Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

Ringraziamo Arthur Henrique Gomes de Oliveira e Lucas Julian Cruz Gomes per l'aiuto nel processo di ripresa. Questo progetto è stato sostenuto dal Consiglio brasiliano delle ricerche (CNPq, numero di sovvenzione 400953/2016-1-404286/2021-6) e dalla Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Questo studio è stato anche finanziato in parte dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Costruzione del dispositivo
<ol><li>Segare pannelli di fibra a media densità (MDF) spessi 3 mm per ottenere pezzi con le dimensioni mostrate in Figura 1A. NOTA: utilizzare il file vettoriale (file supplementare 1) per il taglio a controllo numerico computerizzato (CN...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

Il dispositivo PhotoACT finale era comodo da costruire con componenti disponibili in commercio e a basso costo ad un costo totale inferiore a $ 50. Ulteriori vantaggi includono basse esigenze di manutenzione, la capacità di irradiare più tipi di piastre di coltura, l'uso simultaneo di un massimo di quattro unità per test, peso ridotto (2 kg)/dimensioni (44 cm3) che consente portabilità, irradiazione accurata e riproducibile (dati non mostrati) e un'interfaccia di configurazione semplice e intuitiva che non...

Tra le malattie non trasmissibili più letali, il cancro rappresenta una delle principali cause globali di morte prematura. Ha rappresentato quasi 10 milioni di morti nel 2020, rappresentando circa un decesso su sei in tutto il mondo1. Inoltre, il fenomeno della resistenza multifarmaco (MDR) rappresenta una tremenda minaccia per la salute pubblica, poiché i protocolli chemioterapici approvati non riescono a raggiungere le fasi di remissione per questa condizione clinica2. Le cellule tumorali possono sviluppare resistenza alla chemioterapia attraverso diversi meccanismi; tuttavia, la sovraespressione di alcuni trasportatori di cassette leganti ATP (ABC) - pompe di efflusso ATP-dipendenti - è considerata la causa principale dello sviluppo di MDR all'interno di un microambiente tumorale3. Oltre all'MDR, altre complicanze del cancro, come la recidiva e le metastasi, rafforzano l'urgente richiesta di sviluppare e migliorare gli approcci terapeutici per superare questa sfida oncologica.
L'utilizzo curativo della luce è stato praticato per secoli4 e la terapia fotodinamica (PDT) rappresenta un approccio terapeutico clinicamente approvato per i tumori solidi. La PDT combina la somministrazione di un fotosensibilizzatore (PS) seguita da irradiazione luminosa per generare specie reattive dell'ossigeno (ROS) per esercitare citotossicità selettiva nelle cellule tumorali. Questo approccio terapeutico è superiore ai metodi convenzionali, tra cui chirurgia, radioterapia e chemioterapia5; È una tecnica minimamente invasiva che mostra una minore citotossicità nei tessuti connettivi6. L'applicazione della luce e l'accumulo di PS direttamente nel tumore o nel suo microambiente assicurano un targeting preciso e, di conseguenza, effetti collaterali sistemici minori e indesiderati7 e la possibilità di ripetere il trattamento nella stessa sede. Inoltre, il costo è inferiore a quello di altri approcci. Per le sue caratteristiche promettenti, la PDT può essere considerata un'opzione appropriata sia per il trattamento del cancro singolo, soprattutto nel caso di tumori inoperabili, sia per il trattamento adiuvante del cancro7, e rappresenta un'alternativa per MDR correlato alla chemioterapia 8,9.
Il primo rapporto che mostrava un alto tasso di risposta obiettiva usando PDT è stato descritto nel 1975 in un modello di topo e ratto10. Da allora, sono stati condotti studi utilizzando PDT con esiti positivi7 sia in vivo che in vitro con linee cellulari tumorali umane in coltura cellulare 2D11,12. Considerando l'ampia applicabilità della PS clinicamente approvata, indipendentemente dalle loro specifiche vie di accumulo e dagli intervalli di lunghezze d'onda dei picchi di assorbimento, il processo generale è il seguente: (i) assorbimento di PS, (ii) picco della concentrazione di PS nel tumore o nel suo microambiente, (iii) applicazione della luce, (iv) interazione PS-luce, (v) trasferimento di energia allo stato eccitato di PS al substrato tissutale o alle molecole di ossigeno circostanti, (vi) produzione di ROS che coinvolge ossigeno singoletto o anione superossido, (vii) morte delle cellule tumorali attraverso, essenzialmente, necrosi o apoptosi (morte diretta), autofagia (meccanismo citoprotettivo), ischemia tissutale (danno vascolare), modulazione immunitaria o una sovrapposizione di questi meccanismi7. In questa fase finale, l'attivazione di una specifica via di morte cellulare dipende da molti fattori, come le caratteristiche cellulari, il disegno sperimentale e, soprattutto, la localizzazione intracellulare della PS e il danno mirato correlato alla PDT13.
La verteporfina è una PS di seconda generazione, approvata dalle agenzie regolatorie per uso clinico in Norvegia e Cina per il trattamento della degenerazione maculare legata all'età7. Dopo la somministrazione della dose, è stato riportato che questo profarmaco si accumula parzialmente nei mitocondri14 e induce la fosforilazione della tirosina proteica cellulare e la frammentazione del DNA, portando all'apoptosi delle cellule tumorali15,16. Dopo 24 ore di incubazione per l'internalizzazione delle verteporfine, si raccomanda un protocollo PDT che utilizza una configurazione di lunghezza d'onda di 690 nm per ottenere livelli efficaci di trasferimento di radiazione elettromagnetica alle molecole adiacenti 7,17.
Per quanto riguarda la sorgente luminosa per PDT, i classici sistemi laser a diodi sono solitamente costosi, tecnicamente complicati, sovradimensionati e quindi non portatili18,19. Come conseguenza del suo profilo a lunghezza d'onda singola, che può essere osservato anche nelle apparecchiature PDT basate su LED, la richiesta di unità indipendenti per ogni applicazione di fotosensibilizzatori rende l'utilizzo di sistemi laser a diodi ancora più complesso ed economicamente impraticabile20,21. Pertanto, l'utilizzo di macchinari a LED è considerato l'alternativa più promettente per risolvere non solo i costi22 e problemi di manutenzione, ma anche per fornire un'elevata potenza e meno dannosa 23 e una più ampia capacità di illuminazione 24,25,26,27.
Nonostante il potenziale contributo che le apparecchiature basate su LED possono offrire agli esperimenti PDT28, la maggior parte delle opzioni commerciali presenta ancora inconvenienti come la mancanza di portabilità, costi elevati e complessi progetti di costruzione e funzionamento29. L'obiettivo principale di questo lavoro era quello di offrire uno strumento semplice e affidabile per i saggi PDT in vitro . Questo documento descrive PhotoACT, un dispositivo PDT basato su LED costruito internamente, che è economico, facile da usare e portatile. Come prova di concetto, questo dispositivo ha dimostrato di migliorare la citotossicità della verteporfina in un modello di coltura cellulare 2D e, pertanto, può essere utilizzato come strumento di ricerca negli esperimenti PDT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

Questo documento descrive un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire saggi di terapia fotodinamica in vitro (PDT), chiamato PhotoACT. Il dispositivo è stato costruito utilizzando una serie di diodi emettitori di luce programmabili convenzionali (LED), un modulo display a cristalli liquidi (LCD) e un sensore di luce collegato a una scheda microcontroller commerciale. La struttura scatolare del prototipo è stata realizzata con pannelli di fibra a media densità (MDF). Il compartimento interno può allocare contemporaneamente quattro micropiastre multipozzetto per colture cellulari.
Come prova di concetto, abbiamo studiato l'effetto citotossico della verteporfina fotosensibilizzatrice (PS) contro la linea cellulare HeLa in coltura bidimensionale (2D). Le cellule HeLa sono state trattate con concentrazioni crescenti di verteporfina per 24 ore. Il mezzo di supernatante contenente farmaco è stato scartato, le cellule aderenti sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ed è stato aggiunto terreno privo di farmaci. In questo studio, l'effetto della verteporfina sulle cellule è stato esaminato senza esposizione alla luce o dopo l'esposizione per 1 ora alla luce utilizzando valori rosso-verde-blu (RGB) di 255, 255 e 255 (fluenza media di 49,1 ± 0,6 J / cm2). Dopo 24 ore, la vitalità cellulare è stata valutata mediante il test 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT).
I risultati sperimentali hanno mostrato che l'esposizione delle cellule trattate con verteporfina alla luce del dispositivo aumenta l'effetto citotossico del farmaco attraverso un meccanismo mediato da specie reattive dell'ossigeno (ROS). Inoltre, l'uso del prototipo descritto in questo lavoro è stato convalidato confrontando i risultati con un dispositivo PDT commerciale. Pertanto, questo prototipo di terapia fotodinamica basata su LED rappresenta una buona alternativa per gli studi in vitro di PDT.

Il dispositivo PDT finale, chiamato PhotoACT, includeva una camera oscura per allocare fino a quattro micropiastre multipozzetto, con la sua superficie interna superiore dotata di un set di 30 LED diffusi programmati per emettere spettri distinti di luce visibile (Figura 3 e File supplementare 6). Il dispositivo è stato costruito utilizzando due scatole associate: una scatola interna progettata come camera oscura per i saggi PDT e una scatola esterna per coprire la camera i...

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An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Qui, descriviamo un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire con successo saggi di terapia fotodinamica in vitro (PDT) utilizzando colture cellulari HeLa bidimensionali e verteporfina come fotosensibilizzante.

Un dispositivo di terapia fotodinamica costruito internamente e basato su diodi emettitori di luce per migliorare la citotossicità delle verteporfine in un modello di coltura cellulare 2D

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

La terapia fotodinamica, PDT, offre diversi vantaggi al trattamento del cancro e la sua efficacia dipende da una fonte di luce per attivare un fotosensibilizzatore. Nonostante i recenti progressi nel campo, vi è una mancanza di accesso a un dispositivo costoso e riproducibile per PTD per modelli in vitro. Al fine di soddisfare questa domanda, questo lavoro descrive un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire saggi PDT su colture cellulari, chiamato PhotoAct.Per iniziare la costruzione, ha visto tre millimetri di spessore pannelli in fibra a media densità, MDF, per ottenere pezzi con le seguenti dimensioni. Costruisci due scatole con le seguenti dimensioni. Forare il retro della scatola più grande per installare un connettore jack barile.Perforare anche la parte superiore della scatola più grande, la parte superiore e la parte inferiore della scatola più piccola per fornire un passaggio per i cavi elettrici. Dipingi tutte le superfici interne con inchiostro nero per favorire un'incidenza della luce omogenea. Collegare in parallelo tre nastri LED con 10 LED ciascuno sulla superficie interna superiore della scatola più piccola.Inoltre, installare un sensore di luminosità al centro della superficie interna inferiore della scatola più piccola. Stampa la struttura dell'unità di controllo utilizzando il file di stampa 3D supplementare. Installare tutti i componenti, il pulsante di accensione, i potenziometri, il touchpad di avvio del tempo, i LED, il sensore di luminosità, l'LCD, il cicalino e l'alimentatore e le parti di una scheda controller ESP-32 montata all'interno dell'unità di controllo.Caricare il codice di programmazione disponibile in file supplementare ed eseguire un test per verificare che tutte le connessioni funzionino. Montare le scatole e fissarle insieme per evitare spazi vuoti e di conseguenza interferenze di illuminazione esterna e perdita immediata di luce. Collegare l'unità di controllo montata all'area forata nella parte superiore del prototipo.Costruire una porta d'ingresso dello stesso materiale nelle seguenti dimensioni e fissarla sulla scatola esterna con cerniere e nastri Velcro per garantire la chiusura della camera e saggi ininterrotti. Installare anche una maniglia per manipolare la porta d'ingresso con facilità e precisione. Fissare quattro piedini in gomma nella parte inferiore del prototipo per garantire una maggiore stabilità durante le operazioni.Coltivare la linea cellulare HeLa in Modified Eagle Medium low glucose di Dulbecco con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di gentamicina. Conservare i palloni di coltura al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Gestire e ispezionare la coltura cellulare fino a raggiungere l'80-90% della confluenza.Avviare il protocollo di vitalità cellulare con il processo di semina. Rimuovere il mezzo dal matraccio con coltura cellulare HeLa confluente. Lavare il matraccio con tampone fosfato salino, PBS, e staccare la coltura con tripsina seguendo i dettagli evidenziati.Contare le cellule risospese con un emocitometro e seminarle in una micropiastra multi-pozzetto a concentrazione di 20.000 cellule per pozzetto. Preparare due piastre per le condizioni di trattamento buio e luce e incubarle per 24 ore per l'attacco cellulare. Per procedere con il trattamento con un fotosensibilizzante, rimuovere il mezzo da entrambe le piastre e trattare le cellule con 100 microlitri di concentrazioni crescenti di Verteporfina.Mantenere le cellule in trattamento per 24 ore per consentire l'internalizzazione della verteporfina. Dopo l'incubazione, rimuovere il trattamento, lavare le cellule con PBS e aggiungere terreno senza farmaci. Coprire una micropiastra con un foglio di alluminio per proteggerla dall'esposizione alla luce e incubarla per 24 ore.Questa micropiastra offrirà dati di controllo per ulteriori analisi dei risultati PDT. L'altra micropiastra sarà utilizzata in condizioni di esposizione alla luce presso il PhotoAct. Per azionare l'apparecchiatura, collegarla alla presa e accenderla, premendo il pulsante di accensione.Posizionare la micropiastra multipozzetto nella camera PDT e chiudere l'apparecchiatura fissando la porta frontale con i nastri Velcro laterali. Per impostare l'apparecchiatura, utilizzare i potenziometri per regolare la configurazione RGB dell'emissione luminosa. Premere il touchpad più/meno per regolare la configurazione dell'ora e impostare la durata del test.Controllare se sul display sono visualizzate le informazioni corrette sul test e apportare le modifiche finali, se necessario. Premere il touchpad di avvio per avviare il test. Un cicalino a un segnale acustico deve essere sentito all'inizio dell'esperimento.Durante l'esperimento, le informazioni sui progressi possono essere osservate sul display, come l'irradianza e il tempo rimanente. Non aprire lo sportello anteriore né modificare alcuna configurazione durante il test PDT. Alla fine del test, deve essere sentito un cicalino a quattro bip e il sistema elettronico spegnerà tutti i LED.Un messaggio finito e la quantità finale di energia espansa durante l'esperimento possono essere osservati sul display. Il valore finale della fluenza viene calcolato in base all'equazione evidenziata. Coprire la micropiastra che ha subito l'esposizione alla luce e procedere con l'incubazione di 24 ore.Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il mezzo da entrambe le piastre, lavare il monostrato di cellule con PBS e aggiungere la soluzione MTT. Incubare entrambe le placche in condizioni di buio e luce per quattro ore per consentire la formazione di cristalli di formazan. Rimuovere accuratamente la soluzione MTT e sciogliere i cristalli viola con una soluzione di DMSO ed etanolo.Dopo la completa dissoluzione dei cristalli, effettuare la misura dell'assorbanza utilizzando un lettore di micropiastre a 595 nanometri. Il prodotto finale è costituito da una camera buia con la sua superficie interna superiore dotata di un set di 30 diodi emettitori di luce diffusa, LED, programmati per emettere spettri distinti di luce visibile. Si stabilisce un'incidenza della luce omogenea grazie alla bassa riflettività delle superfici interne e alla distribuzione uniforme della configurazione dei LED.L'interfaccia di installazione è user-friendly e la condizione sperimentale consolidata era riproducibile. Come prova di concetto, il dispositivo è stato utilizzato per migliorare l'effetto citotossico di Verteporfina in coltura cellulare HeLa 2D dopo l'esposizione alla luce. Come mostrato nella figura, il valore GI50 era 3,1 micromolare per la condizione di luce.e 13,8 micromolari per la condizione di oscurità Pertanto, l'aumento di oltre quattro volte dell'efficienza confrontando le condizioni conferma l'uso di Verteporfin come fotosensibilizzatore e l'applicabilità di PhotoAct sui saggi PDT. Per convalidare l'uso del prototipo descritto in questo lavoro, è stato utilizzato un dispositivo PDT commerciale nelle stesse condizioni sperimentali, tra cui fotosensibilizzatore, celle e fluenza, e i risultati sono stati confrontati. Come mostrato nella figura, entrambi i dispositivi fotoattivarono Verteporfina allo stesso modo, migliorando l'effetto citotossico.Infine, la morte cellulare mediata da ROS innescata da Verteporfina dopo l'esposizione alla luce è stata confermata mediante citometria a flusso utilizzando il test DCFDA. In sintesi, il dispositivo è stato facilmente costruito con componenti a basso costo disponibili in commercio con un costo totale inferiore a 50. Gli altri principali vantaggi del dispositivo includono la portabilità, la bassa richiesta di manutenzione, la capacità di irradiare più tipi di piastre di coltura, l'uso simultaneo di un massimo di quattro unità per test, l'irradiazione accurata e riproducibile, l'interfaccia di configurazione user-friendly e semplice che non richiede la connessione a computer o altre macchine.Inoltre, viene presentato un diagramma di flusso decisionale per fornire un approccio sistematico alla risoluzione dei problemi per trovare e correggere problemi o errori durante l'operazione. Questi risultati permettono di estendere i benefici di PhotoAct per facilitare la PDT alla ricerca scientifica, esplorando il meccanismo d'azione dei fotosensibilizzatori e le loro applicazioni cliniche.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Un metodo efficace per l&#39;isolamento di RNA altamente purificato da semi per l&#39;utilizzo in Quantitative Analysis trascrittoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Ricerca

Biochimica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Facile manipolazione delle architetture in idrogel a base di proteine per applicazioni della coltura delle cellule

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studio sul metabolismo di sei insetticidi sistemici in una nuova coltura di sospensione cellulare derivata dal tè (Camellia Sinensis L.) plurale di "leaf"

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Migliorare l'innesto dei Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo attraverso un'inibizione transitoria dell'attività di Rho Kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Coltura cellulare sulle membrane di nitride di silicio e criopreparazione per la fluorescenza a raggi X del sincrotrone Nano-analisi

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Western Blot ad altissima velocità che utilizza la tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...