Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

نشكر آرثر هنريكي غوميز دي أوليفيرا ولوكاس جوليان كروز غوميز للمساعدة في عملية التصوير. تم دعم هذا المشروع من قبل مجلس البحوث البرازيلي (CNPq ، أرقام المنح 400953 / 2016-1-404286 / 2021-6) و Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). تم تمويل هذه الدراسة جزئيا أيضا من قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - قانون المالية 001.

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. بناء الجهاز
<ol><li>المنشار الألواح الليفية متوسطة الكثافة بسمك 3 مم (MDF) للحصول على قطع بالأبعاد الموضحة في الشكل 1 أ. ملاحظ...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

كان جهاز PhotoACT النهائي مناسبا للبناء بمكونات منخفضة التكلفة متاحة تجاريا بتكلفة إجمالية تقل عن 50 دولارا. وتشمل المزايا الإضافية انخفاض متطلبات الصيانة، والقدرة على تشعيع أنواع متعددة من ألواح الاستزراع، والاستخدام المتزامن لما يصل إلى أربع وحدات لكل فحص، والوزن المنخفض (2 كجم)/الحجم (44?...

من بين أكثر الأمراض غير السارية فتكا، يمثل السرطان سببا رئيسيا عالميا للوفاة المبكرة. وبلغ عدد الوفيات ما يقرب من 10 ملايين حالة وفاة في عام 2020 ، وهو ما يمثل حوالي واحد من كل ستة وفيات في جميع أنحاء العالم1. بالإضافة إلى ذلك ، تمثل ظاهرة مقاومة الأدوية المتعددة (MDR) تهديدا هائلا للصحة العامة ، حيث تفشل بروتوكولات العلاج الكيميائي المعتمدة في الوصول إلى مراحل مغفرة لهذه الحالة السريرية2. يمكن للخلايا السرطانية تطوير مقاومة للعلاج الكيميائي من خلال عدة آليات. ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن بعض ناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP (ABC) - مضخات التدفق المعتمدة على ATP - يعتبر السبب الرئيسي لتطور MDR داخل البيئة المكروية للورم3. بالإضافة إلى MDR ، تعزز مضاعفات السرطان الأخرى ، مثل التكرار والورم الخبيث ، الطلب الملح لتطوير وتحسين الأساليب العلاجية للتغلب على هذا التحدي الأورامي.
تم ممارسة الاستخدام العلاجي للضوء لعدة قرون4 ، ويمثل العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) نهجا علاجيا معتمدا سريريا للأورام الصلبة. يجمع PDT بين إعطاء محسس ضوئي (PS) متبوعا بتشعيع خفيف لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لممارسة السمية الخلوية الانتقائية في الخلايا السرطانية. هذا النهج العلاجي متفوق على الطرق التقليدية ، بما في ذلك الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي5 ؛ إنها تقنية طفيفة التوغل تظهر سمية خلوية أقل في الأنسجة الضامة6. يضمن تطبيق الضوء وتراكم PS مباشرة في الورم أو بيئته المكروية استهدافا دقيقا ، وبالتالي آثارا جانبية جهازية طفيفة وغير مرغوب فيها7 وإمكانية العلاج المتكرر في نفس الموقع. علاوة على ذلك ، فإن التكلفة أقل من تكلفة الأساليب الأخرى. نظرا لميزاته الواعدة ، يمكن اعتبار PDT خيارا مناسبا لكل من الفردي ، خاصة في حالة الأورام غير القابلة للعمل ، أو علاج السرطان المساعد7 ، ويمثل بديلا ل MDR المتعلق بالعلاج الكيميائي 8,9.
تم وصف التقرير الأول الذي يظهر معدل استجابة موضوعي مرتفع باستخدام PDT في عام 1975 في نموذج الفئران والجرذان10. منذ ذلك الحين ، أجريت دراسات باستخدام PDT مع نتائج إيجابية7 في كل من الجسم الحي وفي المختبر مع خطوط الخلايا السرطانية البشرية في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد11,12. بالنظر إلى قابلية التطبيق الواسع ل PS المعتمد سريريا ، بغض النظر عن مسارات التراكم المحددة ونطاقات الطول الموجي لقمم الامتصاص ، فإن العملية العامة هي كما يلي: (i) امتصاص PS ، (ii) ذروة تركيز PS في الورم أو بيئته المكروية ، (iii) تطبيق الضوء ، (iv) تفاعل ضوء PS ، (v) نقل طاقة الحالة المثارة PS إلى ركيزة الأنسجة أو جزيئات الأكسجين المحيطة ، (vi) إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التي تنطوي على الأكسجين المفرد أو أنيون الأكسيد الفائق ، (vii) موت الخلايا السرطانية عن طريق ، بشكل أساسي ، النخر أو موت الخلايا المبرمج (الموت المباشر) ، الالتهام الذاتي (آلية الحماية الخلوية) ، نقص تروية الأنسجة (تلف الأوعية الدموية) ، التعديل المناعي ، أو تداخل هذه الآليات7. في هذه المرحلة النهائية ، يعتمد تنشيط مسار موت خلية معين على العديد من العوامل ، مثل خصائص الخلية ، والتصميم التجريبي ، والأهم من ذلك ، توطين PS داخل الخلايا والضرر المستهدف المرتبط ب PDT13.
Verteporfin هو الجيل الثاني من PS ، معتمد من قبل الوكالات التنظيمية للاستخدام السريري في النرويج والصين لعلاج الضمور البقعي المرتبط بالعمر7. بعد تسليم الجرعة ، تم الإبلاغ عن أن هذا الدواء الأولي يتراكم جزئيا في الميتوكوندريا14 ويحفز فسفرة التيروزين البروتين الخلوي وتجزئة الحمض النووي ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية15,16. بعد 24 ساعة حضانة لاستيعاب verteporfin ، يوصى باستخدام بروتوكول PDT باستخدام إعداد الطول الموجي 690 نانومتر لتحقيق مستويات فعالة من نقل الإشعاع الكهرومغناطيسي إلى الجزيئات المجاورة 7,17.
فيما يتعلق بمصدر الضوء ل PDT ، عادة ما تكون أنظمة ليزر الصمام الثنائي الكلاسيكية باهظة الثمن ومعقدة تقنيا وكبيرة الحجم وبالتالي غير محمولة18,19. نتيجة لملف تعريف الطول الموجي الفردي ، والذي يمكن ملاحظته أيضا في معدات PDT القائمة على LED ، فإن الطلب على الوحدات المستقلة لكل تطبيق محسس ضوئي يجعل استخدام أنظمة ليزر الصمام الثنائي أكثر تعقيدا وغير مجد اقتصاديا20,21. لذلك ، يعتبر استخدام آلات LED البديل الواعد ليس فقط لحل مشاكل التكاليف22 والصيانة ، ولكن أيضا لتوفير خرج طاقة عالي وأقل ضررا 23 وقدرة إضاءة أوسع24،25،26،27.
على الرغم من المساهمة المحتملة التي يمكن أن تقدمها المعدات المستندة إلى LED لتجارب PDT28 ، لا تزال معظم الخيارات التجارية تمتلك عيوبا مثل نقص قابلية النقل والتكلفة العالية ومشاريع البناء المعقدة والتشغيل29. كان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو تقديم أداة بسيطة وموثوقة لفحوصات PDT في المختبر . تصف هذه الورقة PhotoACT ، وهو جهاز PDT قائم على LED مدمج داخليا ، وهو غير مكلف وسهل الاستخدام ومحمول. كدليل على المفهوم ، يظهر هذا الجهاز لتعزيز السمية الخلوية لل verteporfin في نموذج زراعة الخلايا 2D ، وبالتالي ، يمكن استخدامه كأداة بحث في تجارب PDT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

تصف هذه الورقة جهازا جديدا وبسيطا ومنخفض التكلفة لإجراء فحوصات العلاج الضوئي الديناميكي في المختبر (PDT) ، يسمى PhotoACT. تم بناء الجهاز باستخدام مجموعة من الثنائيات التقليدية الباعثة للضوء القابلة للبرمجة (LEDs) ، ووحدة عرض الكريستال السائل (LCD) ، ومستشعر الضوء المتصل بلوحة متحكم تجارية. تم تصنيع الهيكل القائم على الصندوق للنموذج الأولي باستخدام ألواح ليفية متوسطة الكثافة (MDFs). يمكن للمقصورة الداخلية تخصيص أربع لوحات دقيقة متعددة الآبار في وقت واحد.
كدليل على المفهوم ، درسنا التأثير السام للخلايا للمحسس الضوئي (PS) verteporfin ضد خط خلية HeLa في ثقافة ثنائية الأبعاد (2D). عولجت خلايا هيلا بتركيزات متزايدة من فيرتيبورفين لمدة 24 ساعة. تم التخلص من الوسط الطافي المحتوي على الدواء ، وتم غسل الخلايا الملتصقة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وأضيف وسط خال من المخدرات. في هذه الدراسة ، تم فحص تأثير verteporfin على الخلايا إما دون التعرض للضوء أو بعد التعرض لمدة 1 ساعة للضوء باستخدام قيم الأحمر والأخضر والأزرق (RGB) من 255 و 255 و 255 (متوسط الطلاقة 49.1 ± 0.6 J / cm2). بعد 24 ساعة ، تم تقييم صلاحية الخلية بواسطة مقايسة 3- (4،5-ثنائي ميثيل -2-ثيازوليل) -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT).
أظهرت النتائج التجريبية أن تعرض الخلايا المعالجة ب verteporfin للضوء من الجهاز يعزز التأثير السام للخلايا للدواء عبر آلية بوساطة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقق من صحة استخدام النموذج الأولي الموصوف في هذا العمل من خلال مقارنة النتائج بجهاز PDT تجاري. وبالتالي ، فإن هذا النموذج الأولي للعلاج الضوئي الديناميكي القائم على LED يمثل بديلا جيدا للدراسات المختبرية ل PDT.

تضمن جهاز PDT النهائي ، المسمى PhotoACT ، غرفة مظلمة لتخصيص ما يصل إلى أربع لوحات دقيقة متعددة الآبار ، مع سطحها الداخلي العلوي المجهز بمجموعة من 30 مصباح LED متناثرة مبرمجة لإصدار أطياف مميزة من الضوء المرئي (الشكل 3 والملف التكميلي 6). تم بناء الجهاز باستخدام صندوقين مرتب...

Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

هنا ، نصف جهازا جديدا وبسيطا ومنخفض التكلفة لإجراء فحوصات العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) بنجاح في المختبر باستخدام ثقافة خلايا HeLa ثنائية الأبعاد و verteporfin كحساس للضوء.

جهاز علاج ضوئي ديناميكي مدمج وقائم على الصمام الثنائي الباعث للضوء لتعزيز السمية الخلوية للفيرتيبورفين في نموذج زراعة الخلايا 2D

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

يوفر العلاج الضوئي الديناميكي ، PDT ، العديد من المزايا لعلاج السرطان ، وتعتمد فعاليته على مصدر الضوء لتنشيط المحسس الضوئي. على الرغم من التطورات الحديثة في هذا المجال ، إلا أن هناك نقصا في الوصول إلى جهاز مكلف وقابل للتكرار ل PTD للنماذج المختبرية. من أجل تحقيق هذا الطلب ، يصف هذا العمل جهازا جديدا وبسيطا ومنخفض التكلفة لإجراء فحوصات PDT على مزارع الخلايا ، يسمى PhotoAct.لبدء البناء ، رأى ثلاثة ملليمترات سمك ألواح الألياف متوسطة الكثافة ، MDF ، للحصول على قطع ذات الأبعاد التالية. بناء صندوقين بالأبعاد التالية. قم بحفر الجزء الخلفي من الصندوق الأكبر لتثبيت موصل مقبس الأسطوانة.قم أيضا بحفر الجزء العلوي من الصندوق الأكبر والجزء العلوي والسفلي من الصندوق الأصغر لتوفير ممر للكابلات الكهربائية. قم بطلاء جميع الأسطح الداخلية بالحبر الأسود لتعزيز حدوث الضوء المتجانس. قم بتوصيل ثلاثة أشرطة LED بالتوازي مع 10 مصابيح LED لكل منها على السطح الداخلي العلوي للصندوق الأصغر.بالإضافة إلى ذلك ، قم بتثبيت مستشعر سطوع في وسط السطح الداخلي السفلي للصندوق الأصغر. اطبع هيكل وحدة التحكم باستخدام ملف الطباعة 3D الإضافي. قم بتثبيت جميع المكونات ، وزر الطاقة ، ومقاييس الجهد ، ولوحة اللمس لبدء الوقت ، ومصابيح LED ، ومستشعر السطوع ، وشاشة LCD ، والجرس ، ومصدر الطاقة ، وأجزاء لوحة التحكم ESP-32 المثبتة في داخل وحدة التحكم.قم بتحميل رمز البرمجة المتاح في ملف تكميلي ، وقم بإجراء اختبار للتحقق من أن جميع الاتصالات تعمل. قم بتجميع الصناديق وإصلاحها معا لتجنب الفجوات وبالتالي تداخل الإضاءة الخارجية وفقدان الضوء الفوري. قم بتوصيل وحدة التحكم المركبة بالمنطقة المحفورة في الجزء العلوي من النموذج الأولي.قم ببناء باب أمامي من نفس المادة بالأبعاد التالية ، وقم بتثبيته على الصندوق الخارجي بمفصلات وأشرطة فيلكرو لضمان إغلاق الغرفة والمقايسات دون انقطاع. قم أيضا بتثبيت مقبض للتعامل مع الباب الأمامي بسهولة ودقة. قم بتوصيل أربع وسادات قدم مطاطية في الجزء السفلي من النموذج الأولي لضمان مزيد من الثبات أثناء العمليات.قم بزراعة خط خلايا هيلا في جلوكوز النسر المتوسط المعدل من دولبيكو مع 10٪ من مصل الأبقار الجنينية و 1٪ من الجنتاميسين. حافظ على قوارير الثقافة عند 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. إدارة وفحص ثقافة الخلية حتى تصل إلى 80 إلى 90٪ من التقاء.ابدأ بروتوكول صلاحية الخلية بعملية البذر. قم بإزالة الوسط من القارورة مع زراعة خلايا HeLa المتقاربة. اغسل القارورة بمحلول ملحي عازل للفوسفات ، PBS ، وافصل المزرعة باستخدام التربسين باتباع التفاصيل المميزة.عد خلايا إعادة التعليق باستخدام مقياس الدم وزرعها في صفيحة مجهرية متعددة الآبار بتركيز 20،000 خلية لكل بئر. تحضير لوحين لظروف العلاج المظلمة والخفيفة واحتضانها لمدة 24 ساعة لربط الخلية. للمضي قدما في العلاج باستخدام محسس للضوء ، قم بإزالة الوسط من كلتا اللوحتين وعلاج الخلايا ب 100 ميكرولتر من تركيزات Verteporfin.حافظ على الخلايا في العلاج لمدة 24 ساعة للسماح باستيعاب Verteporfin. بعد الحضانة ، قم بإزالة العلاج ، وغسل الخلايا باستخدام PBS وإضافة وسيلة خالية من المخدرات. قم بتغطية صفيحة دقيقة واحدة بورق الألمنيوم لحمايتها من التعرض للضوء واحتضانها لمدة 24 ساعة.ستوفر هذه الصفيحة الدقيقة بيانات تحكم لمزيد من التحليل لنتائج PDT. سيتم استخدام الصفيحة الدقيقة الأخرى في حالة التعرض للضوء في PhotoAct. لتشغيل الجهاز ، قم بتوصيله بالمأخذ وتشغيله ، واضغط على زر الطاقة.ضع الصفيحة الدقيقة متعددة الآبار في غرفة PDT وأغلق الجهاز عن طريق تثبيت الباب الأمامي بأشرطة الفيلكرو الجانبية. لإعداد الجهاز ، استخدم مقاييس الجهد لضبط تكوين RGB لانبعاث الضوء. اضغط على لوحة اللمس زائد / ناقص لضبط تكوين الوقت وتعيين مدة الفحص.تحقق مما إذا كانت المعلومات الصحيحة حول الفحص معروضة على الشاشة وقم بإجراء التعديلات النهائية إذا لزم الأمر. اضغط على لوحة بدء اللمس لبدء الفحص. يجب سماع صفارة واحدة في بداية التجربة.أثناء التجربة ، يمكن ملاحظة معلومات التقدم على الشاشة ، مثل الإشعاع والوقت المتبقي. لا تفتح الباب الأمامي أو تغير أي تكوين أثناء فحص PDT. في نهاية الفحص ، يجب سماع صفارة بأربعة أصوات تنبيه وسيقوم النظام الإلكتروني بإيقاف تشغيل جميع مصابيح LED.يمكن ملاحظة الرسالة النهائية والكمية النهائية من الطاقة الموسعة أثناء التجربة على الشاشة. يتم حساب القيمة النهائية للطلاقة وفقا للمعادلة المميزة. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة التي عانت من التعرض للضوء واستمر في الحضانة على مدار 24 ساعة.بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الوسيط من كلا اللوحين ، واغسل الطبقة الأحادية من الخلايا باستخدام PBS ، وأضف محلول MTT. احتضان كل من اللوحات الظروف المظلمة والخفيفة لمدة أربع ساعات للسماح بتكوين بلورات الفورمازان. قم بإزالة محلول MTT بعناية وقم بإذابة البلورات الأرجوانية باستخدام محلول DMSO والإيثانول.بعد الذوبان الكامل للبلورات ، قم بإجراء قياس الامتصاص باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة عند 595 نانومتر. يتكون المنتج النهائي من غرفة مظلمة مع سطحها الداخلي العلوي المجهز بمجموعة من 30 ثنائيا باعثا للضوء المتناثر ، مصابيح LED ، مبرمجة لإصدار أطياف مميزة من الضوء المرئي. يتم إنشاء حدوث ضوء متجانس بسبب انخفاض انعكاس الأسطح الداخلية والتوزيع الموحد لتكوين مصابيح LED.واجهة الإعداد سهلة الاستخدام وكانت الحالة التجريبية المستقرة قابلة للتكرار. كدليل على المفهوم ، تم استخدام الجهاز لتعزيز التأثير السام للخلايا ل Verteporfin في زراعة خلايا 2D HeLa بعد التعرض للضوء. كما هو موضح في الشكل ، كانت قيمة GI50 3.1 ميكرومولار لحالة الضوء.و 13.8 ميكرومولار للحالة المظلمة لذلك ، فإن الزيادة بأكثر من أربعة أضعاف في الكفاءة مقارنة الظروف تؤكد استخدام Verteporfin كمحسس للضوء وإمكانية تطبيق PhotoAct على فحوصات PDT. للتحقق من صحة استخدام النموذج الأولي الموصوف في هذا العمل ، تم استخدام جهاز PDT تجاري في ظل نفس الظروف التجريبية ، بما في ذلك المحسس الضوئي والخلايا والطلاقة ، وتمت مقارنة النتائج. كما هو موضح في الشكل ، قام كلا الجهازين بتنشيط Verteporfin ضوئيا بالتساوي ، مما يعزز التأثير السام للخلايا.أخيرا ، تم تأكيد موت الخلايا بوساطة ROS الناجم عن Verteporfin بعد التعرض للضوء عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام مقايسة DCFDA. باختصار ، تم بناء الجهاز بسهولة باستخدام مكونات منخفضة التكلفة متاحة تجاريا بتكلفة إجمالية أقل من 50. تشمل الميزة الرئيسية الأخرى للجهاز قابلية النقل ، وانخفاض الطلب على الصيانة ، والقدرة على تشعيع أنواع متعددة من ألواح الاستزراع ، والاستخدام المتزامن لما يصل إلى أربع وحدات لكل فحص ، والإشعاع الدقيق والقابل للتكرار ، وواجهة الإعداد سهلة الاستخدام والبسيطة التي لا تتطلب الاتصال بأجهزة الكمبيوتر أو الأجهزة الأخرى.بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم مخطط تدفق القرار لتوفير نهج منهجي لحل المشكلات للعثور على المشكلات أو الأخطاء وتصحيحها أثناء العملية. تسمح هذه النتائج بتوسيع فوائد PhotoAct لتسهيل PDT للبحث العلمي ، واستكشاف آلية عمل المحسسات الضوئية وتطبيقاتها السريرية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

تعزيز تطعيم خلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان عن طريق تثبيط عابر لنشاط رو كيناز

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

فائق السرعة الغربية لطخة باستخدام تقنية تحسين رد المناعة

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...