleyin. Bir hemo sitometre ve Trypan mavisi boya kullanarak T hücrelerini sayın.Saydıktan sonra, ortama istediğiniz sayıda T hücresi ekleyin ve karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin. 24 delikli bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda iki milyon T hücresi, boncuk ve IL-2 içeren 2.5 mililitre ortam plakası. Nemlendirilmiş% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede kültür.Lusiferaz ile ne zaman transdübe edileceğini belirlemek için T hücrelerini üç gün boyunca her gün 20X'lik bir hedef altında inceleyin. Daha sonra, bir RetroNectin plakası hazırlamak için, PBS'de mililitre başına iki mililitre 20 mikrogram RetroNektin ilave edilmemiş altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. RetroNektin'i plakanın tabanını çizmeden aspire edin ve altı kuyucuklu plakadaki kuyucuk başına PBS'de üç mililitre% 2 BSA ekleyin.Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, spinokülasyon için, BSA'yı aspire edin ve kuyucukları bir kez üç mililitre PBS ile yıkayın. Taze PBS ile devam edin veya değiştirin ve plakayı gece boyunca dört santigrat derecede kapalı bırakın.Ertesi gün, kuyu başına iki mililitre TCMBDR lusiferaz viral süpernatant ekleyin ve 32 santigrat derecede 90 dakika boyunca 1.240 G'de santrifüj yapın. Transdüksiyon için, T hücrelerini saydıktan sonra, viral süpernatantı aspire edin ve insan IL-2'nin mililitresi başına 30 uluslararası birim içeren altı mililitre DMEM'de kuyu başına iki milyon T hücresini plakalayın. T hücrelerini iki gün boyunca inceleyin.Hücreler neredeyse birleştiğinde, bir pipet kullanarak plakanın altından yavaşça yıkayın ve her bir kuyucuğu ayrı bir T75 şişesine aktarın. Şişe başına toplam 15 mililitre hacim için dokuz mililitre ortam ekleyin. Ertesi gün, 15 mililitre ortam ekleyin ve akış sitometrisi yaparak başarılı transdüksiyonu onaylayın.Fareyi uyuşturduktan sonra, 26 gauge'lik bir iğne kullanarak, geriye dönük olarak 100 mikrolitre ortama 20 milyon T hücresi enjekte edin. T hücresi sağkalımını in vivo olarak desteklemek için 1.000 ünite rekombinant IL-2'yi deri altından uygulayın. Daha sonra bispesifik antikoru retroorbital veya intraperitoneal olarak uygulayın.İn vivo görüntüleme için, anestezi uygulanmış bir farede 26 gauge iğne ile retroorbital enjeksiyon ile 100 mikrolitre üç miligram D-lusiferin uygulayın. Görüntü yakalamak için, fareyi görüntüleyicinin ışık geçirmez haznesine, ksenogrefti taşıyan yan taraf kameraya doğru bakacak şekilde yerleştirin. Edinme kontrol panelini kullanarak ışıldayan, fotoğraf ve bindirmeyi seçin.Pozlama süresini otomatik, gruplamayı orta ve f-stop olarak ayarlayın ve görüntüleri alın. İlk görüntüden sonra, sonraki görüntülerin doğrudan karşılaştırılabilmesi için pozlama süresini ilk görüntü için otomatik olarak hesaplananla eşleşecek şekilde ayarlayın. Akciğerlerdeki T hücresi varlığını değerlendirmek için fare sırtüstü yatarken başka bir dizi görüntü alın.Silahlı T hücreleri, tümöre silahsız T hücrelerinden daha hızlı kaçakçılık yaptı ve akciğerleri iki gün erken terk etti. T hücre infiltrasyonunun zaman içinde tümörlere kantitasyonu biyolüminesans ile ölçüldü ve tümör konturu üzerine entegre edilmiş piksel başına toplam sürü veya ışıma olarak ifade edildi. T hücresi kaçakçılığı, lusiferaz transdüne T hücrelerinin enjeksiyonundan sonraki 28 gün boyunca izlenebilir ve tedavi boyunca T hücresi homing ve kalıcılığının izlenmesine izin verir.DKO farelerde HER2 pozitif insan meme kanseri hastası kaynaklı ksenogreftlere T hücresi kaçakçılığı gösterilmiştir. Susturulmamış bir FC ile HER2 bispesifik antikoru ile tedavinin, kontrollü bir bispesifik antikora kıyasla tümör büyümesi üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Buna karşılık, tek başına veya bir K322A mutasyonu ile kombinasyon halinde N297A mutasyonu içeren HER2 bispesifik antikoru ile tedavi, tümör büyümesini tamamen durdurabilmiştir.Susturucu mutasyonları olan gruplar için, T hücresi lüminesans sinyali, enjeksiyon sonrası üçüncü günde daha yüksek bir zirveye ulaştı ve kontrollü bispesifik antikor ve susturulmamış HER2 bispesifik antikoru ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir seviyede devam etti. Nöroblastom hastası kaynaklı ksenogreftler taşıyan fareler, Ly6C pozitif makrofajların tükenmesinin, tümörlere yönelik T hücresini önemli ölçüde artırdığını, bunun da tümör büyümesinin azalmasına ve sağkalımın uzamasına neden olduğunu göstermiştir. Etki, osteosarkom hasta kaynaklı ksenogreftlerde daha belirgindi.Tümör antijeni STEAP1'i hedef alan bispesifik antikorlar arasında, IGGL SCFV formatı, tedavi süresince devam eden T hücrelerinin ilk dozundan sonraki altıncı günde önemli ölçüde daha fazla T hücresi infiltrasyonu ile sonuçlandı. Bu tür gözlemler in vitro sitotoksisite testleri ile tahmin edilmemiştir. T hücrelerini in vivo olarak izledikten sonra, kullanıcılar T hücrelerinin tümör veya diğer normal dokular içinde nerede bulunduğunu daha spesifik olarak belirlemek için immünohistokimya yapabilirler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngeneic fare B hücreli lenfoma manken CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik değerlendirme için

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CAR-T hücrelerinde GM-CSF ' ı Knock Out için CRISPR/Cas9 kullanma

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Kanser Tedavisi için Sitotoksik Sitokin Kaynaklı Katil T Hücrelerinin İzolasyon ve Genişlemesi

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...