Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

Vi takker Arthur Henrique Gomes de Oliveira og Lucas Julian Cruz Gomes for at hjælpe med filmprocessen. Dette projekt blev støttet af det brasilianske forskningsråd (CNPq, tilskudsnumre 400953/2016-1-404286/2021-6) og Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Denne undersøgelse blev også delvist finansieret af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer relateret til alle materialer, reagenser og software, der bruges i denne protokol.
1. Enhedens konstruktion
<ol><li>Sav 3 mm tykke fiberplader med medium densitet (MDF) for at opnå stykker med de dimensioner, der er vist i figur 1A. BEMÆRK: Brug vektorfilen (supplerende fil 1) til cnc-skæring (computer numerical control).</li>
	<li>Byg to kasser med følgende dime...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

Den endelige PhotoACT-enhed var praktisk at konstruere med kommercielt tilgængelige, billige komponenter til en samlet pris på mindre end $ 50. Yderligere fordele omfatter lave vedligeholdelseskrav, kapacitet til at bestråle flere typer kulturplader, samtidig brug af op til fire enheder pr. assay, lav vægt (2 kg)/størrelse (44 cm3), der muliggør bærbarhed, nøjagtig og reproducerbar bestråling (data ikke vist) og en brugervenlig og enkel opsætningsgrænseflade, der ikke kræver forbindelse til compute...

Blandt de mest dødelige ikke-smitsomme sygdomme udgør kræft en globalt førende årsag til for tidlig død. Det tegnede sig for næsten 10 millioner dødsfald i 2020, hvilket repræsenterer omkring en ud af seks dødsfald på verdensplan1. Derudover udgør multiresistensfænomenet (MDR) en enorm trussel mod folkesundheden, da godkendte kemoterapeutiske protokoller ikke når remissionsstadier for denne kliniske tilstand2. Kræftceller kan udvikle resistens over for kemoterapi gennem flere mekanismer; overekspressionen af nogle ATP-bindende kassettetransportører (ABC) - ATP-afhængige effluxpumper - betragtes imidlertid som hovedårsagen til MDR-udvikling inden for et tumormikromiljø3. Ud over MDR forstærker andre kræftkomplikationer, såsom tilbagefald og metastase, den presserende efterspørgsel efter at udvikle og forbedre terapeutiske tilgange til at overvinde denne onkologiske udfordring.
Den helbredende udnyttelse af lys er blevet praktiseret i århundreder4, og fotodynamisk terapi (PDT) repræsenterer en klinisk godkendt terapeutisk tilgang til solide tumorer. PDT kombinerer administrationen af en fotosensibilisator (PS) efterfulgt af lysbestråling for at generere reaktive iltarter (ROS) for at udøve selektiv cytotoksicitet i tumorceller. Denne terapeutiske tilgang er bedre end konventionelle metoder, herunder kirurgi, stråling og kemoterapi5; Det er en minimalt invasiv teknik, der viser lavere cytotoksicitet i bindevæv6. Den lette anvendelse og PS-akkumulering direkte i tumoren eller dens mikromiljø sikrer præcis målretning og følgelig mindre, uønskede systemiske bivirkninger7 og muligheden for gentagen behandling på samme sted. Desuden er omkostningerne lavere end for andre tilgange. På grund af dets lovende egenskaber kan PDT betragtes som en passende mulighed for både enkelt, især i tilfælde af inoperable tumorer eller adjuverende kræftbehandling7, og repræsenterer et alternativ til MDR relateret til kemoterapi 8,9.
Den første rapport, der viste en høj objektiv responsrate ved hjælp af PDT, blev beskrevet i 1975 i en mus og rotte model10. Siden da er der udført undersøgelser ved hjælp af PDT med positive resultater7 både in vivo og in vitro med humane tumorcellelinjer i 2D-cellekultur11,12. I betragtning af den brede anvendelighed af klinisk godkendt PS, uanset deres specifikke akkumuleringsveje og bølgelængdeområder for absorptionstoppe, er den generelle proces som følger: (i) PS-optagelse, (ii) topning af PS-koncentration ved tumoren eller dens mikromiljø, (iii) lysapplikation, (iv) PS-lysinteraktion, (v) overførsel af PS-exciteret tilstandsenergi til enten vævssubstrat eller omgivende iltmolekyler, (vi) ROS-produktion, der involverer singlet oxygen eller superoxidanion, (vii) tumorcelledød via i det væsentlige nekrose eller apoptose (direkte død), autofagi (cytoprotektiv mekanisme), vævsikæmi (vaskulær skade), immunmodulation eller en overlapning af disse mekanismer7. I denne sidste fase afhænger aktiveringen af en bestemt celledødsvej af mange faktorer, såsom celleegenskaber, eksperimentelt design og vigtigst af alt PS intracellulær lokalisering og PDT-relateret målrettet skade13.
Verteporfin er en anden generation PS, godkendt af regulerende agenturer til klinisk brug i Norge og Kina til behandling af aldersrelateret makuladegeneration7. Efter dosislevering blev dette prodrug rapporteret delvist at akkumulere i mitokondrier14 og inducere cellulært protein tyrosinphosphorylering og DNA-fragmentering, hvilket førte til tumorcelleapoptose15,16. Efter 24 timers inkubation til verteporfin-internalisering anbefales en PDT-protokol ved hjælp af en 690 nm bølgelængdeopsætning for at opnå effektive niveauer af elektromagnetisk strålingsoverførsel til tilstødende molekyler 7,17.
Med hensyn til lyskilden til PDT er de klassiske diodelasersystemer normalt dyre, teknisk komplicerede, overdimensionerede og dermed ubærbare18,19. Som en konsekvens af dens enkeltbølgelængdeprofil, som også kan observeres i LED-baseret PDT-udstyr, gør efterspørgslen efter uafhængige enheder til hver fotosensibilisatorapplikation brugen af diodelasersystemer endnu mere kompleks og økonomisk umulig20,21. Derfor, brugen af LED-maskiner betragtes som det mest lovende alternativ til at løse ikke kun omkostninger22 og vedligeholdelsesproblemer, men også at give høj effekt og mindre skadelig 23 og bredere belysningskapacitet24,25,26,27.
På trods af det potentielle bidrag, som LED-baseret udstyr kan tilbyde til PDT-eksperimenter28, har de fleste kommercielle muligheder stadig ulemper såsom manglende bærbarhed, høje omkostninger og komplekse byggeprojekter og drift29. Hovedformålet med dette arbejde var at tilbyde et enkelt og pålideligt værktøj til in vitro PDT-assays. Dette papir beskriver PhotoACT, en internt bygget LED-baseret PDT-enhed, som er billig, brugervenlig og bærbar. Som et bevis på konceptet er denne enhed vist at forbedre cytotoksiciteten af verteporfin i en 2D-cellekulturmodel og kan derfor bruges som et forskningsværktøj i PDT-eksperimenter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

Dette papir beskriver en ny, enkel og billig enhed til at udføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) assays, kaldet PhotoACT. Enheden blev bygget ved hjælp af et sæt konventionelle programmerbare lysdioder (LED'er), et LCD-modul (Liquid Crystal Display) og en lyssensor forbundet til et kommercielt mikrocontrollerkort. Prototypens kassebaserede struktur blev lavet med fiberplader med medium densitet (MDF'er). Det indre rum kan samtidig tildele fire cellekultur multiwell mikroplader.
Som et bevis på konceptet studerede vi den cytotoksiske virkning af fotosensibilisatoren (PS) verteporfin mod HeLa-cellelinjen i todimensionel (2D) kultur. HeLa-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af verteporfin i 24 timer. Det lægemiddelholdige supernatantmedium blev kasseret, de klæbende celler blev vasket med fosfatbufferet saltvand (PBS), og lægemiddelfrit medium blev tilsat. I denne undersøgelse blev effekten af verteporfin på celler undersøgt enten uden lyseksponering eller efter eksponering i 1 time for lys ved hjælp af rød-grøn-blå (RGB) værdier på 255, 255 og 255 (gennemsnitlig fluence på 49,1 ± 0,6 J / cm2). Efter 24 timer blev cellelevedygtigheden vurderet ved 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-assayet.
Eksperimentelle resultater viste, at eksponering af celler behandlet med verteporfin for lyset fra enheden forbedrer lægemidlets cytotoksiske virkning via en mekanisme medieret af reaktive iltarter (ROS). Derudover blev brugen af prototypen beskrevet i dette arbejde valideret ved at sammenligne resultaterne med en kommerciel PDT-enhed. Således repræsenterer denne LED-baserede fotodynamiske terapiprototype et godt alternativ til in vitro-undersøgelser af PDT.

Den endelige PDT-enhed, kaldet PhotoACT, omfattede et mørkt kammer til at tildele op til fire multiwell-mikroplader med sin øvre indvendige overflade udstyret med et sæt af 30 spredte lysdioder programmeret til at udsende forskellige spektrum af synligt lys (figur 3 og supplerende fil 6). Enheden blev bygget ved hjælp af to tilknyttede kasser: en intern boks designet som et mørkt kammer til PDT-assays og en ekstern boks til at dække det indre kammer og holde kontrolenh...

Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Her beskriver vi en ny, enkel og billig enhed til succesfuldt at udføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) assays ved hjælp af todimensionel HeLa-cellekultur og verteporfin som en fotosensibilisator.

En internt bygget og lysdiodebaseret fotodynamisk terapianordning til forbedring af verteporfincytotoksicitet i en 2D-cellekulturmodel

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

Fotodynamisk terapi, PDT, tilbyder flere fordele ved kræftbehandling, og dens effektivitet afhænger af en lyskilde for at aktivere en fotosensibilisator. Selvom de seneste fremskridt på området mangler, er der mangel på adgang til en dyr og reproducerbar enhed til PTD til in vitro-modeller. For at opnå denne efterspørgsel beskriver dette arbejde en ny, enkel og billig enhed til at udføre PDT-assays på cellekulturer ved navn PhotoAct.For at starte konstruktionen så tre millimeter tykkelse medium densitet fiberplader, MDF, for at opnå stykker med følgende dimensioner. Byg to kasser med følgende dimensioner. Bor bagsiden af den større kasse for at installere et tøndestik.Bor også toppen af den større kasse, toppen og bunden af den mindre kasse for at give en passage til elektriske kabler. Mal alle indvendige overflader med sort blæk for at fremme homogen lysforekomst. Fastgør parallelt tre LED-bånd med 10 lysdioder hver på den øverste indvendige overflade af den mindre kasse.Derudover skal du installere en lysstyrkesensor i midten af den nederste indvendige overflade af den mindre kasse. Udskriv styreenhedens struktur ved hjælp af den supplerende 3D-udskrivningsfil. Installer alle komponenter, tænd / sluk-knap, potentiometre, tidsstart touchpad, lysdioder, lysstyrkesensor, LCD, summer og strømforsyning og dele af et ESP-32 controllerkort monteret på styreenhedens interiør.Upload den programmeringskode, der er tilgængelig i supplerende fil, og kør en test for at kontrollere, at alle forbindelser fungerer. Saml kasserne og fastgør dem sammen for at undgå huller og dermed ekstern lysinterferens og øjeblikkeligt lystab. Fastgør den monterede styreenhed til det borede område øverst på prototypen.Byg en hoveddør af samme materiale i følgende dimensioner, og fastgør den på den ydre kasse med hængsler og velcrobånd for at sikre kammerlukning og uafbrudt assays. Installer også et håndtag for at manipulere hoveddøren med lethed og præcision. Fastgør fire gummifodpuder i bunden af prototypen for at sikre mere stabilitet under operationerne.Dyrk HeLa-cellelinjen i Dulbeccos modificerede Eagle medium lav glukose med 10% føtalt bovint serum og 1% gentamycin. Hold kulturkolberne ved 5% kuldioxid og 37 Celsius grader. Administrer og inspicer cellekulturen, indtil den når 80 til 90% af sammenløbet.Start cellelevedygtighedsprotokollen med såningsprocessen. Fjern mediet fra kolben med sammenflydende HeLa-cellekultur. Kolben vaskes med fosfatbuffersaltvand, PBS, og kulturen afmonteres med trypsin efter fremhævede detaljer.Tæl resuspendcellerne med et hæmocytometer og frø dem i en multi-well mikroplade i koncentration på 20.000 celler pr. Brønd. Forbered to plader til mørke og lyse behandlingsbetingelser og inkuber dem i 24 timer til cellefastgørelse. For at fortsætte med behandling med en fotosensibilisator skal du fjerne mediet fra begge plader og behandle cellerne med 100 mikroliter stigende koncentrationer af Verteporfin.Hold cellerne i behandling i 24 timer for at tillade Verteporfin internalisering. Efter inkubation fjernes behandlingen, cellerne vaskes med PBS og tilsættes lægemiddelfrit medium. Dæk en mikroplade med aluminiumsfolie for at beskytte den mod lyseksponering og inkubere den i 24 timer.Denne mikroplade vil tilbyde kontroldata til yderligere analyse af PDT-resultater. Den anden mikroplade vil blive brugt på lyseksponeringstilstand på PhotoAct. For at betjene udstyret skal du sætte det i stikkontakten og tænde det ved at trykke på tænd / sluk-knappen.Placer multibrøndens mikroplade ved PDT-kammeret, og luk udstyret ved at fastgøre frontdøren med velcrobåndene i siden. For at konfigurere udstyret skal du bruge potentiometrene til at justere RGB-konfigurationen af lysemission. Tryk på plus/minus touchpad for at justere tidskonfigurationen og indstille analysens varighed.Kontroller, om de korrekte oplysninger om analysen vises på displayet, og foretag om nødvendigt de endelige justeringer. Tryk på start-touchpad'en for at starte analysen. En one-bip buzzer skal høres i begyndelsen af eksperimentet.Under eksperimentet kan der observeres fremskridtsoplysninger på displayet, såsom bestråling og tid tilbage. Åbn ikke hoveddøren, og du må ikke ændre konfiguration under PDT-analysen. I slutningen af analysen skal der høres en fire-bip summer, og det elektroniske system slukker for alle lysdioder.En færdig besked og den endelige mængde energi, der udvides under eksperimentet, kan observeres på displayet. Den flydende endelige værdi beregnes i henhold til den fremhævede ligning. Dæk mikropladen, der led lyseksponering, og fortsæt med 24-timers inkubation.Efter inkubationsperioden fjernes medium fra begge plader, vaskes monolaget af celler med PBS, og der tilsættes MTT-opløsning. Inkuber begge plader mørke og lyse forhold i fire timer for at muliggøre dannelse af formazankrystaller. Fjern MTT-opløsningen forsigtigt, og opløs de lilla krystaller med en DMSO- og ethanolopløsning.Efter fuldstændig krystalopløsning udføres absorbansmålingen ved hjælp af en mikropladelæser på 595 nanometer. Det endelige produkt består af et mørkt kammer med sin øvre indvendige overflade udstyret med et sæt af 30 spredte lysdioder, lysdioder, programmeret til at udsende forskellige spektrum af synligt lys. En homogen lysforekomst etableres på grund af den lave reflektivitet af indvendige overflader og ensartet fordeling af LED-konfiguration.Opsætningsgrænsefladen er brugervenlig, og den afgjorte eksperimentelle tilstand var reproducerbar. Som et bevis på konceptet blev enheden brugt til at forbedre den cytotoksiske virkning af Verteporfin i 2D HeLa-cellekultur efter lyseksponering. Som vist i figuren var GI50-værdien 3,1 mikromolar for lystilstanden.og 13,8 mikromolar til den mørke tilstand Derfor bekræfter stigningen på mere end fire gange i effektivitet, der sammenligner betingelserne, brugen af Verteporfin som en fotosensibilisator og anvendeligheden af PhotoAct på PDT-assays. For at validere brugen af prototypen beskrevet i dette arbejde blev en kommerciel PDT-enhed brugt under de samme eksperimentelle betingelser, herunder fotosensibilisator, celler og fluens, og resultaterne blev sammenlignet. Som vist i figuren fotoaktiverede begge enheder Verteporfin ligeligt, hvilket forbedrede den cytotoksiske virkning.Endelig blev den ROS-medierede celledød udløst af Verteporfin efter lyseksponering bekræftet ved flowcytometri ved anvendelse af DCFDA-assay. Sammenfattende blev enheden let bygget med kommercielt tilgængelige billige komponenter med en samlet pris på mindre end 50. Den vigtigste anden fordel ved enheden omfatter bærbarhed, lavt vedligeholdelsesbehov, kapacitet til at bestråle flere typer kulturplader, samtidig brug af op til fire enheder pr. analyse, nøjagtig og reproducerbar bestråling, brugervenlig og enkel opsætningsgrænseflade, der ikke kræver forbindelse til computere eller andre maskiner.Derudover præsenteres et beslutningsdiagram for at give en systematisk problemløsningsmetode til at finde og rette problemer eller fejl under operationen. Disse resultater gør det muligt at udvide fordelene ved PhotoAct for at lette PDT til videnskabelig forskning og udforske virkningsmekanismen for fotosensibilisatorer og deres kliniske anvendelser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode til isolering af stærkt Renset RNA fra Frø til brug i Kvantitative Transkriptomet Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Let Manipulation af arkitekturer i Protein-baseret Hydrogels til celle kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Forbedring af engraftment af humane inducerede pluripotente stamcelle afledte Kardiomyocytter via en forbigående hæmning af Rho Kinaseaktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cellekultur på silicium nitrid membraner og Cryopreparation for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot ved hjælp af immunoreaktionsfremmende teknologi

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay til screening for DNA-methyltransferasehæmmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...