Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

אנו מודים לארתור אנריקה גומז דה אוליביירה ולוקאס ג'וליאן קרוז גומז על שעזרו בתהליך הצילומים. פרויקט זה נתמך על ידי מועצת המחקר הברזילאית (CNPq, מספרי מענקים 400953/2016-1-404286/2021-6) ו- Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). מחקר זה מומן בחלקו גם על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. בניית מכשירים
<ol><li>ראה לוחות סיבית בעובי 3 מ"מ בצפיפות בינונית (MDF) כדי לקבל חלקים עם הממדים המוצגים באיור 1A. הערה: השתמש בקובץ הווקטורי (<s...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

מכשיר PhotoACT הסופי היה נוח לבנייה עם רכיבים זמינים מסחרית בעלות נמוכה בעלות כוללת של פחות מ-$50. יתרונות נוספים כוללים דרישות תחזוקה נמוכות, יכולת להקרין סוגים רבים של לוחות תרבית, שימוש בו זמנית של עד ארבע יחידות לכל בדיקה, משקל נמוך (2 ק"ג)/גודל (44 ס"מ3) המאפשר ניידות, הקרנה מדויקת וניתנת ל?...

בין המחלות הקטלניות ביותר שאינן ניתנות לתקשורת, סרטן מהווה גורם מוביל בעולם למוות בטרם עת. הוא היווה כמעט 10 מיליון מקרי מוות בשנת 2020, המייצגים בערך אחד מכל שישה מקרי מוות ברחבי העולם1. בנוסף, תופעת העמידות למולטי-דרוג (MDR) מהווה איום עצום על בריאות הציבור, שכן פרוטוקולים כימותרפיים מאושרים אינם מצליחים להגיע לשלבי הפוגה עבור מצב קליני זה2. תאים סרטניים יכולים לפתח עמידות לכימותרפיה באמצעות מספר מנגנונים; עם זאת, ביטוי יתר של כמה מובילי קלטות מחייבות ATP (ABC) - משאבות efflux תלויות ATP - נחשב הגורם העיקרי להתפתחות MDR בתוך מיקרו-סביבה של גידול3. בנוסף ל- MDR, סיבוכי סרטן אחרים, כגון הישנות וגרורות, מחזקים את הדרישה הדחופה לפתח ולשפר גישות טיפוליות כדי להתגבר על אתגר אונקולוגי זה.
הניצול המרפא של האור היה נהוג במשך מאותשנים, וטיפול פוטודינמי (PDT) מייצג גישה טיפולית מאושרת קלינית לגידולים מוצקים. PDT משלב מתן של פוטו-סנסיטייזר (PS) ואחריו קרינת אור כדי ליצור מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להפעיל ציטוטוקסיות סלקטיבית בתאי הגידול. גישה טיפולית זו עדיפה על השיטות הקונבנציונליות, הכוללות ניתוח, הקרנות וכימותרפיה5; זוהי טכניקה זעיר פולשנית המציגה ציטוטוקסיות נמוכה יותר ברקמות חיבור6. יישום האור והצטברות PS ישירות בגידול או במיקרו-סביבה שלו מבטיחים מיקוד מדויק, וכתוצאה מכך, תופעות לוואי מערכתיות קלות ובלתי רצויות7 ואפשרות לטיפול חוזר באותו אתר. יתר על כן, העלות נמוכה מזו של גישות אחרות. בשל התכונות המבטיחות שלה, PDT יכול להיחשב אופציה מתאימה עבור שניהם יחיד, במיוחד במקרה של גידולים שאינם ניתנים לניתוח, או טיפול בסרטן אדג'ובנטי7, ומייצג חלופה ל- MDR הקשורה לכימותרפיה 8,9.
הדו"ח הראשון שהראה שיעור תגובה אובייקטיבי גבוה באמצעות PDT תואר בשנת 1975 במודל10 של עכבר וחולדה. מאז, נערכו מחקרים באמצעות PDT עם תוצאות חיוביות7 הן in vivo והן in vitro עם קווי תאים סרטניים אנושיים בתרבית תאים דו-ממדית11,12. בהתחשב בתחולה הרחבה של PS שאושר קלינית, ללא קשר למסלולי ההצטברות הספציפיים שלהם ולטווחי אורכי הגל של פסגות הבליעה, התהליך הכללי הוא כדלקמן: (i) ספיגת PS, (ii) שיא של ריכוז PS בגידול או במיקרו-סביבה שלו, (iii) יישום אור, (iv) אינטראקציה PS-light, (v) העברת אנרגיה במצב התרגשות PS למצע רקמה או למולקולות חמצן הסובבות אותם, (vi) ייצור ROS הכולל חמצן סינגלט או אניון סופראוקסיד, (vii) מוות של תאי גידול באמצעות, למעשה, נמק או אפופטוזיס (מוות ישיר), אוטופגיה (מנגנון ציטופרוטקטיבי), איסכמיה של רקמות (נזק לכלי הדם), אפנון חיסוני, או חפיפה של מנגנונים אלה7. בשלב סופי זה, ההפעלה של מסלול מוות תאי מסוים תלויה בגורמים רבים, כגון מאפייני התא, תכנון ניסוי, והכי חשוב, לוקליזציה תוך-תאית של PS ונזק ממוקד הקשור ל-PDT13.
Verteporfin הוא דור שני של PS, שאושר על ידי סוכנויות רגולטוריות לשימוש קליני בנורווגיה ובסין לטיפול בניוון מקולרי הקשור לגיל7. לאחר מתן המינון, דווח כי פרודרוג זה מצטבר באופן חלקי במיטוכונדריה14 וגורם לזרחון חלבון תאי טירוזין ולפיצול DNA, מה שמוביל לאפופטוזיס של תאי הגידול15,16. לאחר דגירה של 24 שעות להפנמת ורטפורפין, מומלץ פרוטוקול PDT המשתמש במערך אורך גל של 690 ננומטר כדי להשיג רמות יעילות של העברת קרינה אלקטרומגנטית למולקולות סמוכות 7,17.
לגבי מקור האור עבור PDT, מערכות הלייזר הדיודה הקלאסיות הן בדרך כלל יקרות, מסובכות מבחינה טכנית, גדולות מדי, ולכן18,19 שאינן ניתנות להעברה. כתוצאה מפרופיל אורך הגל היחיד שלו, שניתן לצפות בו גם בציוד PDT מבוסס LED, הדרישה ליחידות עצמאיות עבור כל יישום פוטו-סנסיטייזר הופכת את השימוש במערכות לייזר דיודה למורכב עוד יותר ובלתי ישים מבחינה כלכלית20,21. לכן, השימוש במכונות LED נחשב לחלופה המבטיחה ביותר לפתרון לא רק עלויות22 ובעיות תחזוקה, אלא גם לספק תפוקת הספק גבוהה ופחות מזיקה 23 ויכולת תאורה רחבה יותר 24,25,26,27.
למרות התרומה הפוטנציאלית שציוד מבוסס LED יכול להציע לניסויי PDT28, לרוב האפשרויות המסחריות עדיין יש חסרונות כגון היעדר ניידות, עלות גבוהה ופרויקטי בנייה מורכבים ותפעול29. המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להציע כלי פשוט ואמין עבור מבחני PDT במבחנה . מאמר זה מתאר את PhotoACT, התקן PDT מבוסס LED שנבנה בתוך החברה, שהוא זול, ידידותי למשתמש ונייד. כהוכחת היתכנות, מכשיר זה הוכח כמגביר את הציטוטוקסיות של ורטפורפין במודל תרבית תאים דו-ממדית, ולכן יכול לשמש ככלי מחקר בניסויי PDT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

מאמר זה מתאר מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT), בשם PhotoACT. ההתקן נבנה באמצעות מערך של דיודות פולטות אור (LED) קונבנציונליות הניתנות לתכנות, מודול תצוגת גביש נוזלי (LCD) וחיישן אור המחובר ללוח מיקרו-בקרים מסחרי. המבנה מבוסס התיבה של אב הטיפוס נעשה עם סיבית בצפיפות בינונית (MDFs). התא הפנימי יכול להקצות בו זמנית ארבעה מיקרו-לוחות מרובי תרביות תאים.
כהוכחת היתכנות, חקרנו את ההשפעה הציטוטוקסית של הפוטוסנסיטייזר (PS) verteporfin כנגד קו תאי HeLa בתרבית דו-ממדית (2D). תאי HeLa טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של verteporfin במשך 24 שעות. המדיום העל-טבעי המכיל את התרופה הושלך, התאים הדבקים נשטפו בתמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS), ונוסף מדיום ללא תרופות. במחקר זה נבדקה ההשפעה של ורטפורפין על תאים ללא חשיפה לאור או לאחר חשיפה של שעה אחת לאור באמצעות ערכי אדום-ירוק-כחול (RGB) של 255, 255 ו-255 (פלואנס ממוצע של 49.1 ± 0.6 J/cm2). לאחר 24 שעות, כדאיות התא הוערכה על ידי בדיקת 3-(4,5-דימתיל-2-תיאזוליל)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT).
תוצאות הניסוי הראו כי חשיפה של תאים שטופלו עם verteporfin לאור מהמכשיר מגבירה את ההשפעה הציטוטוקסית של התרופה באמצעות מנגנון המתווך על ידי מיני חמצן תגובתי (ROS). בנוסף, השימוש באב הטיפוס המתואר בעבודה זו אומת על ידי השוואת התוצאות עם מכשיר PDT מסחרי. לפיכך, אב טיפוס זה של טיפול פוטודינמי מבוסס LED מייצג אלטרנטיבה טובה למחקרים חוץ גופיים של PDT.

מכשיר ה-PDT הסופי, שנקרא PhotoACT, כלל תא כהה להקצאת עד ארבעה מיקרו-לוחות מרובי משתתפים, כאשר המשטח הפנימי העליון שלו מצויד בקבוצה של 30 נורות LED מפוזרות המתוכנתות לפלוט ספקטרום שונה של אור נראה (איור 3 וקובץ משלים 6). המכשיר נבנה באמצעות שתי תיבות משויכות: קופסה פנימית שתוכ...

Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

כאן אנו מתארים מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מוצלח של מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT) תוך שימוש בתרבית תאי HeLa דו-ממדית וורטפורפין כפוטוסנסיטייזר.

מכשיר טיפול פוטודינמי מבוסס דיודה פולטת אור הבנוי בתוך הבית להגברת ציטוטוקסיות של חוליות במודל תרבית תאים דו-ממדית

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

טיפול פוטודינמי, PDT, מציע מספר יתרונות לטיפול בסרטן, ויעילותו תלויה במקור אור להפעלת פוטוסנסיטייזר. למרות ההתקדמות האחרונה בתחום, קיים חוסר גישה למכשיר יקר וניתן לשחזור עבור PTD עבור דגמי מבחנה. על מנת להשיג דרישה זו, עבודה זו מתארת מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע בדיקות PDT על תרביות תאים, בשם PhotoAct.כדי להתחיל את הבנייה, ראה שלושה מילימטרים עובי לוחות סיבים בצפיפות בינונית, MDF, כדי לקבל חתיכות עם הממדים הבאים. בנה שתי תיבות עם הממדים הבאים. קדח את גב הקופסה הגדולה יותר כדי להתקין מחבר לשקע חבית.קדחו גם את החלק העליון של הקופסה הגדולה יותר, את החלק העליון והתחתון של הקופסה הקטנה יותר כדי לספק מעבר לכבלי חשמל. צבעו את כל המשטחים הפנימיים בדיו שחור כדי לקדם שכיחות אור הומוגנית. חברו במקביל שלוש קלטות LED עם 10 נוריות LED כל אחת במשטח הפנימי העליון של הקופסה הקטנה יותר.בנוסף, התקן חיישן בהירות במרכז המשטח הפנימי התחתון של הקופסה הקטנה יותר. הדפס את המבנה של יחידת הבקרה באמצעות קובץ ההדפסה התלת-ממדי המשלים. התקן את כל הרכיבים, לחצן ההפעלה, הפוטנציומטרים, לוח המגע של זמן ההתחלה, נוריות LED, חיישן בהירות, LCD, זמזם וספק כוח, ואת החלקים של לוח בקר ESP-32 המותקנים בתא הבקרה של יחידת הבקרה.העלה את קוד התכנות הזמין בקובץ המשלים והפעל בדיקה כדי לבדוק שכל החיבורים פועלים. הרכיבו את הקופסאות וקבעו אותן יחד כדי למנוע פערים וכתוצאה מכך הפרעות תאורה חיצוניות ואובדן אור מיידי. חבר את יחידת הבקרה המותקנת לאזור הקדוח בחלק העליון של אב הטיפוס.בנה דלת כניסה מאותו חומר במידות הבאות, ותקן אותה על הקופסה החיצונית עם צירים וקלטות סקוטש כדי להבטיח סגירת תא ומבחנים ללא הפרעה. התקינו גם ידית למניפולציה של דלת הכניסה בקלות ובדייקנות. חברו ארבע רפידות גומי לרגליים בתחתית אב הטיפוס כדי להבטיח יציבות רבה יותר במהלך הפעולות.טפחו את קו תאי HeLa בגלוקוז הבינוני הבינוני המהונדס של דולבקו עם 10% מסרום בקר עוברי ו-1% גנטמיצין. שמור את צלוחיות התרבית על 5% של פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס. נהל ובדוק את תרבית התאים עד שתגיע ל-80% עד 90% מהמפגש.התחל את פרוטוקול כדאיות התא עם תהליך הזריעה. הסר את המדיום מן הבקבוקון עם תרבית תאי HeLa confluent. שטפו את הבקבוקון עם מלח חיץ פוספט, PBS, ונתקו את התרבית עם טריפסין בעקבות הפרטים המודגשים.לספור את התאים resuce עם hemocytometer ולזרוע אותם לתוך microplate מרובה היטב בריכוז של 20, 000 תאים לכל באר. הכינו שתי צלחות לטיפול בתנאים חשוכים ובהירים ודגרה שלהן למשך 24 שעות לחיבור התא. כדי להמשיך בטיפול עם photoensitizer, להסיר את המדיום משתי הצלחות ולטפל בתאים עם 100 microliters של ריכוזים הולכים וגדלים של Verteporfin.שמור את התאים בטיפול במשך 24 שעות כדי לאפשר הפנמה Verteporfin. לאחר הדגירה, להסיר את הטיפול, לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף מדיום ללא תרופות. מכסים מיקרו-פלטה אחת ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני חשיפה לאור ולדגור עליה למשך 24 שעות.לוח מיקרו זה יציע נתוני בקרה לניתוח נוסף של תוצאות PDT. המיקרו-פלטה האחרת תשמש בתנאי חשיפה לאור ב-PhotoAct. כדי להפעיל את הציוד, חבר אותו לשקע והפעל אותו, תוך לחיצה על לחצן ההפעלה.הנח את המיקרו-פלטה מרובת הבארות בתא PDT וסגור את הציוד על ידי הידוק הדלת הקדמית עם קלטות הסקוטש הצדדיות. כדי להגדיר את הציוד, השתמש בפוטנציומטרים כדי להתאים את תצורת RGB של פליטת אור. לחץ על משטח המגע פלוס/מינוס כדי להתאים את תצורת הזמן ולהגדיר את משך הבדיקה.בדוק אם המידע הנכון על הבדיקה מוצג בתצוגה ובצע התאמות סופיות במידת הצורך. לחץ על לוח המגע של הפעל כדי ליזום את הבדיקה. זמזם של צפצוף אחד חייב להישמע בתחילת הניסוי.במהלך הניסוי ניתן לצפות במידע על ההתקדמות בתצוגה, כגון הקרנה והזמן שנותר. אל תפתח את דלת הכניסה ואל תשנה תצורה כלשהי במהלך בדיקת PDT. בסוף הבדיקה יש לשמוע זמזם של ארבעה צפצופים והמערכת האלקטרונית תכבה את כל נוריות ה- LED.הודעה מוגמרת וכמות האנרגיה הסופית שהורחבה במהלך הניסוי ניתן לראות בתצוגה. הערך הסופי של השטף מחושב על פי המשוואה המסומנת. כסו את המיקרו-פלטה שסבלה מחשיפה לאור והמשיכו עם הדגירה של 24 שעות.לאחר תקופת הדגירה, להסיר מדיום משתי הצלחות, לשטוף את monolayer של תאים עם PBS, ולהוסיף תמיסת MTT. יש לדגום את שני הלוחות בתנאים כהים ובהירים במשך ארבע שעות כדי לאפשר היווצרות גבישי פורמזאן. הסר את תמיסת MTT בזהירות והמיס את הגבישים הסגולים בתמיסת DMSO ואתנול.לאחר פירוק גבישים מלא, בצע את מדידת הספיגה באמצעות קורא microplate בגודל 595 ננומטר. המוצר הסופי מורכב מתא כהה עם משטח פנימי עליון המצויד במערך של 30 דיודות פולטות אור מפוזרות, נוריות LED, המתוכנתות לפלוט ספקטרום שונה של אור נראה. שכיחות אור הומוגנית נקבעת עקב רפלקטיביות נמוכה של משטחים פנימיים והתפלגות אחידה של תצורת נורות LED.ממשק ההתקנה ידידותי למשתמש ומצב הניסוי שהוסדר היה ניתן לשחזור. כהוכחת היתכנות, המכשיר שימש להגברת ההשפעה הציטוטוקסית של ורטפורפין בתרבית תאי HeLa דו-ממדית לאחר חשיפה לאור. כפי שניתן לראות באיור, ערך GI50 היה 3.1 מיקרומולר עבור מצב האור.ו 13.8 micromolar עבור המצב הכהה לכן, העלייה של יותר מפי ארבעה ביעילות השוואת התנאים מאשרת את השימוש Verteporfin כמו photoensitizer ואת התחולה של PhotoAct על מבחני PDT. כדי לאמת את השימוש באב הטיפוס המתואר בעבודה זו, נעשה שימוש במכשיר PDT מסחרי באותם תנאי ניסוי, כולל פוטו-סנסיטייזר, תאים ופלואנס, והתוצאות הושוו. כפי שניתן לראות באיור, שני המכשירים ביצעו פוטו-אקטיביזציה של ורטפורפין באופן שווה, מה ששיפר את האפקט הציטוטוקסי.לבסוף, מוות תאי בתיווך ROS שנגרם על ידי ורטפורפין לאחר חשיפה לאור אושר על ידי ציטומטריה של זרימה באמצעות בדיקת DCFDA. לסיכום, המכשיר נבנה בקלות עם רכיבים בעלות נמוכה הזמינים מסחרית בעלות כוללת של פחות מ -50. היתרון העיקרי הנוסף של המכשיר כולל ניידות, דרישת תחזוקה נמוכה, יכולת להקרין סוגים מרובים של לוחות תרבות, שימוש בו זמנית של עד ארבע יחידות לכל בדיקה, הקרנה מדויקת וניתנת לשחזור, ממשק התקנה ידידותי למשתמש ופשוט שאינו דורש חיבור למחשבים או למכונות אחרות.בנוסף, תרשים זרימת החלטה מוצג כדי לספק גישה שיטתית לפתרון בעיות כדי למצוא ולתקן בעיות או שגיאות במהלך הפעולה. ממצאים אלה מאפשרים להרחיב את היתרונות של PhotoAct כדי להקל על PDT למחקר מדעי, לחקור את מנגנון הפעולה של פוטוסנסיטייזרים ואת היישומים הקליניים שלהם.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

תרבות התא על ממברנות הסיליקון נידהר וקריופיקציה עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו-ניתוח

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...