Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

Vi tackar Arthur Henrique Gomes de Oliveira och Lucas Julian Cruz Gomes för att de hjälpte till med filmprocessen. Detta projekt stöddes av det brasilianska forskningsrådet (CNPq, bidragsnummer 400953/2016-1-404286/2021-6) och Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Denna studie finansierades också delvis av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och programvara som används i detta protokoll.
1. Enhetens konstruktion
<ol><li>Såg 3 mm tjocka fiberplattor med medelhög densitet (MDF) för att erhålla bitar med måtten som visas i figur 1A. OBS: Använd vektorfilen (Tilläggsfil 1) för datorskärning av numerisk kontroll (CNC).</li>
	<li>Bygg två lådor med följan...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

Den slutliga PhotoACT-enheten var bekväm att konstruera med kommersiellt tillgängliga, billiga komponenter till en total kostnad på mindre än $ 50. Ytterligare fördelar inkluderar låga underhållskrav, kapacitet att bestråla flera typer av odlingsplattor, samtidig användning av upp till fyra enheter per analys, låg vikt (2 kg) / storlek (44 cm3) som möjliggör bärbarhet, exakt och reproducerbar bestrålning (data visas inte) och ett användarvänligt och enkelt installationsgränssnitt som inte krä...

Bland de mest dödliga icke-överförbara sjukdomarna utgör cancer en globalt ledande orsak till för tidig död. Det stod för nästan 10 miljoner dödsfall 2020, vilket motsvarar ungefär ett av sex dödsfall i världen1. Dessutom utgör fenomenet multiresistans (MDR) ett enormt hot mot folkhälsan, eftersom godkända kemoterapeutiska protokoll inte når remissionsstadier för detta kliniska tillstånd2. Cancerceller kan utveckla resistens mot kemoterapi genom flera mekanismer; Överuttrycket av vissa ATP-bindande kassetttransportörer (ABC) - ATP-beroende effluxpumpar - anses dock vara den främsta orsaken till MDR-utveckling inom en tumörmikromiljö3. Förutom MDR förstärker andra cancerkomplikationer, såsom återfall och metastasering, den brådskande efterfrågan på att utveckla och förbättra terapeutiska metoder för att övervinna denna onkologiska utmaning.
Det botande utnyttjandet av ljus har praktiserats i århundraden4, och fotodynamisk terapi (PDT) representerar ett kliniskt godkänt terapeutiskt tillvägagångssätt för solida tumörer. PDT kombinerar administrering av en fotosensibiliserare (PS) följt av lätt bestrålning för att generera reaktiva syrearter (ROS) för att utöva selektiv cytotoxicitet i tumörceller. Detta terapeutiska tillvägagångssätt är överlägset konventionella metoder, inklusive kirurgi, strålning och kemoterapi5; Det är en minimalt invasiv teknik som visar lägre cytotoxicitet i bindväv6. Ljusapplikationen och PS-ackumuleringen direkt i tumören eller dess mikromiljö säkerställer exakt inriktning och följaktligen mindre, oönskade systemiska biverkningar7 och möjligheten till upprepad behandling på samma plats. Dessutom är kostnaden lägre än för andra tillvägagångssätt. På grund av dess lovande egenskaper kan PDT betraktas som ett lämpligt alternativ för både singel, särskilt vid inoperabla tumörer eller adjuvant cancerbehandling7, och representerar ett alternativ för MDR relaterat till kemoterapi 8,9.
Den första rapporten som visade en hög objektiv svarsfrekvens med PDT beskrevs 1975 i en mus- och råttmodell10. Sedan dess har studier genomförts med PDT med positiva utfall7 både in vivo och in vitro med humana tumörcellinjer i 2D-cellodling11,12. Med tanke på den breda tillämpligheten av kliniskt godkända PS, oavsett deras specifika ackumuleringsvägar och våglängdsintervall för absorptionstoppar, är den allmänna processen följande: (i) PS-upptag, (ii) toppning av PS-koncentration vid tumören eller dess mikromiljö, (iii) ljusapplikation, (iv) PS-ljusinteraktion, (v) överföring av PS-exciterad tillståndsenergi till antingen vävnadssubstrat eller omgivande syremolekyler, vi) ROS-produktion som involverar singlet syre eller superoxidanjon, (vii) tumörcellsdöd via, i huvudsak, nekros eller apoptos (direkt död), autofagi (cytoprotektiv mekanism), vävnadsischemi (vaskulär skada), immunmodulering eller en överlappning av dessa mekanismer7. I detta sista steg beror aktiveringen av en specifik celldödsväg på många faktorer, såsom cellegenskaper, experimentell design och, viktigast av allt, PS intracellulär lokalisering och PDT-relaterad riktad skada13.
Verteporfin är en andra generationens PS, godkänd av tillsynsmyndigheter för klinisk användning i Norge och Kina för att behandla åldersrelaterad makuladegeneration7. Efter dosleverans rapporterades denna prodrog delvis ackumuleras i mitokondrier14 och inducera cellulärt proteintyrosinfosforylering och DNA-fragmentering, vilket leder till tumörcellsapoptos15,16. Efter 24 timmars inkubation för verteporfininternalisering rekommenderas ett PDT-protokoll med en våglängdsinställning på 690 nm för att uppnå effektiva nivåer av elektromagnetisk strålningsöverföring till intilliggande molekyler 7,17.
När det gäller ljuskällan för PDT är de klassiska diodlassystemen vanligtvis dyra, tekniskt komplicerade, överdimensionerade och därmed oportabla18,19. Som en följd av dess envåglängdsprofil, som också kan observeras i LED-baserad PDT-utrustning, gör efterfrågan på oberoende enheter för varje fotosensibiliserande applikation användningen av diodlasersystem ännu mer komplex och ekonomiskt omöjlig20,21. Därför, användningen av LED-maskiner anses vara det mest lovande alternativet för att lösa inte bara kostnader 22 och underhållsproblem, utan också för att ge hög effekt och mindre skadlig23 och bredare belysningsförmåga24,25,26,27.
Trots det potentiella bidrag som LED-baserad utrustning kan erbjuda till PDT-experiment28, de flesta kommersiella alternativ har fortfarande nackdelar som brist på bärbarhet, höga kostnader och komplexa byggprojekt och drift29. Huvudsyftet med detta arbete var att erbjuda ett enkelt och pålitligt verktyg för in vitro PDT-analyser. Detta dokument beskriver PhotoACT, en egenbyggd LED-baserad PDT-enhet, som är billig, användarvänlig och bärbar. Som ett bevis på konceptet har denna enhet visat sig förbättra cytotoxiciteten hos verteporfin i en 2D-cellodlingsmodell och kan därför användas som ett forskningsverktyg i PDT-experiment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

Detta dokument beskriver en ny, enkel och billig enhet för att utföra in vitro fotodynamisk terapi (PDT) -analyser, kallad PhotoACT. Enheten byggdes med hjälp av en uppsättning konventionella programmerbara lysdioder (lysdioder), en LCD-modul (liquid crystal display) och en ljussensor ansluten till ett kommersiellt mikrokontrollerkort. Prototypens lådbaserade struktur gjordes med fiberplattor med medelhög densitet (MDF). Det inre facket kan samtidigt allokera fyra mikroplattor för cellodling multiwell.
Som ett bevis på konceptet studerade vi den cytotoxiska effekten av fotosensibiliseraren (PS) verteporfin mot HeLa-cellinjen i tvådimensionell (2D) kultur. HeLa-celler behandlades med ökande koncentrationer av verteporfin i 24 timmar. Det läkemedelsinnehållande supernatantmediet kasserades, de vidhäftande cellerna tvättades med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och läkemedelsfritt medium tillsattes. I denna studie undersöktes effekten av verteporfin på celler antingen utan ljusexponering eller efter exponering i 1 timme för ljus med hjälp av rödgrönblå (RGB) värden på 255, 255 och 255 (genomsnittlig fluens på 49,1 ± 0,6 J / cm2). Efter 24 timmar bedömdes cellviabiliteten genom analysen 3-(4,5-dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT).
Experimentella resultat visade att exponering av celler behandlade med verteporfin för ljuset från enheten förbättrar läkemedlets cytotoxiska effekt via en mekanism medierad av reaktiva syrearter (ROS). Dessutom validerades användningen av prototypen som beskrivs i detta arbete genom att jämföra resultaten med en kommersiell PDT-enhet. Således representerar denna LED-baserade fotodynamiska terapiprototyp ett bra alternativ för in vitro-studier av PDT.

Den sista PDT-enheten, som heter PhotoACT, inkluderade en mörk kammare för att fördela upp till fyra multiwell-mikroplattor, med sin övre inre yta utrustad med en uppsättning av 30 spridda lysdioder programmerade för att avge distinkta spektrum av synligt ljus (figur 3 och kompletterande fil 6). Enheten byggdes med två tillhörande lådor: en intern låda utformad som en mörk kammare för PDT-analyserna och en extern låda för att täcka den inre kammaren och hålla...

Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Här beskriver vi en ny, enkel och billig enhet för att framgångsrikt utföra in vitro fotodynamisk terapi (PDT) analyser med tvådimensionell HeLa-cellodling och verteporfin som fotosensibiliserare.

En egenbyggd och ljusdiodbaserad fotodynamisk terapiapparat för att förbättra verteporfincytotoxicitet i en 2D-cellodlingsmodell

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

Fotodynamisk terapi, PDT, erbjuder flera fördelar för cancerbehandling, och dess effektivitet beror på en ljuskälla för att aktivera en fotosensibiliserare. Även om de senaste framstegen inom området saknas tillgång till en dyr och reproducerbar produkt för PTD för in vitro-modeller. För att uppnå denna efterfrågan beskriver detta arbete en ny, enkel och billig enhet för att utföra PDT-analyser på cellkulturer, med namnet PhotoAct.För att starta konstruktionen, såg tre millimeter tjocklek fiberskivor med medelhög densitet, MDF, för att få bitar med följande dimensioner. Bygg två lådor med följande dimensioner. Borra baksidan av den större lådan för att installera en fatuttagskontakt.Borra också toppen av den större lådan, toppen och botten av den mindre lådan för att ge en passage för elektriska kablar. Måla alla inre ytor med svart bläck för att främja homogen ljusincidens. Fäst parallellt tre LED-band med 10 lysdioder vardera på den övre inre ytan av den mindre lådan.Installera dessutom en ljusstyrkasensor i mitten av den nedre inre ytan på den mindre lådan. Skriv ut styrenhetens struktur med hjälp av den kompletterande 3D-utskriftsfilen. Installera alla komponenter, strömbrytare, potentiometrar, tidsstartpekplatta, lysdioder, ljusstyrka, LCD, summer och strömförsörjning och delarna på ett ESP-32-styrkort monterat på styrenhetens interiör.Ladda upp programmeringskoden som finns tillgänglig på kompletterande fil och kör ett test för att kontrollera att alla anslutningar fungerar. Montera lådorna och fixera dem tillsammans för att undvika luckor och därmed yttre belysningsstörningar och omedelbar ljusförlust. Fäst den monterade styrenheten på det borrade området högst upp på prototypen.Bygg en ytterdörr av samma material i följande dimensioner och fäst den på ytterlådan med gångjärn och kardborreband för att säkerställa kammarstängning och oavbrutna analyser. Installera också ett handtag för att enkelt och precisionsmanipulera ytterdörren. Fäst fyra fotkuddar av gummi längst ner på prototypen för att säkerställa mer stabilitet under operationerna.Odla HeLa-cellinjen i Dulbeccos modifierade Eagle Medium låg glukos med 10% av fostrets bovina serum och 1% av gentamycin. Håll odlingskolvarna vid 5% koldioxid och 37 grader Celsius. Hantera och inspektera cellkulturen tills den når 80 till 90% av sammanflödet.Starta cellviabilitetsprotokollet med såddprocessen. Ta bort mediet från kolven med sammanflytande HeLa-cellodling. Tvätta kolven med fosfatbuffert saltlösning, PBS, och lossa kulturen med trypsin efter markerade detaljer.Räkna resucesivcellerna med en hemocytometer och frö dem till en mikroplatta med flera brunnar i koncentration av 20 000 celler per brunn. Förbered två plattor för mörka och ljusa behandlingsförhållanden och inkubera dem i 24 timmar till cellfäste. För att fortsätta med behandling med en fotosensibiliserare, ta bort mediet från båda plattorna och behandla cellerna med 100 mikroliter ökande koncentrationer av Verteporfin.Håll cellerna i behandling i 24 timmar för att tillåta Verteporfin internalisering. Efter inkubation, ta bort behandlingen, tvätta cellerna med PBS och tillsätt läkemedelsfritt medium. Täck en mikroplatta med aluminiumfolie för att skydda den från ljusexponering och inkubera den i 24 timmar.Denna mikroplatta kommer att erbjuda kontrolldata för vidare analys av PDT-resultat. Den andra mikroplattan kommer att användas på ljusexponeringstillstånd vid PhotoAct. För att använda utrustningen, anslut den till uttaget och slå på den genom att trycka på strömbrytaren.Placera mikroplattan med flera brunnar i PDT-kammaren och stäng utrustningen genom att fästa frontdörren med kardborrebanden på sidan. För att ställa in utrustningen, använd potentiometrarna för att justera RGB-konfigurationen av ljusemission. Tryck på plus/minus-pekplattan för att justera tidskonfigurationen och ställa in analysens varaktighet.Kontrollera om rätt information om analysen visas på displayen och gör slutliga justeringar vid behov. Tryck på startpekplattan för att starta analysen. En en-pip summer måste höras i början av experimentet.Under experimentet kan framstegsinformation observeras på displayen, såsom bestrålning och tid kvar. Öppna inte ytterdörren och ändra inte någon konfiguration under PDT-analysen. I slutet av analysen måste en fyrpipig summer höras och det elektroniska systemet stänger av alla lysdioder.Ett färdigt meddelande och den slutliga mängden energi som expanderas under experimentet kan observeras vid displayen. Fluens slutvärde beräknas enligt den markerade ekvationen. Täck mikroplattan som drabbades av ljusexponering och fortsätt med 24-timmars inkubation.Efter inkubationsperioden, ta bort medium från båda plattorna, tvätta monolagret av celler med PBS och tillsätt MTT-lösning. Inkubera båda plattorna mörka och ljusa förhållanden i fyra timmar för att tillåta formazankristallbildning. Ta bort MTT-lösningen försiktigt och lös upp de lila kristallerna med en DMSO- och etanollösning.Efter fullständig kristallupplösning, utför absorbansmätningen med hjälp av en mikroplattläsare vid 595 nanometer. Slutprodukten består av en mörk kammare med sin övre inre yta utrustad med en uppsättning av 30 spridda ljusemitterande dioder, lysdioder, programmerade för att avge distinkta spektrum av synligt ljus. En homogen ljusincidens fastställs på grund av den låga reflektiviteten hos inre ytor och enhetlig fördelning av LED-konfiguration.Installationsgränssnittet är användarvänligt och det sedimenterade experimentella tillståndet var reproducerbart. Som ett bevis på konceptet användes enheten för att förbättra den cytotoxiska effekten av Verteporfin i 2D HeLa-cellodling efter ljusexponering. Som visas i figuren var GI50-värdet 3,1 mikromolar för ljusförhållandet.och 13,8 mikromolar för mörkt tillstånd Därför bekräftar ökningen av mer än fyrfaldig effektivitet jämfört med förhållandena användningen av Verteporfin som fotosensibiliserare och tillämpligheten av PhotoAct på PDT-analyser. För att validera användningen av prototypen som beskrivs i detta arbete användes en kommersiell PDT-enhet under samma experimentella förhållanden, inklusive fotosensibiliserare, celler och flyt, och resultaten jämfördes. Som visas i figuren fotoaktiverade båda enheterna Verteporfin lika, vilket förbättrar den cytotoxiska effekten.Slutligen bekräftades den ROS-medierade celldöden som utlöstes av Verteporfin efter ljusexponering genom flödescytometri med DCFDA-analys. Sammanfattningsvis byggdes enheten enkelt med kommersiellt tillgängliga lågkostnadskomponenter med en total kostnad på mindre än 50. Den största andra fördelen med enheten inkluderar bärbarhet, lågt underhållsbehov, kapacitet att bestråla flera typer av odlingsplattor, samtidig användning av upp till fyra enheter per analys, exakt och reproducerbar bestrålning, användarvänligt och enkelt installationsgränssnitt som inte kräver anslutning till datorer eller andra maskiner.Dessutom presenteras ett beslutsflödesschema för att ge en systematisk problemlösningsmetod för att hitta och korrigera problem eller fel under operationen. Dessa fynd gör det möjligt att utöka fördelarna med PhotoAct för att underlätta PDT till vetenskaplig forskning, utforska verkningsmekanismen för fotosensibiliserare och deras kliniska tillämpningar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metod för isolering av högrenat RNA från frön för användning i kvantitativ transkriptom analys

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkelt att använda arkitekturer i Protein-baserade hydrogeler för Cell kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie om metabolismen av sex systemiska insekticider i en nyetablerad cell SUS pension kultur härledd från Tea (Camellia sinensis L.) Lämnar

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Förbättra inympningen av humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda Kardiomyocyter via en övergående hämning av Rho-Kinas aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell odling på Kiselnitridmembran och Kryopreparation för Synchrotron röntgenfluorescens Nanoanalys

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultrahög hastighet Western Blot med hjälp av immunoreaction förbättra teknik

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaserad endonukleaskopplad DNA-metyleringsanalys för att screena för DNA-metyltransferashämmare

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...