Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

Мы благодарим Артура Энрике Гомеса де Оливейру и Лукаса Джулиана Круза Гомеса за помощь в съемочном процессе. Этот проект был поддержан Бразильским исследовательским советом (CNPq, номера грантов 400953/2016-1-404286/2021-6) и Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Это исследование было также частично профинансировано Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации , относящейся ко всем материалам, реагентам и программному обеспечению, используемым в этом протоколе.
1. Конструкция устройства
<ol><li>Пила пилой древесноволокнистых плит средней пл?...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

Окончательное устройство PhotoACT было удобно строить с коммерчески доступными недорогими компонентами общей стоимостью менее 50 долларов. Дополнительные преимущества включают в себя низкие требования к техническому обслуживанию, способность облучать несколько типов культуральных пла?...

Среди наиболее смертоносных неинфекционных заболеваний рак представляет собой ведущую глобальную причину преждевременной смерти. На его долю пришлось почти 10 миллионов смертей в 2020 году, что составляет примерно одну из шести смертей во всем мире1. Кроме того, явление множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) представляет собой огромную угрозу для общественного здравоохранения, поскольку утвержденные химиотерапевтические протоколы не достигают стадий ремиссии для этого клинического состояния2. Раковые клетки могут развивать устойчивость к химиотерапии через несколько механизмов; однако сверхэкспрессия некоторых АТФ-связывающих кассетных (АВС) транспортеров - АТФ-зависимых эффлюксных насосов - считается основной причиной развития МЛУ в микроокружении опухоли3. В дополнение к MDR, другие осложнения рака, такие как рецидив и метастазирование, усиливают настоятельную потребность в разработке и совершенствовании терапевтических подходов для преодоления этой онкологической проблемы.
Лечебное использование света практикуется на протяжениивеков 4, и фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой клинически одобренный терапевтический подход для солидных опухолей. ФДТ сочетает в себе введение фотосенсибилизатора (PS) с последующим световым облучением для генерации активных форм кислорода (АФК) для оказания селективной цитотоксичности в опухолевых клетках. Этот терапевтический подход превосходит обычные методы, включая хирургию, облучение и химиотерапию5; это минимально инвазивный метод, показывающий более низкую цитотоксичность в соединительных тканях6. Легкое применение и накопление PS непосредственно в опухоли или ее микросреде обеспечивают точное нацеливание и, следовательно, незначительные, нежелательные системные побочные эффекты7 и возможность повторного лечения на том же участке. Более того, стоимость ниже, чем у других подходов. Благодаря своим многообещающим особенностям ФДТ можно считать подходящим вариантом как для единичных, особенно в случае неоперабельных опухолей, так и для адъювантного лечения рака7, и представляет собой альтернативу МЛУ, связанной с химиотерапией 8,9.
Первый отчет, показывающий высокую объективную частоту ответа с использованием PDT, был описан в 1975 году на мышиной и крысиной модели10. С тех пор исследования проводились с использованием ФДТ с положительными исходами7 как in vivo, так и in vitro с линиями опухолевых клеток человека в 2D клеточной культуре11,12. Учитывая широкую применимость клинически одобренных PS, независимо от их специфических путей накопления и диапазонов длин волн пиков поглощения, общий процесс выглядит следующим образом: (i) поглощение PS, (ii) достижение пика концентрации PS в опухоли или ее микроокружении, (iii) применение света, (iv) взаимодействие PS-света, (v) передача энергии возбужденного состояния PS либо тканевому субстрату, либо окружающим молекулам кислорода, (vi) Производство АФК с участием синглетного кислорода или супероксидного аниона, (vii) гибель опухолевых клеток посредством, по существу, некроза или апоптоза (прямая смерть), аутофагии (цитопротекторный механизм), ишемии тканей (повреждение сосудов), иммунной модуляции или перекрытия этих механизмов7. На этом заключительном этапе активация конкретного пути гибели клеток зависит от многих факторов, таких как характеристики клеток, экспериментальный дизайн и, самое главное, внутриклеточная локализация PS и целенаправленное повреждение, связанное с ФДТ13.
Вертепорфин является PS второго поколения, одобренным регулирующими органами для клинического использования в Норвегии и Китае для лечения возрастной макулярной дегенерации7. Сообщалось, что после доставки дозы этот пролекарство частично накапливается в митохондриях14 и индуцирует фосфорилирование тирозина клеточного белка и фрагментацию ДНК, что приводит к апоптозу опухолевых клеток 15,16. После 24-часовой инкубации для интернализации вертепорфинов рекомендуется протокол PDT с использованием установки длины волны 690 нм для достижения эффективных уровней передачи электромагнитного излучения соседним молекулам 7,17.
Что касается источника света для PDT, классические диодные лазерные системы обычно дорогие, технически сложные, негабаритные и, следовательно, непортируемые18,19. Как следствие его одноволнового профиля, который также можно наблюдать в оборудовании PDT на основе светодиодов, потребность в независимых блоках для каждого применения фотосенсибилизатора делает использование диодных лазерных систем еще более сложным и экономически нецелесообразным20,21. Поэтому использование светодиодной техники считается наиболее перспективной альтернативой для решения не только затрат22 и вопросов технического обслуживания, но и для обеспечения высокой выходной мощности и менее вредной23 и более широкой осветительной способности 24,25,26,27.
Несмотря на потенциальный вклад, который светодиодное оборудование может предложить в эксперименты PDT28, большинство коммерческих вариантов по-прежнему имеют недостатки, такие как отсутствие портативности, высокая стоимость и сложные строительные проекты и эксплуатация29. Основная цель этой работы заключалась в том, чтобы предложить простой и надежный инструмент для анализа PDT in vitro . В этой статье описывается PhotoACT, собственное устройство PDT на основе светодиодов, которое является недорогим, удобным для пользователя и портативным. В качестве доказательства концепции показано, что это устройство усиливает цитотоксичность вертепорфина в модели 2D-культуры клеток и, следовательно, может быть использовано в качестве исследовательского инструмента в экспериментах PDT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

В этой статье описывается новое, простое и недорогое устройство для выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT), названное PhotoACT. Устройство было построено с использованием набора обычных программируемых светодиодов (LED), модуля жидкокристаллического дисплея (LCD) и датчика освещенности, подключенного к плате коммерческого микроконтроллера. Коробчатая конструкция прототипа была выполнена из древесноволокнистых плит средней плотности (MDF). Внутренний отсек может одновременно выделять четыре многоязычные микропластины клеточной культуры.
В качестве доказательства концепции мы изучили цитотоксический эффект фотосенсибилизатора (PS) вертепорфина против клеточной линии HeLa в двумерной (2D) культуре. Клетки HeLa обрабатывали повышением концентрации вертепорфина в течение 24 ч. Лекарственно-содержащую надпосадочную среду выбрасывали, адгезивные клетки промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и добавляли безмедикаментозную среду. В этом исследовании влияние вертепорфина на клетки изучали либо без воздействия света, либо после воздействия света в течение 1 ч с использованием красно-зелено-синих (RGB) значений 255, 255 и 255 (средняя плавность 49,1 ± 0,6 Дж/см2). Через 24 ч жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ).
Экспериментальные результаты показали, что воздействие на клетки, обработанные вертепорфином, на свет от устройства усиливает цитотоксический эффект препарата через механизм, опосредованный активными формами кислорода (АФК). Кроме того, использование прототипа, описанного в этой работе, было подтверждено путем сравнения результатов с коммерческим устройством PDT. Таким образом, этот прототип фотодинамической терапии на основе светодиодов представляет собой хорошую альтернативу для исследований ФДТ in vitro .

Последнее устройство PDT, названное PhotoACT, включало темную камеру для выделения до четырех многолуночных микропластин, а его верхняя внутренняя поверхность была оснащена набором из 30 рассеянных светодиодов, запрограммированных на испускание различных спектров видимого света (<strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Здесь мы описываем новое, простое и недорогое устройство для успешного выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT) с использованием двумерной культуры клеток HeLa и вертепорфина в качестве фотосенсибилизатора.

Собственное устройство фотодинамической терапии на основе светодиодов для повышения цитотоксичности вертепорфина в 2D-модели клеточной культуры

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

Фотодинамическая терапия, ФДТ, предлагает несколько преимуществ для лечения рака, и ее эффективность зависит от источника света для активации фотосенсибилизатора. Несмотря на недавние достижения в этой области, существует отсутствие доступа к дорогому и воспроизводимому устройству для PTD для моделей in vitro. Чтобы удовлетворить этот спрос, в этой работе описывается новое, простое и недорогое устройство для выполнения анализов PDT на клеточных культурах под названием PhotoAct.Чтобы начать строительство, распилили три миллиметра толщиной древесноволокнистые плиты средней плотности, МДФ, чтобы получить куски со следующими размерами. Постройте два блока со следующими размерами. Просверлите заднюю часть большого ящика, чтобы установить разъем для разъема ствола.Также просверлите верхнюю часть большей коробки, верхнюю и нижнюю части меньшей коробки, чтобы обеспечить проход для электрических кабелей. Покрасьте все внутренние поверхности черными чернилами, чтобы способствовать однородному освещению. Параллельно прикрепите три светодиодные ленты с 10 светодиодами каждая на верхней внутренней поверхности меньшей коробки.Кроме того, установите датчик яркости в центре нижней внутренней поверхности меньшей коробки. Распечатайте структуру блока управления с помощью дополнительного файла 3D-печати. Установите все компоненты, кнопку питания, потенциометры, сенсорную панель времени запуска, светодиоды, датчик яркости, ЖК-дисплей, зуммер и блок питания, а также части платы контроллера ESP-32, установленные внутри блока управления.Загрузите программный код, доступный в дополнительном файле, и запустите тест, чтобы убедиться, что все подключения работают. Соберите коробки и закрепите их вместе, чтобы избежать зазоров и, следовательно, внешних помех освещения и немедленной потери света. Прикрепите установленный блок управления к просверленной области в верхней части прототипа.Соорудите входную дверь из того же материала в следующих размерах, и закрепите ее на внешней коробке петлями и Velcro лентами, чтобы обеспечить закрытие камеры и непрерывные анализы. Также установите ручку для управления входной дверью с легкостью и точностью. Прикрепите четыре резиновые ножки в нижней части прототипа, чтобы обеспечить большую стабильность во время операций.Культивируйте клеточную линию HeLa в модифицированном Eagle Medium от Dulbecco с низким содержанием глюкозы с 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% гентамицина. Держите колбы для культуры при 5% углекислого газа и 37 градусах Цельсия. Управляйте и осматривайте культуру клеток до достижения 80-90% слияния.Запустите протокол жизнеспособности клеток с процесса посева. Удалите среду из колбы со сливающейся культурой клеток HeLa. Промыть колбу фосфатным буферным физиологическим раствором PBS и отделить культуру трипсином, следуя выделенным деталям.Подсчитайте повторно суспендированные клетки с помощью гемоцитометра и посейте их в многолуночную микропластину в концентрации 20 000 клеток на лунку. Подготовьте две пластины для темных и светлых условий лечения и инкубируйте их в течение 24 часов для прикрепления клеток. Чтобы приступить к лечению фотосенсибилизатором, удалите среду с обеих пластин и обработайте клетки 100 микролитрами возрастающих концентраций вертепорфина.Держите клетки в лечении в течение 24 часов, чтобы обеспечить интернализацию вертепорфина. После инкубации снимают обработку, промывают клетки PBS и добавляют безмедикаментозную среду. Накройте одну микропластинку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от воздействия света, и инкубируйте ее в течение 24 часов.Эта микропластина предложит контрольные данные для дальнейшего анализа результатов PDT. Другая микропластинка будет использоваться при освещении в PhotoAct. Для работы оборудования подключите его к розетке и включите, нажав кнопку питания.Поместите многолуночную микропластину в камеру PDT и закройте оборудование, скрепив фронтальную дверь боковыми Velcro лентами. Чтобы настроить оборудование, используйте потенциометры для настройки RGB-конфигурации светового излучения. Нажмите клавишу плюс/минус тачпад, чтобы настроить конфигурацию времени и установить продолжительность анализа.Проверьте, отображается ли на дисплее правильная информация об анализе, и при необходимости внесите окончательные коррективы. Нажмите начальную сенсорную панель, чтобы начать анализ. В начале эксперимента должен быть слышен зуммер с одним звуковым сигналом.Во время эксперимента на дисплее можно наблюдать информацию о прогрессе, такую как излучение и оставшееся время. Не открывайте входную дверь и не изменяйте конфигурацию во время анализа PDT. В конце анализа должен быть слышен зуммер с четырьмя звуковыми сигналами, и электронная система выключит все светодиоды.Готовое сообщение и конечное количество энергии, развернутой во время эксперимента, можно наблюдать на дисплее. Конечное значение флюенса вычисляется по выделенному уравнению. Накройте микропластинку, которая подверглась воздействию света, и приступайте к 24-часовой инкубации.После инкубационного периода удаляют среду с обеих пластин, промывают монослой клеток ПБС, добавляют раствор МТТ. Инкубируйте обе пластины в темных и светлых условиях в течение четырех часов, чтобы обеспечить образование кристаллов формамазана. Осторожно удалите раствор МТТ и растворите фиолетовые кристаллы раствором ДМСО и этанола.После полного растворения кристаллов проводят измерение поглощения с помощью микропластичного считывателя на 595 нанометров. Конечный продукт состоит из темной камеры с верхней внутренней поверхностью, оснащенной набором из 30 рассеянных светодиодов, светодиодов, запрограммированных на излучание различных спектров видимого света. Однородное падение света устанавливается за счет низкой отражательной способности внутренних поверхностей и равномерного распределения конфигурации светодиодов.Интерфейс настройки удобен для пользователя, а установленное экспериментальное состояние было воспроизводимым. В качестве доказательства концепции устройство использовалось для усиления цитотоксического эффекта вертепорфина в культуре клеток 2D HeLa после воздействия света. Как показано на рисунке, значение GI50 составляло 3,1 микромоляра для состояния освещенности.и 13,8 микромолярия для темного состояния Таким образом, увеличение эффективности более чем в четыре раза при сравнении условий подтверждает использование Вертепорфина в качестве фотосенсибилизатора и применимость PhotoAct на анализах PDT. Чтобы подтвердить использование прототипа, описанного в этой работе, коммерческое устройство PDT использовалось в тех же экспериментальных условиях, включая фотосенсибилизатор, клетки и флюенс, и результаты сравнивались. Как показано на рисунке, оба устройства фотоактивировали Вертепорфин в равной степени, усиливая цитотоксический эффект.Наконец, ROS-опосредованная гибель клеток, вызванная Вертепорфином после воздействия света, была подтверждена проточной цитометрией с использованием анализа DCFDA. Таким образом, устройство было легко построено с коммерчески доступными недорогими компонентами с общей стоимостью менее 50. Основными другими преимуществами устройства являются портативность, низкая потребность в обслуживании, способность облучать несколько типов культуральных пластин, одновременное использование до четырех единиц на анализ, точное и воспроизводимое облучение, удобный и простой интерфейс настройки, который не требует подключения к компьютерам или другим машинам.Кроме того, представлена блок-схема принятия решений, обеспечивающая систематический подход к решению проблем для поиска и исправления проблем или ошибок во время операции. Эти результаты позволяют расширить преимущества PhotoAct для облегчения ФДТ для научных исследований, изучения механизма действия фотосенсибилизаторов и их клинического применения.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Простое управление архитектуры в гидрогели на основе белков для приложений культуры клеток

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Улучшение прививки человека индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов через переходный ингибирование Деятельности Ро Киназы

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Клеточная культура на силиконовых нитридных мембранах и криопрепарат для синхротронного рентгеновского флуоресценции Нано-анализа

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ультра-высокоскоростной западный пятно с использованием иммунореакции Повышение технологии

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...