Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

撮影プロセスを手伝ってくれたアーサー・エンリケ・ゴメス・デ・オリベイラとルーカス・ジュリアン・クルス・ゴメスに感謝します。このプロジェクトは、ブラジル研究評議会(CNPq、助成金番号400953 / 2016-1-404286 / 2021-6)およびFundaçãoAraucária-PPSUS 2020/2021(SUS2020131000003)の支援を受けました。この研究は、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)-Finance Code 001によっても資金提供を受けた。

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. デバイス構築
<ol><li>厚さ3mmの中密度繊維板(MDF)を鋸で挽き、 図1Aに示す寸法のピースを得ました。 注意: コンピューター数値制御(CNC)切断には、ベクターファイル(補足ファ...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

最終的なPhotoACTデバイスは、市販の低コストコンポーネントで50ドル未満の総コストで構築するのに便利でした。さらに、メンテナンスの要求が少ないこと、複数種類の培養プレートを照射できること、アッセイごとに最大4ユニットの同時使用、携帯性を可能にする軽量(2kg)/サイズ(44cm3)、正確で再現性のある照射(データ未表示)、コンピュータや他の機械への接続を必要としないユー...

最も致命的な非感染性疾患の中で、癌は早死の世界的な主要な原因を表しています。2020年には1,000万人近くが死亡し、世界の約6人に1人が死亡しました1。さらに、多剤耐性(MDR)現象は、承認された化学療法プロトコルがこの臨床状態の寛解段階に到達できないため、公衆衛生上の大きな脅威を表しています2。癌細胞は、いくつかのメカニズムを通じて化学療法に対する耐性を発達させることができます。しかし、一部のATP結合カセット(ABC)トランスポーター(ATP依存性排出ポンプ)の過剰発現は、腫瘍微小環境内でのMDR発生の主な原因と考えられています3。MDRに加えて、再発や転移などの他の癌合併症は、この腫瘍学的課題を克服するための治療アプローチを開発および改善するという緊急の要求を強化します。
光の治療的利用は何世紀にもわたって実践されており4、光線力学療法(PDT)は、固形腫瘍の臨床的に承認された治療アプローチを表しています。PDTは、光増感剤(PS)の投与とそれに続く光照射を組み合わせて活性酸素種(ROS)を生成し、腫瘍細胞に選択的な細胞毒性を発揮します。この治療アプローチは、手術、放射線療法、化学療法などの従来の方法よりも優れています5。これは、結合組織6においてより低い細胞毒性を示す低侵襲技術である。腫瘍またはその微小環境に直接光を当ててPSを蓄積することで、正確な標的化が保証され、その結果、軽微で望ましくない全身性の副作用7と、同じ部位での繰り返し治療の可能性が保証されます。さらに、コストは他のアプローチよりも低くなります。その有望な特徴により、PDTは、特に手術不能な腫瘍の場合の単一または補助的な癌治療7の両方にとって適切な選択肢と見なすことができ、化学療法に関連するMDRの代替手段となります8,9。
PDTを用いた高い客観的奏効率を示す最初の報告は、マウスおよびラットモデル10において1975年に記載された。それ以来、PDTを用いて研究が行われ、2D細胞培養におけるヒト腫瘍細胞株を用いたin vivoおよびin vitroの両方で陽性の結果7が得られました11,12。臨床的に承認されたPSの幅広い適用性を考慮すると、それらの特定の蓄積経路および吸収ピークの波長範囲にかかわらず、一般的なプロセスは以下の通りである:(i)PS取り込み、(ii)腫瘍またはその微小環境におけるPS濃度のピーク、(iii)光の適用、(iv)PS光相互作用、(v)PS励起状態エネルギーの組織基質または周囲の酸素分子のいずれかへの伝達、 (vi)一重項酸素またはスーパーオキシドアニオンを含むROS産生、(vii)腫瘍細胞死を介した、本質的に、壊死またはアポトーシス(直接死)、オートファジー(細胞保護機構)、組織虚血(血管損傷)、免疫調節、またはこれらの機構の重複7。この最終段階では、特定の細胞死経路の活性化は、細胞特性、実験デザイン、そして最も重要なことに、PS細胞内局在およびPDT関連の標的損傷などの多くの要因に依存する13。
Verteporfinは第2世代のPSであり、加齢黄斑変性症を治療するためにノルウェーと中国で臨床使用するために規制当局によって承認されています7。用量送達後、このプロドラッグはミトコンドリアに部分的に蓄積し14、細胞タンパク質チロシンリン酸化およびDNA断片化を誘導し、腫瘍細胞のアポトーシスをもたらすことが報告された15,16。椎骨のインターナリゼーションのための24時間のインキュベーション後、隣接する分子への電磁放射伝達の有効レベルを達成するために、690nmの波長設定を使用するPDTプロトコルが推奨されます7,17。
PDTの光源に関しては、従来のダイオードレーザーシステムは通常高価で、技術的に複雑で、特大であるため、持ち運びが困難です18,19。LEDベースのPDT機器でも観察できる単一波長プロファイルの結果として、各光増感剤アプリケーションのための独立したユニットの需要は、ダイオードレーザーシステムの利用をさらに複雑にし、経済的に実行不可能にします20,21。したがって、LED機械の利用は、コスト22とメンテナンスの問題を解決するだけでなく、高出力と害の少ない23とより広い照明能力を提供する最も有望な代替手段と考えられています24,25,26,27。
LEDベースの機器がPDT実験28に提供できる潜在的な貢献にもかかわらず、ほとんどの商用オプションには、携帯性の欠如、高コスト、複雑な建設プロジェクトおよび操作29などの欠点が依然としてあります。この研究の主な目的は、 in vitro PDTアッセイのためのシンプルで信頼性の高いツールを提供することでした。本稿では、安価で使いやすく、ポータブルな自社製のLEDベースのPDTデバイスであるPhotoACTについて説明します。概念実証として、このデバイスは、2D細胞培養モデルにおける椎骨ポルフィンの細胞毒性を高めることが示されているため、PDT実験の研究ツールとして使用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

この論文では、PhotoACTと呼ばれる 、in vitro 光線力学療法(PDT)アッセイを実行するための新しい、シンプルで低コストのデバイスについて説明します。このデバイスは、従来のプログラマブル発光ダイオード(LED)、液晶ディスプレイ(LCD)モジュール、および商用マイクロコントローラボードに接続された光センサのセットを使用して構築されました。プロトタイプのボックスベースの構造は、中密度ファイバーボード(MDF)で作られました。内部コンパートメントには、4つの細胞培養マルチウェルマイクロプレートを同時に配置できます。
概念実証として、HeLa細胞株に対する光増感剤(PS)バーテポルフィンの細胞毒性効果を2次元(2D)培養で研究しました。HeLa細胞を、増加濃度のバーテポルフィンで24時間処理した。薬物含有上清培地を廃棄し、接着細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、薬物非含有培地を加えた。この研究では、細胞に対する椎骨の影響を、光に曝露しない場合、または光に1時間曝露した後、赤緑青(RGB)値255、255、および255(平均フルエンス49.1±0.6 J / cm2)を使用して調べました。24時間後、細胞生存率は、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイによって評価した。
実験結果は、椎骨で処理された細胞をデバイスからの光に曝露すると、活性酸素種(ROS)によって媒介されるメカニズム を介して 薬物の細胞毒性効果が高まることを示しました。さらに、この作業で説明されているプロトタイプの使用は、結果を市販のPDTデバイスと比較することによって検証されました。したがって、このLEDベースの光線力学療法プロトタイプは、PDTの in vitro 研究のための良い代替手段を表しています。

PhotoACTと名付けられた最後のPDTデバイスには、最大4つのマルチウェルマイクロプレートを割り当てるための暗室が含まれ、その上部内面には、異なるスペクトルの可視光を放出するようにプログラムされた30個の散乱LEDのセットが装備されています(図3 および 補足ファイル6)。このデバイスは、PDTアッセイ用の暗室として設計された内部ボックスと、内部チ...

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An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

ここでは、2次元HeLa細胞培養と光増感剤としての椎体を使用する in vitro 光線力学療法(PDT)アッセイを成功させるための、新しくてシンプルで低コストのデバイスについて説明します。

2D細胞培養モデルにおけるベルテポルフィン細胞毒性を高めるための自作発光ダイオードベースの光線力学治療装置

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

光線力学療法(PDT)は、癌治療にいくつかの利点を提供し、その有効性は光増感剤を活性化する光源に依存します。この分野では最近の進歩があるが、in vitroモデル用のPTD用の高価で再現性のあるデバイスへのアクセスが不足している。この需要を達成するために、この研究では、PhotoActという名前の細胞培養でPDTアッセイを実行するための新しい、シンプルで低コストのデバイスについて説明します。建設を開始するには、厚さ3ミリメートルの中密度繊維板MDFを見て、次の寸法のピースを入手しました。次の寸法の2つのボックスを作成します。大きい方の箱の背面にドリルで穴を開けて、バレルジャックコネクタを取り付けます。また、大きな箱の上部、小さい箱の上部と下部にドリルで穴を開けて、電気ケーブル用の通路を提供します。すべての内面を黒インクでペイントして、均一な光入射を促進します。小さい方のボックスの上部内面に、それぞれ10個のLEDが付いた3つのLEDテープを並列に取り付けます。さらに、小さい方の箱の底面の内面の中央に明るさセンサーを取り付けます。補足3D印刷ファイルを使用して、コントロールユニットの構造を印刷します。すべてのコンポーネント、電源ボタン、ポテンショメータ、タイムスタートタッチパッド、LED、輝度センサー、LCD、ブザー、電源、およびコントロールユニット内部に取り付けられたESP-32コントローラーボードの部品を取り付けます。補足ファイルで利用可能なプログラミングコードをアップロードし、テストを実行して、すべての接続が機能していることを確認します。ボックスを組み立てて固定し、隙間を防ぎ、その結果、外部照明の干渉や即時の光の損失を防ぎます。マウントされたコントロールユニットをプロトタイプの上部にあるドリル領域に取り付けます。次の寸法で同じ材料のフロントドアを構築し、ヒンジとベルクロテープで外箱に固定して、チャンバーの閉鎖と中断のないアッセイを保証します。また、フロントドアを簡単かつ正確に操作するためのハンドルを取り付けます。プロトタイプの下部に4つのゴム製フットパッドを取り付けて、操作中の安定性を高めます。ダルベッコ改変イーグルミディアム低グルコースでHeLa細胞株を、10%のウシ胎児血清と1%のゲンタマイシンで培養します。培養フラスコを二酸化炭素の5%と摂氏37度に保ちます。コンフルエントの80〜90%に達するまで細胞培養を管理および検査します。播種プロセスで細胞生存率プロトコルを開始します。コンフルエントなHeLa細胞培養でフラスコから培地を取り出します。フラスコをリン酸緩衝生理食塩水、PBSで洗浄し、強調表示された詳細に従ってトリプシンで培養物を剥離します。血球計算盤で再懸濁細胞を数え、ウェルあたり20, 000細胞の濃度でマルチウェルマイクロプレートに播種します。暗色と明色の処理条件用に2枚のプレートを準備し、細胞付着まで24時間インキュベートします。光増感剤による処理を進めるには、両方のプレートから培地を取り出し、100マイクロリットルの濃度上昇中のVerteporfinで細胞を処理します。細胞を24時間処理して、バーテポルフィンのインターナリゼーションを可能にします。インキュベーション後、処理液を取り除き、細胞をPBSで洗浄し、薬物を含まない培地を加えます。1枚のマイクロプレートをアルミホイルで覆い、光にさらされないように保護し、24時間インキュベートします。このマイクロプレートは、PDT結果をさらに分析するためのコントロールデータを提供します。もう一方のマイクロプレートは、フォトアクトで露光条件で利用されます。機器を操作するには、電源ボタンを押してコンセントに差し込み、電源を入れます。マルチウェルマイクロプレートをPDTチャンバーに置き、前面ドアをサイドベルクロテープで固定して装置を閉じます。機器をセットアップするには、ポテンショメータを使用して発光のRGB構成を調整します。プラス/マイナスタッチパッドを押して、時間構成を調整し、アッセイ時間を設定します。アッセイに関する正しい情報がディスプレイに表示されているかどうかを確認し、必要に応じて最終調整を行います。スタートタッチパッドを押してアッセイを開始します。実験の開始時にビープ音が1回鳴るブザーが聞こえる必要があります。実験中は、照度や残り時間などの進行状況情報をディスプレイで確認できます。PDTアッセイ中は、フロントドアを開けたり、構成を変更したりしないでください。アッセイの最後に、ビープ音が4回鳴り、電子システムがすべてのLEDをオフにします。完成したメッセージと実験中に膨張した最終的なエネルギー量をディスプレイで観察できます。フルエンスの最終値は、強調表示された式に従って計算されます。光にさらされたマイクロプレートを覆い、24時間のインキュベーションを続行します。インキュベーション期間後、両方のプレートから培地を取り出し、単層の細胞をPBSで洗浄し、MTT溶液を加えます。ホルマザン結晶を形成するために、暗いプレートと明るい条件の両方で4時間インキュベートします。MTT溶液を注意深く取り除き、紫色の結晶をDMSOとエタノール溶液で溶解します。結晶が完全に溶解した後、595ナノメートルでマイクロプレートリーダーを用いて吸光度測定を行う。最終製品は、可視光の異なるスペクトルを放出するようにプログラムされた30個の散乱発光ダイオード、LEDのセットを備えた上部内面を備えた暗いチャンバーで構成されています。内面の反射率が低く、LED構成が均一に分布しているため、均一な光入射が確立されます。セットアップインターフェースはユーザーフレンドリーで、落ち着いた実験条件は再現可能でした。概念実証として、このデバイスは、光曝露後の2D HeLa細胞培養におけるバーテポルフィンの細胞毒性効果を高めるために使用されました。図に示すように、GI50値は光条件に対して3.1マイクロモルであった。暗条件の場合は13.8マイクロモル したがって、条件を比較する効率の4倍以上の増加は、光増感剤としてのバーテポルフィンの使用とPDTアッセイへのPhotoActの適用性を確認します。この研究で説明されているプロトタイプの使用を検証するために、光増感剤、細胞、フルエンスを含む同じ実験条件下で市販のPDTデバイスを使用し、結果を比較しました。図に示すように、両方のデバイスは、バーテポルフィンを等しく光活性化し、細胞毒性効果を高めます。最後に、光曝露後のバーテポルフィンによって引き起こされるROS媒介細胞死を、DCFDAアッセイを用いたフローサイトメトリーによって確認した。要約すると、このデバイスは、総コストが50未満の市販の低コストコンポーネントで簡単に構築できました。この装置の他の主な利点には、携帯性、低メンテナンス需要、複数のタイプの培養プレートを照射する能力、アッセイごとに最大4ユニットの同時使用、正確で再現性のある照射、コンピュータや他のマシンへの接続を必要としないユーザーフレンドリーでシンプルなセットアップインターフェースが含まれます。さらに、操作中に問題やエラーを見つけて修正するための体系的な問題解決アプローチを提供するために、意思決定フローチャートが提示されます。これらの知見は、PDTを促進するPhotoActの利点を科学研究に拡大し、光増感剤の作用機序とその臨床応用を探求することを可能にする。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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