Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

We bedanken Arthur Henrique Gomes de Oliveira en Lucas Julian Cruz Gomes voor hun hulp bij het filmproces. Dit project werd ondersteund door de Brazilian Research Council (CNPq, subsidienummers 400953/2016-1-404286/2021-6) en Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Deze studie werd ook gedeeltelijk gefinancierd door Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Constructie van het apparaat
<ol><li>Zaag 3 mm dikke vezelplaten met gemiddelde dichtheid (MDF) om stukken te verkrijgen met de afmetingen die zijn aangegeven in figuur 1A. OPMERKING: Gebruik het vectorbestand (aanvullend bestand 1) voor CNC-snijden (computer numerica...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

Het uiteindelijke PhotoACT-apparaat was handig om te bouwen met commercieel verkrijgbare, goedkope componenten voor een totale kostprijs van minder dan $ 50. Bijkomende voordelen zijn onder meer lage onderhoudsvereisten, de capaciteit om meerdere soorten kweekplaten te bestralen, het gelijktijdige gebruik van maximaal vier eenheden per test, een laag gewicht (2 kg) / grootte (44 cm3) dat draagbaarheid, nauwkeurige en reproduceerbare bestraling mogelijk maakt (gegevens niet weergegeven) en een gebruiksvriendeli...

Onder de meest dodelijke niet-overdraagbare ziekten vertegenwoordigt kanker een wereldwijd toonaangevende oorzaak van vroegtijdig overlijden. Het was goed voor bijna 10 miljoen sterfgevallen in 2020, wat neerkomt op ongeveer een op de zes sterfgevallen wereldwijd1. Bovendien vormt het fenomeen multidrugresistentie (MDR) een enorme bedreiging voor de volksgezondheid, omdat goedgekeurde chemotherapeutische protocollen de remissiestadia voor deze klinische aandoening niet bereiken2. Kankercellen kunnen resistentie tegen chemotherapie ontwikkelen via verschillende mechanismen; de overexpressie van sommige ATP-binding cassette (ABC) transporters - ATP-afhankelijke effluxpompen - wordt echter beschouwd als de belangrijkste oorzaak van MDR-ontwikkeling binnen een tumormicro-omgeving3. Naast MDR versterken andere kankercomplicaties, zoals recidief en metastase, de dringende vraag om therapeutische benaderingen te ontwikkelen en te verbeteren om deze oncologische uitdaging te overwinnen.
Het curatieve gebruik van licht wordt al eeuwenlang beoefend4, en fotodynamische therapie (PDT) vertegenwoordigt een klinisch goedgekeurde therapeutische benadering voor solide tumoren. PDT combineert de toediening van een fotosensitizer (PS) gevolgd door lichte bestraling om reactieve zuurstofsoorten (ROS) te genereren om selectieve cytotoxiciteit in tumorcellen uit te oefenen. Deze therapeutische benadering is superieur aan conventionele methoden, waaronder chirurgie, bestraling en chemotherapie5; het is een minimaal invasieve techniek die een lagere cytotoxiciteit in bindweefsels laat zien6. De lichte toepassing en PS-accumulatie direct in de tumor of zijn micro-omgeving zorgen voor nauwkeurige targeting en bijgevolg kleine, ongewenste systemische bijwerkingen7 en de mogelijkheid van herhaalde behandeling op dezelfde plaats. Bovendien zijn de kosten lager dan die van andere benaderingen. Vanwege de veelbelovende kenmerken kan PDT worden beschouwd als een geschikte optie voor zowel enkelvoudige, vooral in het geval van inoperabele tumoren, als adjuvante kankerbehandeling7, en vertegenwoordigt het een alternatief voor MDR gerelateerd aan chemotherapie 8,9.
Het eerste rapport met een hoge objectieve respons met PDT werd in 1975 beschreven in een muis en rat model10. Sindsdien zijn studies uitgevoerd met PDT met positieve uitkomsten7 zowel in vivo als in vitro met menselijke tumorcellijnen in 2D-celcultuur11,12. Gezien de brede toepasbaarheid van klinisch goedgekeurde PS, ongeacht hun specifieke accumulatieroutes en golflengtebereiken van absorptiepieken, is het algemene proces als volgt: (i) PS-opname, (ii) pieken van PS-concentratie bij de tumor of zijn micro-omgeving, (iii) lichttoepassing, (iv) PS-lichtinteractie, (v) overdracht van PS-opgewekte energie naar weefselsubstraat of omringende zuurstofmoleculen, (vi) ROS-productie met singletzuurstof- of superoxide-anion, vii) tumorceldood via, in wezen, necrose of apoptose (directe dood), autofagie (cytoprotectief mechanisme), weefselischemie (vasculaire schade), immuunmodulatie of een overlapping van deze mechanismen7. In deze laatste fase hangt de activering van een specifieke celdoodroute af van vele factoren, zoals celkenmerken, experimenteel ontwerp en, belangrijker nog, PS intracellulaire lokalisatie en PDT-gerelateerde gerichte schade13.
Verteporfine is een ps van de tweede generatie, goedgekeurd door regelgevende instanties voor klinisch gebruik in Noorwegen en China voor de behandeling van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie7. Na toediening van de dosis werd gemeld dat dit prodrug zich gedeeltelijk ophoopte in mitochondriën14 en cellulaire eiwit tyrosinefosforylering en DNA-fragmentatie induceerde, wat leidde tot tumorcelapoptose 15,16. Na 24 uur incubatie voor verteporfine internalisatie, wordt een PDT-protocol met behulp van een 690 nm golflengte-opstelling aanbevolen om effectieve niveaus van elektromagnetische stralingsoverdracht naar aangrenzende moleculen te bereiken 7,17.
Wat de lichtbron voor PDT betreft, zijn de klassieke diodelasersystemen meestal duur, technisch ingewikkeld, oversized en dus niet overdraagbaar18,19. Als gevolg van het profiel met één golflengte, dat ook kan worden waargenomen in LED-gebaseerde PDT-apparatuur, maakt de vraag naar onafhankelijke eenheden voor elke fotosensitizertoepassing het gebruik van diodelasersystemen nog complexer en economisch onhaalbaar20,21. Daarom wordt het gebruik van LED-machines beschouwd als het meest veelbelovende alternatief om niet alleen kosten22 en onderhoudsproblemen op te lossen, maar ook om een hoog vermogen en minder schadelijk23 en een breder verlichtingsvermogente bieden 24,25,26,27.
Ondanks de potentiële bijdrage die LED-gebaseerde apparatuur kan bieden aan PDT-experimenten28, hebben de meeste commerciële opties nog steeds nadelen, zoals een gebrek aan draagbaarheid, hoge kosten en complexe bouwprojecten en exploitatie29. Het belangrijkste doel van dit werk was om een eenvoudig en betrouwbaar hulpmiddel te bieden voor in vitro PDT-testen. Dit artikel beschrijft PhotoACT, een in eigen huis gebouwd LED-gebaseerd PDT-apparaat, dat goedkoop, gebruiksvriendelijk en draagbaar is. Als proof of concept is aangetoond dat dit apparaat de cytotoxiciteit van verteporfine in een 2D-celkweekmodel verbetert en daarom kan het worden gebruikt als een onderzoeksinstrument in PDT-experimenten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

Dit artikel beschrijft een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om in vitro fotodynamische therapie (PDT) assays uit te voeren, genaamd de PhotoACT. Het apparaat is gebouwd met behulp van een set conventionele programmeerbare lichtgevende diodes (LED's), een LCD-module (Liquid Crystal Display) en een lichtsensor die is aangesloten op een commercieel microcontrollerbord. De doosgebaseerde structuur van het prototype is gemaakt met vezelplaten met gemiddelde dichtheid (MDF's). Het interne compartiment kan tegelijkertijd vier celkweek multiwell microplaten toewijzen.
Als proof of concept bestudeerden we het cytotoxische effect van de photosensitizer (PS) verteporfine tegen de HeLa cellijn in tweedimensionale (2D) cultuur. HeLa-cellen werden behandeld met toenemende concentraties verteporfine gedurende 24 uur. Het geneesmiddelbevattende supernatantmedium werd weggegooid, de aanhangende cellen werden gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en medicijnvrij medium werd toegevoegd. In deze studie werd het effect van verteporfine op cellen onderzocht zonder blootstelling aan licht of na blootstelling gedurende 1 uur aan licht met behulp van rood-groen-blauwe (RGB) waarden van 255, 255 en 255 (gemiddelde fluence van 49,1 ± 0,6 J / cm2). Na 24 uur werd de levensvatbaarheid van de cel beoordeeld met de 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test.
Experimentele resultaten toonden aan dat blootstelling van cellen behandeld met verteporfine aan het licht van het apparaat het cytotoxische effect van het medicijn verbetert via een mechanisme gemedieerd door reactieve zuurstofsoorten (ROS). Bovendien werd het gebruik van het prototype dat in dit werk wordt beschreven gevalideerd door de resultaten te vergelijken met een commercieel PDT-apparaat. Dit op LED gebaseerde prototype van fotodynamische therapie is dus een goed alternatief voor in vitro studies van PDT.

Het laatste PDT-apparaat, genaamd de PhotoACT, bevatte een donkere kamer om maximaal vier multiwell-microplaten toe te wijzen, waarbij het bovenste binnenoppervlak was uitgerust met een set van 30 verspreide LED's die waren geprogrammeerd om verschillende spectrums van zichtbaar licht uit te zenden (figuur 3 en aanvullend bestand 6). Het apparaat is gebouwd met behulp van twee bijbehorende dozen: een interne doos die is ontworpen als een donkere kamer voor de PDT-testen en e...

Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Hier beschrijven we een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om met succes in vitro fotodynamische therapie (PDT) -testen uit te voeren met behulp van tweedimensionale HeLa-celcultuur en verteporfine als een fotosensitizer.

Een in-house gebouwd en licht-emitting-diode-gebaseerd fotodynamisch therapie-apparaat voor het verbeteren van verteporfine cytotoxiciteit in een 2D-celcultuurmodel

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

Fotodynamische therapie, PDT, biedt verschillende voordelen voor de behandeling van kanker, en de werkzaamheid ervan hangt af van een lichtbron om een fotosensitizer te activeren. Hoewel recente ontwikkelingen in het veld, is er een gebrek aan toegang tot een duur en reproduceerbaar apparaat voor PTD voor in vitro modellen. Om aan deze vraag te voldoen, beschrijft dit werk een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om PDT-testen uit te voeren op celculturen, genaamd PhotoAct.Om de bouw te starten, zag drie millimeter dikte vezelplaten met gemiddelde dichtheid, MDF, om stukken met de volgende afmetingen te verkrijgen. Bouw twee dozen met de volgende afmetingen. Boor de achterkant van de grotere doos om een barrel jack-connector te installeren.Boor ook de bovenkant van de grotere doos, de bovenkant en de onderkant van de kleinere doos om een doorgang te bieden voor elektrische kabels. Verf alle interne oppervlakken met zwarte inkt om een homogene lichtinval te bevorderen. Bevestig parallel drie LED-tapes met elk 10 LED's aan het bovenste binnenoppervlak van de kleinere doos.Installeer bovendien een helderheidssensor in het midden van het onderste binnenoppervlak van de kleinere doos. Druk de structuur van de besturingseenheid af met behulp van het aanvullende 3D-afdrukbestand. Installeer alle componenten, aan / uit-knop, potentiometers, time start touchpad, LED's, helderheidssensor, LCD, zoemer en voeding, en de onderdelen van een ESP-32 controller board gemonteerd op de controle-eenheid interieur.Upload de programmeercode die beschikbaar is in het aanvullende bestand en voer een test uit om te controleren of alle verbindingen werken. Monteer de dozen en bevestig ze aan elkaar om gaten en bijgevolg externe verlichtingsinterferentie en onmiddellijk lichtverlies te voorkomen. Bevestig de gemonteerde besturingseenheid aan het geboorde gebied aan de bovenkant van het prototype.Bouw een voordeur van hetzelfde materiaal in de volgende afmetingen en bevestig deze op de buitenste doos met scharnieren en klittenband om kamersluiting en ononderbroken testen te garanderen. Installeer ook een handgreep om de voordeur met gemak en precisie te manipuleren. Bevestig vier rubberen voetkussens aan de onderkant van het prototype om meer stabiliteit tijdens de bewerkingen te garanderen.Cultiveer HeLa cellijn in Dulbecco's Modified Eagle Medium lage glucose met 10% foetaal runderserum en 1% gentamycine. Houd de kweekkolven op 5% van koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Beheer en inspecteer de celcultuur totdat 80 tot 90% van de samenvloeiing is bereikt.Start het protocol voor de levensvatbaarheid van cellen met het zaaiproces. Verwijder het medium uit de kolf met samenvloeiende HeLa-celcultuur. Was de kolf met fosfaatbufferzoutoplossing, PBS, en maak de cultuur los met trypsine na gemarkeerde details.Tel de resuspendcellen met een hemocytometer en zaai ze in een multi-well microplaat met een concentratie van 20.000 cellen per put. Bereid twee platen voor op donkere en lichte behandelingsomstandigheden en incubeer ze gedurende 24 uur tot celaanhechting. Om door te gaan met de behandeling met een fotosensitizer, verwijdert u het medium uit beide platen en behandelt u de cellen met 100 microliter toenemende concentraties Verteporfine.Houd de cellen 24 uur in behandeling om Verteporfin internalisatie mogelijk te maken. Verwijder na incubatie de behandeling, was de cellen met PBS en voeg een medicijnvrij medium toe. Bedek een microplaat met aluminiumfolie om het te beschermen tegen blootstelling aan licht en incubeer het gedurende 24 uur.Deze microplaat biedt controlegegevens voor verdere analyse van PDT-resultaten. De andere microplaat zal worden gebruikt bij blootstelling aan licht bij de PhotoAct. Om de apparatuur te bedienen, sluit u deze aan op het stopcontact en schakelt u deze in met een druk op de aan / uit-knop.Plaats de multi-well microplaat in de PDT-kamer en sluit de apparatuur door de voordeur vast te maken met de zijklittenband. Om de apparatuur in te stellen, gebruikt u de potentiometers om de RGB-configuratie van de lichtemissie aan te passen. Druk op het plus/min touchpad om de tijdconfiguratie aan te passen en de duur van de test in te stellen.Controleer of de juiste informatie over de test op het display wordt weergegeven en breng indien nodig de laatste aanpassingen aan. Druk op het start-touchpad om de test te starten. Aan het begin van het experiment moet een zoemer met één pieptoon te horen zijn.Tijdens het experiment kan voortgangsinformatie op het display worden waargenomen, zoals bestraling en resterende tijd. Open de voordeur niet en wijzig geen configuratie tijdens de PDT-test. Aan het einde van de test moet een zoemer met vier piepjes worden gehoord en het elektronische systeem schakelt alle LED's uit.Een voltooid bericht en de uiteindelijke hoeveelheid energie die tijdens het experiment is uitgebreid, kunnen op het display worden waargenomen. De fluence eindwaarde wordt berekend volgens de gemarkeerde vergelijking. Bedek de microplaat die licht heeft ondervonden en ga verder met de 24-uurs incubatie.Verwijder na de incubatietijd het medium van beide platen, was de monolaag van cellen met PBS en voeg MTT-oplossing toe. Incubeer beide platen gedurende vier uur donkere en lichte omstandigheden om de vorming van formazankristallen mogelijk te maken. Verwijder de MTT-oplossing voorzichtig en los de paarse kristallen op met een DMSO- en ethanoloplossing.Na volledige kristaloplossing voert u de absorptiemeting uit met behulp van een microplaatlezer op 595 nanometer. Het eindproduct bestaat uit een donkere kamer met het bovenste binnenoppervlak uitgerust met een set van 30 verstrooide lichtgevende diodes, LED's, geprogrammeerd om verschillende spectrums van zichtbaar licht uit te zenden. Een homogene lichtinval wordt vastgesteld door de lage reflectiviteit van binnenoppervlakken en de uniforme verdeling van de LED-configuratie.De installatie-interface is gebruiksvriendelijk en de vaste experimentele toestand was reproduceerbaar. Als proof of concept werd het apparaat gebruikt om het cytotoxische effect van Verteporfine in 2D HeLa-celcultuur na blootstelling aan licht te versterken. Zoals te zien is in de figuur, was de GI50-waarde 3,1 micromolair voor de lichtconditie.en 13,8 micromolair voor de donkere toestand Daarom bevestigt de toename van meer dan het viervoudige van de efficiëntie bij het vergelijken van de omstandigheden het gebruik van Verteporfin als fotosensitizer en de toepasbaarheid van PhotoAct op PDT-assays. Om het gebruik van het prototype dat in dit werk wordt beschreven te valideren, werd een commercieel PDT-apparaat gebruikt onder dezelfde experimentele omstandigheden, inclusief photosensitizer, cellen en fluence, en de resultaten werden vergeleken. Zoals te zien is in de figuur, fotoactiveerden beide apparaten Verteporfine in gelijke mate, waardoor het cytotoxische effect werd versterkt.Ten slotte werd de ROS-gemedieerde celdood veroorzaakt door Verteporfin na blootstelling aan licht bevestigd door flowcytometrie met behulp van DCFDA-assay. Kortom, het apparaat is eenvoudig gebouwd met commercieel verkrijgbare goedkope componenten met een totale kostprijs van minder dan 50. Het belangrijkste andere voordeel van het apparaat is draagbaarheid, lage onderhoudsvraag, capaciteit om meerdere soorten kweekplaten te bestralen, het gelijktijdige gebruik van maximaal vier eenheden per test, nauwkeurige en reproduceerbare bestraling, gebruiksvriendelijke en eenvoudige installatie-interface die geen verbinding met computers of andere machines vereist.Daarnaast wordt een beslissingsstroomdiagram gepresenteerd om een systematische probleemoplossende aanpak te bieden om problemen of fouten tijdens de operatie te vinden en te corrigeren. Deze bevindingen maken het mogelijk om de voordelen van PhotoAct uit te breiden om PDT te vergemakkelijken tot wetenschappelijk onderzoek, waarbij het werkingsmechanisme van fotosensitizers en hun klinische toepassingen wordt onderzocht.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot met behulp van Immunoreaction Enhancing Technology

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...