Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

촬영 과정을 도와준 Arthur Henrique Gomes de Oliveira와 Lucas Julian Cruz Gomes에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 브라질 연구 위원회(CNPq, 보조금 번호 400953/2016-1-404286/2021-6) 및 Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021(SUS2020131000003)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001에 의해 부분적으로 자금을 지원했습니다.

참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 장치 구성
<ol><li>3mm 두께의 중밀도 섬유판(MDF)을 톱질하여 그림 1A에 표시된 치수의 조각을 얻었습니다. 알림: 컴퓨터 수치 제어(CNC) 절단을 위해 벡터 파일(보충 파일 1)을 사용하십시오.</li>
	<li>큰 ...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

최종 PhotoACT 장치는 총 50달러 미만의 비용으로 상업적으로 이용 가능한 저렴한 구성 요소로 구성하기에 편리했습니다. 추가적인 장점으로는 낮은 유지보수 요구, 여러 유형의 배양 플레이트를 조사할 수 있는 용량, 분석당 최대 4개의 장치를 동시에 사용할 수 있는 경량(2kg)/크기(44cm3), 휴대성, 정확하고 재현 가능한 조사(데이터는 표시되지 않음), 컴퓨터 또는 다른 기계에 연결할 필요가 ?...

가장 치명적인 비전염성 질병 중 암은 조기 사망의 세계적인 주요 원인입니다. 2020년에는 거의 1,000만 명이 사망했으며, 이는 전 세계적으로 사망자 6명 중 1명에 해당합니다1. 또한 다제 내성(MDR) 현상은 승인된 화학 요법 프로토콜이 이임상 상태에 대한 완화 단계에 도달하지 못하기 때문에 엄청난 공중 보건 위협을 나타냅니다2. 암세포는 여러 메커니즘을 통해 화학 요법에 대한 내성을 개발할 수 있습니다. 그러나, 일부 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체(ATP-의존성 유출 펌프)의 과발현은 종양 미세환경 내에서 MDR 발달의 주요 원인으로 간주된다3. MDR 외에도 재발 및 전이와 같은 다른 암 합병증은 이러한 종양학적 문제를 극복하기 위한 치료 접근법을 개발하고 개선해야 하는 긴급한 요구를 강화합니다.
빛의 치료 적 활용은 수세기 동안 실행되어 왔으며 4 광역학 요법 (PDT)은 고형 종양에 대해 임상 적으로 승인 된 치료 접근법을 나타냅니다. PDT는 광감작제(PS) 투여 후 광 조사를 결합하여 활성 산소 종(ROS)을 생성하여 종양 세포에서 선택적 세포 독성을 발휘합니다. 이 치료 접근법은 수술, 방사선 및 화학 요법을 포함한 기존의 방법보다 우수합니다5; 결합 조직에서 더 낮은 세포 독성을 나타내는 최소 침습적 기술입니다6. 종양 또는 그 미세 환경에 직접 가벼운 적용과 PS 축적은 정확한 표적화를 보장하고, 결과적으로 경미하고 바람직하지 않은 전신 부작용7 및 동일한 부위에서의 반복 치료 가능성을 보장합니다. 또한 비용은 다른 접근 방식보다 저렴합니다. 그의 유망한 특징으로 인해, PDT는 단일, 특히 수술불가능한 종양의 경우 또는 보조 암 치료7 모두에 적합한 옵션으로 간주될 수 있으며, 화학요법 8,9와 관련된 MDR에 대한 대안을 나타낸다.
PDT를 사용하여 높은 객관적 반응률을 보여주는 첫 번째 보고서는 1975 년 마우스 및 래트 모델10에서 설명되었습니다. 그 이후로, 2D 세포 배양11,12에서 인간 종양 세포주와 함께 생체 내 및 시험관 내 모두에서 긍정적 인 결과7를 가진 PDT를 사용하여 연구가 수행되었습니다. 임상 적으로 승인 된 PS의 광범위한 적용 가능성을 고려할 때, 특정 축적 경로 및 흡수 피크의 파장 범위에 관계없이 일반적인 프로세스는 다음과 같습니다 : (i) PS 흡수, (ii) 종양 또는 미세 환경에서 PS 농도의 피크, (iii) 광 적용, (iv) PS- 광 상호 작용, (v) PS 여기 상태 에너지를 조직 기질 또는 주변 산소 분자로 전달, (vi) 일중항 산소 또는 슈퍼옥사이드 음이온을 수반하는 ROS 생산, (vii) 본질적으로 괴사 또는 세포자멸사멸(직접 사망), 자가포식(세포 보호 메커니즘), 조직 허혈(혈관 손상), 면역 조절 또는 이러한 메커니즘의 중첩을 통한 종양 세포 사멸7. 이 마지막 단계에서, 특정 세포 사멸 경로의 활성화는 세포 특성, 실험 설계 및 가장 중요하게는 PS 세포 내 국소화 및 PDT 관련 표적 손상과 같은 많은 인자에 의존한다13.
Verteporfin은 연령 관련 황반 변성을 치료하기 위해 노르웨이와 중국에서 임상 사용을 위해 규제 기관의 승인을 받은 2세대 PS입니다7. 용량 전달 후, 이 전구약물은 미토콘드리아14에 부분적으로 축적되고 세포 단백질 티로신 인산화 및 DNA 단편화를 유도하여 종양 세포 세포사멸15,16을 유도하는 것으로 보고되었습니다. 베르테포르핀 내재화를 위한 24시간 배양 후, 인접한 분자 7,17로의 전자기 방사선 전달의 효과적인 수준을 달성하기 위해 690nm 파장 셋업을 사용하는 PDT 프로토콜이 권장됩니다.
PDT의 광원과 관련하여 클래식 다이오드 레이저 시스템은 일반적으로 비싸고 기술적으로 복잡하며 크기가 커서 휴대 할 수 없습니다18,19. LED 기반 PDT 장비에서도 관찰할 수 있는 단일 파장 프로파일의 결과로 각 감광제 응용 분야에 대한 독립적인 장치에 대한 요구로 인해 다이오드 레이저 시스템의 활용이 훨씬 더 복잡하고 경제적으로 실현 불가능해집니다20,21. 따라서 LED 기계의 활용은 비용(22) 및 유지 보수 문제뿐만 아니라 높은 전력 출력과 덜 유해한 23 및 더 넓은 조명 기능(24,25,26,27)을 제공하는 가장 유망한 대안으로 간주됩니다.
LED 기반 장비가 PDT 실험(28)에 제공할 수 있는 잠재적인 기여에도 불구하고, 대부분의 상업적 옵션은 여전히 휴대성 부족, 높은 비용, 및 복잡한 건설 프로젝트 및 운영(29)과 같은 단점을 가지고 있다. 이 연구의 주요 목적은 체외 PDT 분석을 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 도구를 제공하는 것이었습니다. 이 백서에서는 저렴하고 사용자 친화적이며 휴대가 가능한 자체 내장 LED 기반 PDT 장치인 PhotoACT에 대해 설명합니다. 개념 증명으로이 장치는 2D 세포 배양 모델에서 베르테 포르 핀의 세포 독성을 향상시키는 것으로 나타 났으므로 PDT 실험에서 연구 도구로 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

이 백서에서는 PhotoACT라는 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 수행하기 위한 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다. 이 장치는 기존의 프로그래밍 가능 발광 다이오드(LED), 액정 디스플레이(LCD) 모듈 및 상용 마이크로 컨트롤러 기판에 연결된 광 센서 세트를 사용하여 제작되었습니다. 프로토 타입의 박스 기반 구조는 중간 밀도 섬유판 (MDF)으로 만들어졌습니다. 내부 구획은 4개의 세포 배양 멀티웰 마이크로플레이트를 동시에 할당할 수 있습니다.
개념 증명으로 2차원(2D) 배양에서 HeLa 세포주에 대한 광민감제(PS) 베르테포르핀의 세포독성 효과를 연구했습니다. HeLa 세포를 24 시간 동안 증가하는 농도의 베르테 포르핀으로 처리했습니다. 약물-함유 상청액 배지를 버리고, 부착성 세포를 인산완충식염수(PBS)로 세척하고, 약물-없는 배지를 첨가하였다. 이 연구에서, 세포에 대한 베르테 포르 핀의 효과는 255, 255 및 255의 적색-녹색-청색 (RGB) 값 (평균 플루언스 49.1 ± 0.6 J / cm2)을 사용하여 빛에 노출되지 않거나 1 시간 동안 노출된 후 조사되었습니다. 24시간 후, 세포 생존율을 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석에 의해 평가하였다.
실험 결과는 베르테 포르 핀으로 처리 된 세포를 장치의 빛에 노출시키는 것이 활성 산소 종 (ROS)에 의해 매개되는 메커니즘을 통해 약물의 세포 독성 효과를 향상시키는 것으로 나타났습니다. 또한이 작업에 설명 된 프로토 타입의 사용은 결과를 상용 PDT 장치와 비교하여 검증되었습니다. 따라서이 LED 기반 광 역학 치료 프로토 타입은 PDT의 체외 연구를위한 좋은 대안을 나타냅니다.

PhotoACT라는 이름의 최종 PDT 장치에는 최대 4개의 멀티웰 마이크로플레이트를 할당할 수 있는 암실이 포함되어 있으며, 상부 내부 표면에는 가시광선의 뚜렷한 스펙트럼을 방출하도록 프로그래밍된 30개의 산란된 LED 세트가 장착되어 있습니다(그림 3 및 보충 파일 6). 이 장치는 PDT 분석을 위한 어두운 챔버로 설계된 내부 상자와 내부 챔버를 덮고 제어 장치를 고?...

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An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

여기에서는 2차원 HeLa 세포 배양 및 베르테포르핀을 감광제로 사용하여 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 성공적으로 수행할 수 있는 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다.

2D 세포 배양 모델에서 Verteporfin 세포 독성을 향상시키기 위한 자체 제작 및 발광 다이오드 기반 광역학 치료 장치

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

광역학 요법인 PDT는 암 치료에 몇 가지 이점을 제공하며 그 효능은 광감작제를 활성화하는 광원에 따라 다릅니다. 최근 이 분야의 발전에도 불구하고, 시험관내 모델용 PTD를 위한 고가의 재현 가능한 장치에 대한 접근이 부족하다. 이러한 요구를 달성하기 위해 이 작업은 PhotoAct라는 세포 배양에서 PDT 분석을 수행하는 새롭고 간단하며 저렴한 장치를 설명합니다.건설을 시작하려면 3mm 두께의 중간 밀도 섬유판 인 MDF를 사용하여 다음 치수의 조각을 얻었습니다. 다음 치수로 두 개의 상자를 만듭니다. 더 큰 상자의 뒷면을 뚫어 배럴 잭 커넥터를 설치합니다.또한 더 큰 상자의 상단, 작은 상자의 상단 및 하단을 뚫어 전기 케이블을 위한 통로를 제공합니다. 균일한 빛의 입사를 촉진하기 위해 모든 내부 표면을 검은색 잉크로 칠합니다. 작은 상자의 상단 내부 표면에 각각 10개의 LED가 있는 3개의 LED 테이프를 병렬로 부착합니다.또한 작은 상자의 하단 내부 표면 중앙에 밝기 센서를 설치하십시오. 보조 3D 인쇄 파일을 사용하여 제어 장치의 구조를 인쇄합니다. 모든 구성 요소, 전원 버튼, 전위차계, 시간 시작 터치패드, LED, 밝기 센서, LCD, 버저 및 전원 공급 장치와 제어 장치 내부에 장착된 ESP-32 컨트롤러 보드의 부품을 설치합니다.보충 파일에서 사용할 수 있는 프로그래밍 코드를 업로드하고 테스트를 실행하여 모든 연결이 작동하는지 확인합니다. 상자를 조립하고 함께 고정하여 틈과 그에 따른 외부 조명 간섭 및 즉각적인 빛 손실을 방지하십시오. 장착 된 제어 장치를 프로토 타입 상단의 드릴 영역에 부착하십시오.다음 치수의 동일한 재료의 전면 도어를 만들고 경첩과 벨크로 테이프로 외부 상자에 고정하여 챔버 폐쇄 및 중단 없는 분석을 보장합니다. 또한 손잡이를 설치하여 전면 도어를 쉽고 정확하게 조작 할 수 있습니다. 작업 중 안정성을 높이기 위해 프로토타입 하단에 4개의 고무 풋 패드를 부착합니다.Dulbecco의 변형 된 독수리 배지에서 HeLa 세포주를 배양하십시오 10 %의 태아 소 혈청과 1 %의 겐타 마이신으로 저혈당. 배양 플라스크를 5%의 이산화탄소와 섭씨 37도에 보관하십시오. 80-90%의 합류점에 도달할 때까지 세포 배양을 관리하고 검사합니다.파종 과정으로 세포 생존 프로토콜을 시작하십시오. 플라스크로부터 배지를 컨플루언트 HeLa 세포 배양물로 제거한다. 플라스크를 인산염 완충 식염수, PBS로 세척하고 강조 표시된 세부 사항에 따라 트립신으로 배양물을 분리합니다.혈구 측정기로 재현탁 세포를 세고 웰 당 20, 000 세포 농도의 멀티 웰 마이크로 플레이트에 시드하십시오. 어둡고 밝은 치료 조건을 위해 두 개의 플레이트를 준비하고 세포 부착을 위해 24 시간 동안 배양합니다. 광감작제로 치료를 진행하려면 양쪽 플레이트에서 배지를 제거하고 100 마이크로 리터의 증가 된 농도의 Verteporfin으로 세포를 처리하십시오.Verteporfin 내재화를 허용하기 위해 세포를 24 시간 동안 치료하십시오. 배양 후, 처리를 제거하고, PBS로 세포를 세척하고, 약물이 없는 배지를 첨가한다. 하나의 마이크로 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛에 노출되지 않도록 보호하고 24 시간 동안 배양하십시오.이 마이크로플레이트는 PDT 결과의 추가 분석을 위한 대조 데이터를 제공합니다. 다른 마이크로 플레이트는 PhotoAct에서 광 노출 조건에 활용됩니다. 장비를 작동하려면 콘센트에 꽂고 전원을 켜고 전원 버튼을 누르십시오.멀티웰 마이크로플레이트를 PDT 챔버에 놓고 전면 도어를 측면 벨크로 테이프로 고정하여 장비를 닫습니다. 장비를 설정하려면 전위차계를 사용하여 발광의 RGB 구성을 조정하십시오. 플러스/마이너스 터치패드를 눌러 시간 구성을 조정하고 분석 기간을 설정합니다.분석에 대한 올바른 정보가 디스플레이에 표시되는지 확인하고 필요한 경우 최종 조정을 수행하십시오. 시작 터치패드를 눌러 분석을 시작합니다. 실험 시작시 한 번의 경고음 부저가 들려야합니다.실험 중에 방사 조도 및 남은 시간과 같은 진행 정보를 디스플레이에서 관찰 할 수 있습니다. PDT 분석 중에 전면 도어를 열거나 구성을 변경하지 마십시오. 분석이 끝나면 4 번의 경고음 부저가 들리고 전자 시스템이 모든 LED를 끕니다.완성 된 메시지와 실험 중에 확장 된 최종 에너지 양을 디스플레이에서 관찰 할 수 있습니다. 플루언스 최종 값은 강조 표시된 방정식에 따라 계산됩니다. 광에 노출된 마이크로플레이트를 덮고 24시간 배양을 진행한다.배양 기간 후, 양쪽 플레이트로부터 배지를 제거하고, 세포의 단층을 PBS로 세척하고, MTT 용액을 첨가한다. 포르마잔 결정 형성을 허용하기 위해 4시간 동안 두 플레이트의 어두운 상태와 밝은 조건에서 배양합니다. MTT 용액을 조심스럽게 제거하고 DMSO 및 에탄올 용액으로 보라색 결정을 용해시킵니다.결정 용해가 완료된 후, 595 나노미터에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도 측정을 수행한다. 최종 제품은 가시 광선의 뚜렷한 스펙트럼을 방출하도록 프로그래밍 된 30 개의 산란 된 발광 다이오드, LED 세트가 장착 된 상부 내부 표면이있는 어두운 챔버로 구성됩니다. 내부 표면의 낮은 반사율과 LED 구성의 균일한 분포로 인해 균일한 광 입사율이 설정됩니다.설정 인터페이스는 사용자 친화적이며 정착된 실험 조건을 재현할 수 있었습니다. 개념 증명으로 이 장치를 사용하여 광 노출 후 2D HeLa 세포 배양에서 Verteporfin의 세포독성 효과를 향상시켰습니다. 도면에 나타낸 바와 같이, GI50 값은 조명 조건에 대해 3.1 마이크로몰이었다.및 어두운 조건에 대한 13.8 마이크로 몰 따라서 조건을 비교하여 효율이 4 배 이상 증가하면 Verteporfin을 감광제로 사용하고 PDT 분석에 대한 PhotoAct의 적용 가능성을 확인할 수 있습니다. 이 작업에 설명 된 프로토 타입의 사용을 검증하기 위해 상용 PDT 장치를 광감작제, 세포 및 플루 언스를 포함한 동일한 실험 조건에서 사용하고 결과를 비교했습니다. 그림에서 볼 수 있듯이 두 장치 모두 Verteporfin을 똑같이 광활성화하여 세포 독성 효과를 향상시킵니다.마지막으로, 광 노출 후 Verteporfin에 의해 유발 된 ROS 매개 세포 사멸을 DCFDA 분석을 사용한 유세포 분석에 의해 확인했다. 요약하면, 이 장치는 총 비용이 50 미만인 상업적으로 이용 가능한 저비용 부품으로 쉽게 제작되었습니다. 이 장치의 주요 다른 장점은 휴대성, 낮은 유지 보수 수요, 여러 유형의 배양 플레이트를 조사할 수 있는 용량, 분석당 최대 4개의 장치를 동시에 사용하는 것, 정확하고 재현 가능한 조사, 컴퓨터 또는 다른 기계에 연결할 필요가 없는 사용자 친화적이고 간단한 설정 인터페이스 등입니다.또한 의사 결정 흐름도를 제공하여 작업 중 문제 또는 오류를 찾아 수정하기위한 체계적인 문제 해결 접근 방식을 제공합니다. 이러한 발견을 통해 PDT를 과학 연구로 촉진하기 위해 PhotoAct의 이점을 확장하여 감광제의 작용 메커니즘과 임상 적용을 탐구 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

양 사체 (Transcriptome) 분석에있는 사용을위한 씨앗에서 매우 정제 된 RNA의 분리를위한 효율적인 방법

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 실리콘 질화물 멤브레인의 세포 배양 및 저온 준비

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

면역 반응 강화 기술을 이용한 초고속 웨스턴 블롯

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...