Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

Vi takker Arthur Henrique Gomes de Oliveira og Lucas Julian Cruz Gomes for hjelpen med filmprosessen. Dette prosjektet ble støttet av det brasilianske forskningsrådet (CNPq, tilskuddsnummer 400953/2016-1-404286/2021-6) og Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Denne studien ble også delvis finansiert av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Enhetens konstruksjon
<ol><li>Sag 3 mm tykke middels tetthet fiberplater (MDF) for å oppnå stykker med dimensjonene vist i figur 1A. MERK: Bruk vektorfilen (tilleggsfil 1) til cnc-skjæring (numerisk kontroll).</li>
	<li>Bygg to bokser med følgende dimensjoner (lengde x bredd...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

Den endelige PhotoACT-enheten var praktisk å konstruere med kommersielt tilgjengelige, rimelige komponenter til en total kostnad på mindre enn $ 50. Ytterligere fordeler inkluderer lave vedlikeholdsbehov, kapasitet til å bestråle flere typer kulturplater, samtidig bruk av opptil fire enheter per analyse, lav vekt (2 kg) / størrelse (44 cm3) som tillater bærbarhet, nøyaktig og reproduserbar bestråling (data ikke vist), og et brukervennlig og enkelt oppsettgrensesnitt som ikke krever tilkobling til datam...

Blant de mest dødelige ikke-smittsomme sykdommene representerer kreft en global ledende årsak til tidlig død. Den sto for nesten 10 millioner dødsfall i 2020, som representerer om lag ett av seks dødsfall på verdensbasis1. I tillegg representerer fenomenet multiresistens (MDR) en enorm folkehelsetrussel, da godkjente kjemoterapeutiske protokoller ikke når remisjonsstadier for denne kliniske tilstanden2. Kreftceller kan utvikle motstand mot kjemoterapi gjennom flere mekanismer; Imidlertid anses overekspresjonen av noen ATP-bindende kassetttransportører (ABC) - ATP-avhengige efflukspumper - som hovedårsaken til MDR-utvikling i et tumormikromiljø3. I tillegg til MDR forsterker andre kreftkomplikasjoner, som tilbakefall og metastase, det presserende behovet for å utvikle og forbedre terapeutiske tilnærminger for å overvinne denne onkologiske utfordringen.
Den kurative utnyttelsen av lys har blitt praktisert i århundrer4, og fotodynamisk terapi (PDT) representerer en klinisk godkjent terapeutisk tilnærming for solide svulster. PDT kombinerer administrering av en fotosensibilisator (PS) etterfulgt av lysbestråling for å generere reaktive oksygenarter (ROS) for å utøve selektiv cytotoksisitet i tumorceller. Denne terapeutiske tilnærmingen er bedre enn konvensjonelle metoder, inkludert kirurgi, stråling og kjemoterapi5; Det er en minimal invasiv teknikk som viser lavere cytotoksisitet i bindevev6. Lysapplikasjonen og PS-akkumuleringen direkte i svulsten eller dens mikromiljø sikrer presis målretting og følgelig mindre, uønskede systemiske bivirkninger7 og muligheten for gjentatt behandling på samme sted. Videre er kostnaden lavere enn for andre tilnærminger. På grunn av sine lovende egenskaper kan PDT betraktes som et passende alternativ for både enkelt, spesielt i tilfelle av inoperable svulster, eller adjuvant kreftbehandling7, og representerer et alternativ for MDR relatert til kjemoterapi 8,9.
Den første rapporten som viste høy objektiv responsrate ved bruk av PDT ble beskrevet i 1975 i en muse- og rottemodell10. Siden da har studier blitt utført ved bruk av PDT med positive resultater7 både in vivo og in vitro med humane tumorcellelinjer i 2D-cellekultur11,12. Tatt i betraktning den brede anvendeligheten av klinisk godkjent PS, uavhengig av deres spesifikke akkumuleringsveier og bølgelengdeområder av absorpsjonstopper, er den generelle prosessen som følger: (i) PS-opptak, (ii) topping av PS-konsentrasjon ved svulsten eller dens mikromiljø, (iii) lysapplikasjon, (iv) PS-lysinteraksjon, (v) overføring av PS-opphisset tilstandsenergi til enten vevssubstrat eller omkringliggende oksygenmolekyler, (vi) ROS-produksjon som involverer singlet oksygen eller superoksidanion, (vii) tumorcelledød via hovedsakelig nekrose eller apoptose (direkte død), autofagi (cytobeskyttende mekanisme), vevsiskemi (vaskulær skade), immunmodulering eller overlapping av disse mekanismene7. I dette siste stadiet avhenger aktiveringen av en spesifikk celledødsvei av mange faktorer, for eksempel celleegenskaper, eksperimentell design og, viktigst, PS intracellulær lokalisering og PDT-relatert målrettet skade13.
Verteporfin er en andregenerasjons PS, godkjent av tilsynsorganer for klinisk bruk i Norge og Kina for å behandle aldersrelatert makuladegenerasjon7. Etter doselevering ble dette prodruget delvis akkumulert i mitokondrier14 og indusere cellulær proteintyrosinfosforylering og DNA-fragmentering, noe som førte til tumorcelleapoptose15,16. Etter 24 timers inkubasjon for verteporfin-internalisering anbefales en PDT-protokoll ved bruk av et 690 nm bølgelengdeoppsett for å oppnå effektive nivåer av elektromagnetisk strålingsoverføring til tilstøtende molekyler 7,17.
Når det gjelder lyskilden for PDT, er de klassiske diodelasersystemene vanligvis dyre, teknisk kompliserte, store og dermed ubærbare18,19. Som en konsekvens av sin enkeltbølgelengdeprofil, som også kan observeres i LED-basert PDT-utstyr, gjør etterspørselen etter uavhengige enheter for hver fotosensibiliseringsapplikasjon utnyttelsen av diodelasersystemer enda mer kompleks og økonomisk umulig20,21. Derfor anses bruken av LED-maskiner som det mest lovende alternativet for å løse ikke bare kostnader22 og vedlikeholdsproblemer, men også for å gi høy effekt og mindre skadelig 23 og bredere belysningsevne24,25,26,27.
Til tross for det potensielle bidraget som LED-basert utstyr kan tilby til PDT-eksperimenter28, har de fleste kommersielle alternativer fortsatt ulemper som mangel på bærbarhet, høye kostnader og komplekse byggeprosjekter og drift29. Hovedmålet med dette arbeidet var å tilby et enkelt og pålitelig verktøy for in vitro PDT-analyser. Dette papiret beskriver PhotoACT, en egenbygd LED-basert PDT-enhet, som er billig, brukervennlig og bærbar. Som et bevis på konseptet er denne enheten vist å forbedre cytotoksisiteten til verteporfin i en 2D-cellekulturmodell og kan derfor brukes som et forskningsverktøy i PDT-eksperimenter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

Dette papiret beskriver en ny, enkel og rimelig enhet for å utføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) analyser, kalt PhotoACT. Enheten ble bygget ved hjelp av et sett med konvensjonelle programmerbare lysdioder (LED), en LCD-modul (Liquid Crystal Display) og en lyssensor koblet til et kommersielt mikrokontrollerkort. Den boksbaserte strukturen til prototypen ble laget med fiberplater med middels tetthet (MDF). Det indre rommet kan samtidig tildele fire cellekultur multiwell mikroplater.
Som et bevis på konseptet studerte vi den cytotoksiske effekten av fotosensibilisatoren (PS) verteporfin mot HeLa-cellelinjen i todimensjonal (2D) kultur. HeLa-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av verteporfin i 24 timer. Det medikamentholdige supernatantmediet ble kassert, de tilhørende cellene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), og medikamentfritt medium ble tilsatt. I denne studien ble effekten av verteporfin på celler undersøkt enten uten lyseksponering eller etter eksponering i 1 time for lys ved bruk av rød-grønn-blå (RGB) verdier på 255, 255 og 255 (gjennomsnittlig flyt på 49,1 ± 0,6 J / cm2). Etter 24 timer ble cellens levedyktighet vurdert ved 3-(4,5-dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse.
Eksperimentelle resultater viste at eksponering av celler behandlet med verteporfin til lyset fra enheten forbedrer stoffets cytotoksiske effekt via en mekanisme mediert av reaktive oksygenarter (ROS). I tillegg ble bruken av prototypen beskrevet i dette arbeidet validert ved å sammenligne resultatene med en kommersiell PDT-enhet. Dermed representerer denne LED-baserte fotodynamiske terapiprototypen et godt alternativ for in vitro-studier av PDT.

Den endelige PDT-enheten, kalt PhotoACT, inkluderte et mørkt kammer for å tildele opptil fire multiwell mikroplater, med sin øvre indre overflate utstyrt med et sett med 30 spredte lysdioder programmert til å avgi forskjellige spektrum av synlig lys (figur 3 og tilleggsfil 6). Enheten ble bygget ved hjelp av to tilhørende bokser: en intern boks designet som et mørkt kammer for PDT-analysene, og en ekstern boks for å dekke det indre kammeret og holde kontrollenheten (<...

Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Her beskriver vi en ny, enkel og rimelig enhet for å kunne utføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) analyser ved hjelp av todimensjonal HeLa-cellekultur og verteporfin som fotosensibilisator.

Et internt bygget og lysemitterende diodebasert fotodynamisk behandlingsapparat for å forbedre verteporfincytotoksisitet i en 2D-cellekulturmodell

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

Fotodynamisk terapi, PDT, gir flere fordeler for kreftbehandling, og effekten avhenger av en lyskilde for å aktivere en fotosensibilisator. Selv om de siste fremskrittene i feltet, er det mangel på tilgang til en dyr og reproduserbar enhet for PTD for in vitro-modeller. For å oppnå denne etterspørselen beskriver dette arbeidet en ny, enkel og rimelig enhet for å utføre PDT-analyser på cellekulturer, kalt PhotoAct.For å starte konstruksjonen, så tre millimeter tykkelse medium tetthet fiber boards, MDF, for å oppnå stykker med følgende dimensjoner. Bygg to bokser med følgende dimensjoner. Bor baksiden av den større boksen for å installere en tønnekontaktkontakt.Bor også toppen av den større boksen, toppen og bunnen av den mindre boksen for å gi en passasje for elektriske kabler. Mal alle de indre overflatene med svart blekk for å fremme homogen lysforekomst. Fest parallelt tre LED-bånd med 10 lysdioder hver på den øvre indre overflaten av den mindre boksen.I tillegg installerer du en lysstyrkesensor i midten av den nederste indre overflaten av den mindre boksen. Skriv ut strukturen til kontrollenheten ved hjelp av den supplerende 3D-utskriftsfilen. Installer alle komponenter, strømknapp, potensiometre, tidsstart-berøringsplate, lysdioder, lysstyrkesensor, LCD, summer og strømforsyning, og delene til et ESP-32-kontrollerkort montert på kontrollenhetens interiør.Last opp programmeringskoden som er tilgjengelig på tilleggsfilen, og kjør en test for å kontrollere at alle tilkoblinger fungerer. Monter boksene og fest dem sammen for å unngå hull og dermed ekstern belysningsinterferens og umiddelbart lystap. Fest den monterte kontrollenheten til det borede området øverst på prototypen.Bygg en inngangsdør av samme materiale i følgende dimensjoner, og fest den på ytterboksen med hengsler og borrelåsbånd for å sikre kammerlukking og uavbrutte analyser. Monter også et håndtak for å manipulere inngangsdøren med letthet og presisjon. Fest fire gummifotputer nederst på prototypen for å sikre mer stabilitet under operasjonene.Dyrk HeLa-cellelinjen i Dulbeccos modifiserte ørn Middels lav glukose med 10% av føtalt bovint serum og 1% gentamycin. Hold kulturkolber ved 5% karbondioksid og 37 Celsius grader. Administrer og inspiser cellekulturen til den når 80 til 90% av samløpet.Start cellens levedyktighetsprotokoll med såingsprosessen. Fjern mediet fra kolben med sammenflytende HeLa-cellekultur. Vask kolben med fosfatbuffer saltvann, PBS, og løsne kulturen med trypsin etter uthevede detaljer.Tell resuspendcellene med et hemocytometer og frø dem i en mikroplate med flere brønner i konsentrasjon på 20.000 celler per brønn. Forbered to plater for mørke og lyse behandlingsforhold og inkuber dem i 24 timer til cellefesting. For å fortsette behandlingen med en fotosensibilisator, fjern mediet fra begge plater og behandle cellene med 100 mikroliter økende konsentrasjoner av verteporfin.Hold cellene i behandling i 24 timer for å tillate verteporfin internalisering. Etter inkubasjon, fjern behandlingen, vask cellene med PBS og tilsett stofffritt medium. Dekk en mikroplate med aluminiumsfolie for å beskytte den mot lyseksponering og inkuber den i 24 timer.Denne mikroplaten vil tilby kontrolldata for videre analyse av PDT-resultater. Den andre mikroplaten vil bli brukt på lyseksponeringstilstand ved PhotoAct. For å betjene utstyret, koble det til stikkontakten og slå det på ved å trykke på strømknappen.Plasser mikroplaten med flere brønner ved PDT-kammeret og lukk utstyret ved å feste frontdøren med borrelåsbåndene på siden. For å sette opp utstyret, bruk potensiometrene til å justere RGB-konfigurasjonen av lysutslipp. Trykk på pluss/minus styrepute for å justere tidskonfigurasjonen og angi analysevarigheten.Kontroller om riktig informasjon om analysen vises på displayet, og foreta endelige justeringer om nødvendig. Trykk på startknappen for å starte analysen. En one-beep buzzer må høres i begynnelsen av forsøket.Under eksperimentet kan fremdriftsinformasjon observeres på displayet, for eksempel bestråling og tid igjen. Ikke åpne inngangsdøren eller endre noen konfigurasjon under PDT-analysen. På slutten av analysen må en fire-pip buzzer høres og det elektroniske systemet vil slå av alle lysdiodene.En ferdig melding og den endelige mengden energi utvidet under eksperimentet kan observeres på displayet. Den endelige flytverdien beregnes i henhold til den uthevede ligningen. Dekk mikroplaten som led lyseksponering og fortsett med 24-timers inkubasjon.Etter inkubasjonsperiode, fjern medium fra begge platene, vask monolaget av celler med PBS, og tilsett MTT-løsning. Inkuber begge platene mørke og lyse forhold i fire timer for å tillate formazankrystalldannelse. Fjern MTT-oppløsningen forsiktig og løs opp de lilla krystallene med en DMSO- og etanolløsning.Etter fullstendig krystalloppløsning, utfør absorbansmålingen ved hjelp av en mikroplateleser på 595 nanometer. Det endelige produktet består av et mørkt kammer med sin øvre indre overflate utstyrt med et sett med 30 spredte lysemitterende dioder, lysdioder, programmert til å avgi forskjellige spektrum av synlig lys. En homogen lysforekomst etableres på grunn av den lave reflektiviteten til innvendige overflater og jevn fordeling av LED-konfigurasjon.Oppsettgrensesnittet er brukervennlig og den avgjorte eksperimentelle tilstanden var reproduserbar. Som et bevis på konseptet ble enheten brukt til å forbedre den cytotoksiske effekten av verteporfin i 2D HeLa-cellekultur etter lyseksponering. Som vist i figuren var GI50-verdien 3,1 mikromolar for lystilstanden.og 13,8 mikromolar for den mørke tilstanden Derfor bekrefter økningen på mer enn fire ganger i effektivitet sammenlignet med forholdene bruken av verteporfin som fotosensibilisator og anvendeligheten av PhotoAct på PDT-analyser. For å validere bruken av prototypen beskrevet i dette arbeidet, ble en kommersiell PDT-enhet brukt under de samme eksperimentelle forholdene, inkludert fotosensibilisator, celler og flyt, og resultatene ble sammenlignet. Som vist på figuren, fotoaktiverte begge enhetene Verteporfin likt, og forbedret den cytotoksiske effekten.Endelig ble ROS-mediert celledød utløst av verteporfin etter lyseksponering bekreftet ved flowcytometri ved bruk av DCFDA-analyse. Oppsummert ble enheten enkelt bygget med kommersielt tilgjengelige lavpriskomponenter med en total kostnad på mindre enn 50. Den viktigste andre fordelen med enheten inkluderer bærbarhet, lavt vedlikeholdsbehov, kapasitet til å bestråle flere typer kulturplater, samtidig bruk av opptil fire enheter per analyse, nøyaktig og reproduserbar bestråling, brukervennlig og enkelt oppsettgrensesnitt som ikke krever tilkobling til datamaskiner eller andre maskiner.I tillegg presenteres et beslutningsflytskjema for å gi en systematisk problemløsende tilnærming for å finne og rette opp problemer eller feil under operasjonen. Disse funnene gjør det mulig å utvide fordelene med PhotoAct for å lette PDT til vitenskapelig forskning, utforske virkningsmekanismen til fotosensibilisatorer og deres kliniske anvendelser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode for Isolering av høyt renset RNA fra frø for bruk i Quantitative Analysis transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkel manipulering av arkitekturer i Protein-basert Hydrogels for celle kultur programmer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Styrking av engraftment av humant indusert pluripotent Stem Cell-avledet Cardiomyocytes via en forbigående hemming av Rho kinase aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell kultur på Silicon nitride membraner og Cryopreparation for Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot ved hjelp av immunoreaction styrke teknologi

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...