Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

Nous remercions Arthur Henrique Gomes de Oliveira et Lucas Julian Cruz Gomes pour leur aide dans le processus de tournage. Ce projet a été soutenu par le Conseil brésilien de la recherche (CNPq, numéros de subvention 400953/2016-1-404286/2021-6) et Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Cette étude a également été financée en partie par Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Construction de l’appareil
<ol><li>Scie des panneaux de fibres de densité moyenne (MDF) de 3 mm d’épaisseur pour obtenir des pièces dont les dimensions sont indiquées à la figure 1A. Remarque : Utilisez le fichier vectoriel (fichier supplémentaire 1) po...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

Le dernier appareil PhotoACT était pratique à construire avec des composants disponibles dans le commerce et à faible coût à un coût total inférieur à 50 $. Les avantages supplémentaires incluent de faibles exigences d’entretien, la capacité d’irradier plusieurs types de plaques de culture, l’utilisation simultanée de jusqu’à quatre unités par essai, un faible poids (2 kg)/taille (44 cm3) qui permet la portabilité, une irradiation précise et reproductible (données non présentées) et u...

Parmi les maladies non transmissibles les plus mortelles, le cancer est l’une des principales causes mondiales de décès prématuré. Il a représenté près de 10 millions de décès en 2020, soit environ un décès sur six dans le monde1. De plus, le phénomène de multirésistance (MDR) représente une menace considérable pour la santé publique, car les protocoles chimiothérapeutiques approuvés n’atteignent pas les stades de rémission pour cette condition clinique2. Les cellules cancéreuses peuvent développer une résistance à la chimiothérapie par plusieurs mécanismes; cependant, la surexpression de certains transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) - les pompes à efflux dépendantes de l’ATP - est considérée comme la principale cause du développement de MDR dans un microenvironnement tumoral3. En plus de la MDR, d’autres complications du cancer, telles que la récidive et les métastases, renforcent la demande urgente de développer et d’améliorer des approches thérapeutiques pour surmonter ce défi oncologique.
L’utilisation curative de la lumière est pratiquée depuis des siècles4, et la thérapie photodynamique (PDT) représente une approche thérapeutique cliniquement approuvée pour les tumeurs solides. La PDT combine l’administration d’un photosensibilisateur (PS) suivie d’une irradiation lumineuse pour générer des espèces réactives de l’oxygène (ROS) afin d’exercer une cytotoxicité sélective dans les cellules tumorales. Cette approche thérapeutique est supérieure aux méthodes conventionnelles, y compris la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie5; Il s’agit d’une technique mini-invasive montrant une cytotoxicité plus faible dans les tissus conjonctifs6. L’application de lumière et l’accumulation de PS directement dans la tumeur ou son microenvironnement assurent un ciblage précis et, par conséquent, des effets secondaires systémiques mineurs et indésirables7 et la possibilité de traitements répétés sur le même site. De plus, le coût est inférieur à celui des autres approches. En raison de ses caractéristiques prometteuses, la PDT peut être considérée comme une option appropriée à la fois pour les tumeurs uniques, en particulier dans le cas de tumeurs inopérables, ou pour le traitement adjuvant du cancer7, et représente une alternative à la MDR liée à la chimiothérapie 8,9.
Le premier rapport montrant un taux de réponse objective élevé à l’aide de la PDT a été décrit en 1975 dans un modèle10 de souris et de rats. Depuis lors, des études ont été menées en utilisant la PDT avec des résultats positifs7 à la fois in vivo et in vitro avec des lignées cellulaires tumorales humaines en culture cellulaire2D 11,12. Compte tenu de la large applicabilité de la PS cliniquement approuvée, quelles que soient leurs voies d’accumulation spécifiques et leurs gammes de longueurs d’onde des pics d’absorption, le processus général est le suivant: (i) absorption du PS, (ii) pic de concentration de PS à la tumeur ou à son microenvironnement, (iii) application de lumière, (iv) interaction PS-lumière, (v) transfert de l’énergie PS excitée à l’état d’excitation PS au substrat tissulaire ou aux molécules d’oxygène environnantes, (vi) la production de ROS impliquant de l’oxygène singulet ou de l’anion superoxyde, (vii) la mort des cellules tumorales via, essentiellement, la nécrose ou l’apoptose (mort directe), l’autophagie (mécanisme cytoprotecteur), l’ischémie tissulaire (lésions vasculaires), la modulation immunitaire ou un chevauchement de ces mécanismes7. Dans cette dernière étape, l’activation d’une voie de mort cellulaire spécifique dépend de nombreux facteurs, tels que les caractéristiques cellulaires, la conception expérimentale et, surtout, la localisation intracellulaire PS et les dommages ciblés liés à la PDT13.
La vertéporfine est un PS de deuxième génération, approuvé par les organismes de réglementation pour une utilisation clinique en Norvège et en Chine pour traiter la dégénérescence maculaire liée à l’âge7. Après l’administration de la dose, il a été rapporté que cette prodrogue s’accumulait partiellement dans les mitochondries14 et induisait la phosphorylation de la protéine cellulaire tyrosine et la fragmentation de l’ADN, conduisant à l’apoptose des cellules tumorales15,16. Après 24 h d’incubation pour l’internalisation des vertéporfines, un protocole PDT utilisant une configuration de longueur d’onde de 690 nm est recommandé pour atteindre des niveaux efficaces de transfert de rayonnement électromagnétique aux molécules adjacentes 7,17.
En ce qui concerne la source lumineuse pour PDT, les systèmes laser à diodes classiques sont généralement coûteux, techniquement compliqués, surdimensionnés, et donc non portables18,19. En raison de son profil de longueur d’onde unique, qui peut également être observé dans les équipements PDT à base de LED, la demande d’unités indépendantes pour chaque application de photosensibilisateur rend l’utilisation de systèmes laser à diodes encore plus complexe et économiquement irréalisable20,21. Par conséquent, l’utilisation de machines LED est considérée comme l’alternative la plus prometteuse pour résoudre non seulement les coûts22 et les problèmes de maintenance, mais aussi pour fournir une puissance de sortie élevée et une capacité d’éclairage moins nocive 23 et plus large 24,25,26,27.
Malgré la contribution potentielle que l’équipement à base de LED peut offrir aux expériences PDT28, la plupart des options commerciales présentent encore des inconvénients tels qu’un manque de portabilité, des coûts élevés et des projets de construction et d’exploitationcomplexes 29. L’objectif principal de ce travail était d’offrir un outil simple et fiable pour les tests PDT in vitro . Cet article décrit PhotoACT, un appareil PDT à LED construit en interne, qui est peu coûteux, convivial et portable. En tant que preuve de concept, il a été démontré que ce dispositif améliore la cytotoxicité de la vertéporfine dans un modèle de culture cellulaire 2D et, par conséquent, peut être utilisé comme outil de recherche dans les expériences PDT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

Cet article décrit un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer des tests de thérapie photodynamique in vitro (PDT), appelé PhotoACT. Le dispositif a été construit à l’aide d’un ensemble de diodes électroluminescentes programmables (LED) conventionnelles, d’un module d’affichage à cristaux liquides (LCD) et d’un capteur de lumière connecté à une carte de microcontrôleur commerciale. La structure à base de boîte du prototype a été réalisée avec des panneaux de fibres de densité moyenne (MDF). Le compartiment interne peut attribuer simultanément quatre microplaques multipuits de culture cellulaire.
Comme preuve de concept, nous avons étudié l’effet cytotoxique de la vertéporfine photosensibilisante (PS) contre la lignée cellulaire HeLa en culture bidimensionnelle (2D). Les cellules HeLa ont été traitées avec des concentrations croissantes de vertéporfine pendant 24 heures. Le milieu surnageant contenant du médicament a été jeté, les cellules adhérentes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et un milieu sans médicament a été ajouté. Dans cette étude, l’effet de la vertéporfine sur les cellules a été examiné soit sans exposition à la lumière, soit après une exposition de 1 h à la lumière en utilisant des valeurs rouge-vert-bleu (RVB) de 255, 255 et 255 (fluence moyenne de 49,1 ± 0,6 J / cm2). Après 24 h, la viabilité cellulaire a été évaluée par le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT).
Les résultats expérimentaux ont montré que l’exposition des cellules traitées à la vertéporfine à la lumière du dispositif renforce l’effet cytotoxique du médicament via un mécanisme médié par les espèces réactives de l’oxygène (ROS). De plus, l’utilisation du prototype décrit dans ce travail a été validée en comparant les résultats avec un dispositif PDT commercial. Ainsi, ce prototype de thérapie photodynamique à base de LED représente une bonne alternative pour les études in vitro de la PDT.

Le dernier dispositif PDT, nommé PhotoACT, comprenait une chambre sombre pour attribuer jusqu’à quatre microplaques multipuits, avec sa surface intérieure supérieure équipée d’un ensemble de 30 LED dispersées programmées pour émettre des spectres distincts de lumière visible (Figure 3 et Fichier supplémentaire 6). Le dispositif a été construit à l’aide de deux boîtiers associés : un boîtier interne conçu comme une chambre sombre pour les tests PDT, et...

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An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Ici, nous décrivons un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer avec succès des tests de thérapie photodynamique in vitro (PDT) en utilisant une culture cellulaire HeLa bidimensionnelle et une vertéporfine comme photosensibilisant.

Dispositif de thérapie photodynamique construit en interne et à base de diodes électroluminescentes pour améliorer la cytotoxicité des vertéporfines dans un modèle de culture cellulaire 2D

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

La thérapie photodynamique, PDT, offre plusieurs avantages au traitement du cancer, et son efficacité dépend d’une source lumineuse pour activer un photosensibilisant. Malgré les progrès récents dans le domaine, il y a un manque d’accès à un dispositif coûteux et reproductible pour PTD pour les modèles in vitro. Afin de répondre à cette demande, ce travail décrit un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer des tests PDT sur des cultures cellulaires, appelé PhotoAct.Pour commencer la construction, scie des panneaux de fibres de densité moyenne de trois millimètres d’épaisseur, MDF, pour obtenir des pièces avec les dimensions suivantes. Construisez deux boîtes avec les dimensions suivantes. Percez l’arrière de la plus grande boîte pour installer un connecteur de prise de barillet.Percez également le haut de la plus grande boîte, le haut et le bas de la plus petite boîte pour permettre un passage aux câbles électriques. Peignez toutes les surfaces internes avec de l’encre noire pour favoriser une incidence homogène de la lumière. Fixez en parallèle trois rubans LED avec 10 LED chacun sur la surface intérieure supérieure de la plus petite boîte.De plus, installez un capteur de luminosité au centre de la surface intérieure inférieure de la plus petite boîte. Imprimez la structure de l’unité de commande à l’aide du fichier d’impression 3D supplémentaire. Installez tous les composants, le bouton d’alimentation, les potentiomètres, le pavé tactile de démarrage de l’heure, les LED, le capteur de luminosité, l’écran LCD, le buzzer et l’alimentation, ainsi que les pièces d’une carte contrôleur ESP-32 montée à l’intérieur de l’unité de commande.Téléchargez le code de programmation disponible dans un fichier supplémentaire et exécutez un test pour vérifier que toutes les connexions fonctionnent. Assemblez les boîtes et fixez-les ensemble pour éviter les lacunes et, par conséquent, les interférences d’éclairage externe et la perte de lumière immédiate. Fixez l’unité de commande montée à la zone percée au sommet du prototype.Construisez une porte d’entrée du même matériau dans les dimensions suivantes et fixez-la sur la boîte extérieure avec des charnières et des rubans Velcro pour assurer la fermeture de la chambre et des tests ininterrompus. Installez également une poignée pour manipuler la porte d’entrée avec facilité et précision. Fixez quatre repose-pieds en caoutchouc au bas du prototype pour assurer une plus grande stabilité pendant les opérations.Cultivez la lignée cellulaire HeLa dans la lignée cellulaire Eagle modifiée de Dulbecco à faible teneur moyenne en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de gentamycine. Gardez les flacons de culture à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Gérer et inspecter la culture cellulaire jusqu’à atteindre 80 à 90% de confluence.Démarrez le protocole de viabilité cellulaire avec le processus d’ensemencement. Retirer le milieu de la fiole avec culture cellulaire HeLa confluente. Laver le ballon avec une solution saline tampon phosphate, PBS, et détacher la culture avec de la trypsine en suivant les détails mis en évidence.Compter les cellules en suspension à l’aide d’un hémocytomètre et les ensemencer dans une microplaque multipuits à une concentration de 20 000 cellules par puits. Préparez deux plaques pour les conditions sombres et claires du traitement et incuberez-les pendant 24 heures pour la fixation cellulaire. Pour procéder au traitement avec un photosensibilisant, retirez le milieu des deux plaques et traitez les cellules avec 100 microlitres de concentrations croissantes de vertéporfine.Gardez les cellules sous traitement pendant 24 heures pour permettre l’internalisation de la vertéporfine. Après l’incubation, retirez le traitement, lavez les cellules avec du PBS et ajoutez un milieu sans médicament. Couvrez une microplaque de papier d’aluminium pour la protéger de l’exposition à la lumière et incuber pendant 24 heures.Cette microplaque offrira des données de contrôle pour une analyse plus approfondie des résultats de la PDT. L’autre microplaque sera utilisée en condition d’exposition à la lumière au PhotoAct. Pour faire fonctionner l’équipement, branchez-le dans la prise et allumez-le en appuyant sur le bouton d’alimentation.Placez la microplaque multipuits dans la chambre PDT et fermez l’équipement en fixant la porte frontale avec les bandes velcro latérales. Pour configurer l’équipement, utilisez les potentiomètres pour ajuster la configuration RVB de l’émission lumineuse. Appuyez sur le pavé tactile plus/moins pour ajuster la configuration de l’heure et définir la durée du test.Vérifiez si les informations correctes sur le test sont affichées sur l’écran et effectuez les derniers ajustements si nécessaire. Appuyez sur le pavé tactile de démarrage pour lancer le test. Un signal sonore à un bip doit être entendu au début de l’expérience.Au cours de l’expérience, des informations de progression peuvent être observées à l’écran, telles que l’irradiance et le temps restant. N’ouvrez pas la porte d’entrée et ne modifiez aucune configuration pendant le test PDT. À la fin du test, un buzzer à quatre bips doit être entendu et le système électronique éteindra toutes les LED.Un message fini et la quantité finale d’énergie expansée pendant l’expérience peuvent être observés à l’écran. La valeur finale de fluence est calculée selon l’équation mise en surbrillance. Couvrir la microplaque qui a subi une exposition à la lumière et procéder à l’incubation de 24 heures.Après la période d’incubation, retirer le milieu des deux plaques, laver la monocouche de cellules avec du PBS et ajouter une solution de MTT. Incuber les deux plaques dans des conditions sombres et claires pendant quatre heures pour permettre la formation de cristaux de formazan. Retirez soigneusement la solution de MTT et dissolvez les cristaux violets avec une solution de DMSO et d’éthanol.Après dissolution complète des cristaux, effectuez la mesure de l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques à 595 nanomètres. Le produit final consiste en une chambre sombre avec sa surface intérieure supérieure équipée d’un ensemble de 30 diodes électroluminescentes diffusées, LED, programmées pour émettre des spectres distincts de lumière visible. Une incidence homogène de la lumière est établie en raison de la faible réflectivité des surfaces intérieures et de la répartition uniforme de la configuration des LED.L’interface de configuration est conviviale et les conditions expérimentales établies étaient reproductibles. Comme preuve de concept, le dispositif a été utilisé pour améliorer l’effet cytotoxique de la vertéporfine dans la culture cellulaire HeLa 2D après une exposition à la lumière. Comme le montre la figure, la valeur GI50 était de 3,1 micromolaires pour les conditions d’éclairage.et 13,8 micromolaires pour l’état sombre Par conséquent, l’augmentation de plus de quatre fois de l’efficacité par rapport aux conditions confirme l’utilisation de Verteporfin comme photosensibilisant et l’applicabilité de PhotoAct sur les tests PDT. Pour valider l’utilisation du prototype décrit dans ce travail, un dispositif PDT commercial a été utilisé dans les mêmes conditions expérimentales, y compris le photosensibilisant, les cellules et la fluence, et les résultats ont été comparés. Comme le montre la figure, les deux dispositifs ont photoactivé la vertéporfine de manière égale, renforçant ainsi l’effet cytotoxique.Enfin, la mort cellulaire médiée par ROS déclenchée par la vertéporfine après exposition à la lumière a été confirmée par cytométrie en flux à l’aide du test DCFDA. En résumé, l’appareil a été facilement construit avec des composants à faible coût disponibles dans le commerce avec un coût total inférieur à 50. Les principaux autres avantages de l’appareil comprennent la portabilité, la faible demande de maintenance, la capacité d’irradier plusieurs types de plaques de culture, l’utilisation simultanée de jusqu’à quatre unités par essai, une irradiation précise et reproductible, une interface de configuration conviviale et simple qui ne nécessite pas de connexion à des ordinateurs ou à d’autres machines.En outre, un organigramme de décision est présenté pour fournir une approche systématique de résolution de problèmes afin de trouver et de corriger les problèmes ou les erreurs pendant l’opération. Ces résultats permettent d’étendre les avantages de PhotoAct pour faciliter la PDT à la recherche scientifique, en explorant le mécanisme d’action des photosensibilisateurs et leurs applications cliniques.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Une méthode efficace pour l&#39;isolement de l&#39;ARN hautement purifiées de semences pour une utilisation dans quantitative transcriptome Analyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Recherche

Biochimie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Manipulation facile des Architectures à base de protéines Hydrogels pour Applications de Culture de cellules

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

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Étude sur le métabolisme de six insecticides systémiques dans une culture de suspension cellulaire nouvellement établie dérivée du thé (Camellia Sinensis L.) feuilles

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Améliorer l'engraftment des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme par l'intermédiaire d'une inhibition transitoire de l'activité de Rho Kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Tache occidentale à très grande vitesse utilisant la technologie d’amélioration de l’immunoréaction

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

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Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

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