Name: an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

Arthur Henrique Gomes de Oliveira ve Lucas Julian Cruz Gomes'e çekim sürecine yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu proje Brezilya Araştırma Konseyi (CNPq, hibe numaraları 400953/2016-1-404286/2021-6) ve Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 tarafından finanse edilmiştir.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Cihaz yapımı
<ol><li>Testere 3 mm kalınlığında orta yoğunluklu suntalar (MDF) Şekil 1A'da gösterilen boyutlara sahip parçalar elde etmek için. NOT: Bilgisayar sayısal denetimi (CNC) kesimi için vektör dosyasını (Ek Dosya 1) kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki boyut...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+agency+for+research+on+cancer.">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).</li><li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+cancer:+role+of+Atp-dependent+transporters.">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li><li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+multidrug+resistance+in+cancer.">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li><li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy.">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li><li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+cancer:+what's+past+is+prologue.">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li><li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury.">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li><li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Rold&#225;n-Varona, P., Rodr&#237;guez-Cobo, L., L&#243;pez-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+compendium+of+latest+reviews.">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447 (2021).</li><li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer.">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91 (2019).</li><li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance.">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li><li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light.">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li><li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources.">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li><li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2/Bax+signaling+pathway.">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li><li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer.">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li><li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy.">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li><li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells.">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li><li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+photodynamic+therapy:+part+two+-+cellular+signaling,+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death.">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li><li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy.">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li><li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+oncologic+horizons.">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation.">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li><li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy.">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li><li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy.">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li><li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CultureLED:+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates.">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323 (2022).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles.">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li><li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review.">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li><li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis.">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li><li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation.">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li><li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue,+green,+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines.">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li><li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments.">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li><li>G&#225;lvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device.">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).</li><li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer.">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474 (2019).</li><li>. T. SketchUp Available from: <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022)</li><li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022)</li><li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022)</li></ol>

Son PhotoACT cihazı, ticari olarak temin edilebilen, düşük maliyetli bileşenlerle toplam maliyeti 50 dolardan az olan bileşenlerle inşa etmek için uygundu. Ek avantajlar arasında düşük bakım talepleri, birden fazla kültür plakası türünü ışınlama kapasitesi, tahlil başına dört üniteye kadar aynı anda kullanım, taşınabilirliğe izin veren düşük ağırlık (2 kg) / boyut (44cm3), doğru ve tekrarlanabilir ışınlama (veriler gösterilmemiştir) ve bilgisayarlara veya diğer makin...

En ölümcül bulaşıcı olmayan hastalıklar arasında kanser, erken ölümün küresel bir önde gelen nedenini temsil etmektedir. 2020'de yaklaşık 10 milyon ölümden sorumluydu ve dünya çapında altı ölümden birini temsilediyordu 1. Ek olarak, çoklu ilaç direnci (MDR) fenomeni, onaylanmış kemoterapötik protokoller bu klinik durum2 için remisyon aşamalarına ulaşamaaşamadığından muazzam bir halk sağlığı tehdidini temsil etmektedir. Kanser hücreleri çeşitli mekanizmalarla kemoterapiye direnç geliştirebilir; Bununla birlikte, bazı ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılarının (ATP'ye bağımlı efflux pompalar) aşırı ekspresyonu, bir tümör mikroortamında MDR gelişiminin ana nedeni olarak kabul edilir3. ÇİD'ye ek olarak, nüks ve metastaz gibi diğer kanser komplikasyonları, bu onkolojik zorluğun üstesinden gelmek için terapötik yaklaşımların geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için acil talebi güçlendirmektedir.
Işığın küratif kullanımı yüzyıllardır uygulanmaktadır4 ve fotodinamik terapi (PDT) solid tümörler için klinik olarak onaylanmış bir terapötik yaklaşımı temsil etmektedir. PDT, tümör hücrelerinde seçici sitotoksisite uygulamak için reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için bir fotosensitizörün (PS) uygulanmasını ve ardından hafif ışınlamayı birleştirir. Bu terapötik yaklaşım, cerrahi, radyasyon ve kemoterapi dahil olmak üzere geleneksel yöntemlerden üstündür5; bağ dokularında daha düşük sitotoksisite gösteren minimal invaziv bir tekniktir6. Doğrudan tümörde veya mikro ortamında ışık uygulaması ve PS birikimi, hassas hedefleme ve sonuç olarak küçük, istenmeyen sistemik yan etkiler7 ve aynı bölgede tekrarlanan tedavi olasılığını sağlar. Dahası, maliyet diğer yaklaşımlardan daha düşüktür. Umut verici özellikleri nedeniyle PDT, özellikle inoperabl tümörlerde veya adjuvan kanser tedavisi7 durumunda hem tek başına hem de tek başına uygun bir seçenek olarak düşünülebilir ve kemoterapi 8,9 ile ilişkili MDR için bir alternatifi temsil eder.
PDT kullanılarak yüksek objektif yanıt oranı gösteren ilk rapor 1975 yılında fare ve sıçan model10'da tanımlanmıştır. O zamandan beri, PDT kullanılarak, 2D hücre kültürü11,12'de insan tümör hücre hatları ile hem in vivo hem de in vitro pozitif sonuçlar7 ile çalışmalar yapılmıştır. Klinik olarak onaylanmış PS'nin geniş uygulanabilirliği göz önüne alındığında, spesifik birikim yolakları ve absorpsiyon piklerinin dalga boyu aralıklarına bakılmaksızın, genel süreç aşağıdaki gibidir: (i) PS alımı, (ii) tümörde veya mikro ortamında PS konsantrasyonunun zirveye ulaşması, (iii) ışık uygulaması, (iv) PS-ışık etkileşimi, (v) PS uyarılmış durum enerjisinin doku substratına veya çevresindeki oksijen moleküllerine aktarılması, (vi) singlet oksijen veya süperoksit anyonu içeren ROS üretimi, (vii) esasen nekroz veya apoptoz (doğrudan ölüm), otofaji (sitoprotektif mekanizma), doku iskemisi (vasküler hasar), immün modülasyon veya bu mekanizmaların örtüşmesi yoluyla tümör hücresi ölümü7. Bu son aşamada, spesifik bir hücre ölüm yolunun aktivasyonu, hücre özellikleri, deneysel tasarım ve en önemlisi PS hücre içi lokalizasyonu ve PDT ile ilişkili hedeflenen hasar gibi birçok faktöre bağlıdır13.
Verteporfin, yaşa bağlı makula dejenerasyonunu tedavi etmek için Norveç ve Çin'de klinik kullanım için düzenleyici kurumlar tarafından onaylanan ikinci nesil bir PS'dir7. Doz verildikten sonra, bu ön ilacın kısmen mitokondri14'te biriktiği ve hücresel protein tirozin fosforilasyonunu ve DNA fragmantasyonunu indükleyerek tümör hücresi apoptozu 15,16'ya yol açtığı bildirilmiştir. Verteporfin içselleştirmesi için 24 saatlik inkübasyondan sonra, bitişik moleküllere etkili elektromanyetik radyasyon transferi seviyeleri elde etmek için 690 nm dalga boyu kurulumu kullanan bir PDT protokolü önerilir 7,17.
PDT için ışık kaynağı ile ilgili olarak, klasik diyot lazer sistemleri genellikle pahalı, teknik olarak karmaşık, büyük boyutlu ve dolayısıyla taşınabilir olmayan 18,19'dur. LED tabanlı PDT ekipmanlarında da gözlemlenebilen tek dalga boyu profilinin bir sonucu olarak, her fotosensitizör uygulaması için bağımsız ünitelere olan talep, diyot lazer sistemlerinin kullanımını daha da karmaşık ve ekonomik olarak imkansız hale getirmektedir20,21. Bu nedenle, LED makinelerin kullanımı sadece maliyet22 ve bakım sorunlarını çözmek için değil, aynı zamanda yüksek güç çıkışı ve daha az zararlı 23 ve daha geniş aydınlatma kapasitesi 24,25,26,27 sağlamak için en umut verici alternatif olarak kabul edilir.
LED tabanlı ekipmanın PDT deneylerine sunabileceği potansiyel katkıya rağmen28, çoğu ticari seçenek hala taşınabilirlik eksikliği, yüksek maliyet ve karmaşık inşaat projeleri ve işletme29 gibi dezavantajlara sahiptir. Bu çalışmanın temel amacı, in vitro PDT testleri için basit ve güvenilir bir araç sunmaktı. Bu makalede, ucuz, kullanıcı dostu ve taşınabilir olan, şirket içi LED tabanlı bir PDT cihazı olan PhotoACT açıklanmaktadır. Kavramın bir kanıtı olarak, bu cihazın bir 2D hücre kültürü modelinde verteporfinin sitotoksisitesini arttırdığı gösterilmiştir ve bu nedenle PDT deneylerinde bir araştırma aracı olarak kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Mammalian cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Flashforge</td>
			<td></td>
			<td>Finder model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightness sensor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ESP32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design Software</td>
			<td>Trimble</td>
			<td></td>
			<td>SketchUp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540-500ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide, &#8805;99.5% (GC), suitable for plant cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657029</td>
			<td>FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus&#160;Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM IL LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD display</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED RGB WS2812</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDF fiberboards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3mm thickness medium-density fiberboards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational System</td>
			<td>Real Time Engineers ltd.</td>
			<td></td>
			<td>FreeRTOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micripipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 1-10 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 10-1000 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-electronic, single-channel, 20-200 &#956;L capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDT Equipment</td>
			<td>LumaCare</td>
			<td></td>
			<td>Model LC-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiometers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 &#956;L maximum volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verteporfin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0534-5MG</td>
			<td>Verteporfin, &#8805;94% (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-house-built and light-emitting-diode-based photodynamic therapy device for enhancing verteporfin cytotoxicity in a 2d cell culture model

Bu yazıda, PhotoACT adı verilen in vitro fotodinamik terapi (PDT) tahlillerini gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihaz açıklanmaktadır. Cihaz, bir dizi geleneksel programlanabilir ışık yayan diyot (LED), bir sıvı kristal ekran (LCD) modülü ve ticari bir mikrodenetleyici kartına bağlı bir ışık sensörü kullanılarak üretilmiştir. Prototipin kutu tabanlı yapısı, orta yoğunluklu suntalarla (MDF'ler) yapıldı. İç bölme aynı anda dört hücre kültürü multiwell mikroplakasını tahsis edebilir.
Kavramın bir kanıtı olarak, iki boyutlu (2D) kültürde fotosensitizör (PS) verteporfinin HeLa hücre hattına karşı sitotoksik etkisini inceledik. HeLa hücreleri 24 saat boyunca artan verteporfin konsantrasyonları ile tedavi edildi. İlaç içeren süpernatant ortam atıldı, yapışkan hücreler fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı ve ilaçsız ortam eklendi. Bu çalışmada, verteporfinin hücreler üzerindeki etkisi, ışığa maruz kalmadan veya 255, 255 ve 255 kırmızı-yeşil-mavi (RGB) değerleri (ortalama akıcılık 49.1 ± 0.6 J /cm2) kullanılarak ışığa 1 saat maruz kaldıktan sonra incelenmiştir. 24 saat sonra, hücre canlılığı 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi ile değerlendirildi.
Deneysel sonuçlar, verteporfin ile muamele edilen hücrelerin cihazdan gelen ışığa maruz kalmasının, reaktif oksijen türlerinin (ROS) aracılık ettiği bir mekanizma aracılığıyla ilacın sitotoksik etkisini arttırdığını göstermiştir. Ek olarak, bu çalışmada açıklanan prototipin kullanımı, sonuçların ticari bir PDT cihazı ile karşılaştırılmasıyla doğrulanmıştır. Bu nedenle, bu LED tabanlı fotodinamik terapi prototipi, PDT'nin in vitro çalışmaları için iyi bir alternatiftir.

PhotoACT olarak adlandırılan son PDT cihazı, dört adede kadar çok kuyulu mikro plakayı tahsis etmek için karanlık bir oda içeriyordu ve üst iç yüzeyi, farklı görünür ışık spektrumları yaymak üzere programlanmış 30 dağınık LED seti ile donatılmıştı (Şekil 3 ve Ek Dosya 6). Cihaz iki ilişkili kutu kullanılarak inşa edilmiştir: PDT tahlilleri için karanlık bir oda olarak tasarlanmış bir iç kutu ve iç odayı örtmek ve kontrol ünitesini ...

Watch this Scientific Journal Video about An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model at JoVE.com

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Burada, iki boyutlu HeLa hücre kültürü ve verteporfin kullanarak in vitro fotodinamik terapi (PDT) testlerini başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihazı fotosensitizör olarak tanımladık.

2D Hücre Kültürü Modelinde Verteporfin Sitotoksisitesini Arttırmak için Şirket İçi İnşa Edilmiş ve Işık Yayan Diyot Tabanlı Fotodinamik Terapi Cihazı

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

Fotodinamik terapi, PDT, kanser tedavisine çeşitli avantajlar sunar ve etkinliği, bir fotosensitizörü aktive etmek için bir ışık kaynağına bağlıdır. Alandaki son gelişmelere rağmen, in vitro modeller için PTD için pahalı ve tekrarlanabilir bir cihaza erişim eksikliği vardır. Bu talebi karşılamak için, bu çalışma PhotoAct adlı hücre kültürleri üzerinde PDT testleri yapmak için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihazı tanımlamaktadır.İnşaata başlamak için, aşağıdaki boyutlarda parçalar elde etmek için üç milimetre kalınlığında orta yoğunluklu fiber levhalar, MDF gördü. Aşağıdaki boyutlara sahip iki kutu oluşturun. Bir namlu jakı konektörü takmak için daha büyük kutunun arkasını delin.Ayrıca, elektrik kabloları için bir geçiş sağlamak için daha büyük kutunun üst kısmını, daha küçük kutunun üstünü ve altını delin. Homojen ışık insidansını teşvik etmek için tüm iç yüzeyleri siyah mürekkeple boyayın. Küçük kutunun üst iç yüzeyine her biri 10 LED'li üç LED bandı paralel olarak takın.Ek olarak, daha küçük kutunun alt iç yüzeyinin ortasına bir parlaklık sensörü takın. Ek 3D baskı dosyasını kullanarak kontrol ünitesinin yapısını yazdırın. Tüm bileşenleri, güç düğmesini, potansiyometreleri, zaman başlatma dokunmatik yüzeyini, LED'leri, parlaklık sensörünü, LCD'yi, zil sesini ve güç kaynağını ve kontrol ünitesinin iç kısmına monte edilmiş bir ESP-32 kontrol kartının parçalarını takın.Ek dosyada bulunan programlama kodunu yükleyin ve tüm bağlantıların çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için bir test çalıştırın. Kutuları monte edin ve boşlukları ve dolayısıyla harici aydınlatma parazitini ve anında ışık kaybını önlemek için bunları birbirine sabitleyin. Monte edilmiş kontrol ünitesini prototipin üst kısmındaki delinmiş alana takın.Aynı malzemeden aşağıdaki boyutlarda bir ön kapı inşa edin ve haznenin kapanmasını ve kesintisiz tahlilleri sağlamak için menteşeler ve Velcro bantlarla dış kutuya sabitleyin. Ayrıca ön kapıyı kolaylıkla ve hassasiyetle manipüle etmek için bir tutamak takın. İşlemler sırasında daha fazla stabilite sağlamak için prototipin altına dört lastik ayak yastığı takın.HeLa hücre hattını Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta düşük glikozunda% 10 fetal sığır serumu ve% 1 gentamisin ile geliştirin. Kültür şişelerini karbondioksitin% 5'inde ve 37 santigrat derecede tutun. Hücre kültürünü, birleşmenin% 80 ila% 90'ına ulaşana kadar yönetin ve inceleyin.Tohumlama işlemi ile hücre canlılığı protokolünü başlatın. Ortamın şişeden akıcı HeLa hücre kültürü ile çıkarılmasını sağlayın. Şişeyi fosfat tampon salin, PBS ile yıkayın ve vurgulanan ayrıntıları izleyerek kültürü tripsin ile ayırın.Bir hemositometre ile askıya alınan hücreleri sayın ve bunları kuyu başına 20.000 hücre konsantrasyonunda çok kuyucuklu bir mikro plakaya tohumlayın. Karanlık ve aydınlık tedavi koşulları için iki plaka hazırlayın ve hücre tutturmak için 24 saat boyunca inkübe edin. Bir fotosensitizör ile tedaviye devam etmek için, ortamı her iki plakadan da çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre artan Verteporfin konsantrasyonları ile tedavi edin.Verteporfinin içselleşmesine izin vermek için hücreleri 24 saat boyunca tedavide tutun. Kuluçkadan sonra, tedaviyi çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve ilaçsız ortam ekleyin. Işığa maruz kalmaktan korumak için bir mikro plakayı alüminyum folyo ile örtün ve 24 saat boyunca inkübe edin.Bu mikro plaka, PDT sonuçlarının daha fazla analizi için kontrol verileri sunacaktır. Diğer mikroplaka, PhotoAct'teki ışığa maruz kalma koşullarında kullanılacaktır. Ekipmanı çalıştırmak için, prize takın ve güç düğmesine basarak açın.Çok kuyulu mikro plakayı PDT odasına yerleştirin ve ön kapıyı yan Velcro bantlarla sabitleyerek ekipmanı kapatın. Ekipmanı kurmak için, ışık emisyonunun RGB konfigürasyonunu ayarlamak üzere potansiyometreleri kullanın. Zaman yapılandırmasını ayarlamak ve tahlil süresini ayarlamak için artı/eksi dokunmatik yüzeye basın.Tahlille ilgili doğru bilgilerin ekranda gösterilip gösterilmediğini kontrol edin ve gerekirse son ayarlamaları yapın. Testi başlatmak için başlat dokunmatik yüzeyine basın. Deneyin başında tek bip sesi duyulmalıdır.Deney sırasında, ışık ve kalan süre gibi ilerleme bilgileri ekranda gözlemlenebilir. PDT testi sırasında ön kapıyı açmayın veya herhangi bir konfigürasyonu değiştirmeyin. Tahlilin sonunda, dört bip sesi duyulmalıdır ve elektronik sistem tüm LED'leri kapatacaktır.Bitmiş bir mesaj ve deney sırasında genişleyen son enerji miktarı ekranda gözlemlenebilir. Akıcılık nihai değeri, vurgulanan denkleme göre hesaplanır. Işığa maruz kalan mikro plakayı örtün ve 24 saatlik inkübasyona devam edin.Kuluçka süresinden sonra, her iki plakadan da ortamı çıkarın, hücrelerin tek katmanını PBS ile yıkayın ve MTT çözeltisi ekleyin. Formazan kristallerinin oluşumuna izin vermek için her iki plakayı da karanlık ve aydınlık koşulları dört saat boyunca inkübe edin. MTT çözeltisini dikkatlice çıkarın ve mor kristalleri bir DMSO ve etanol çözeltisi ile çözün.Kristallerin tamamen çözünmesinden sonra, 595 nanometrede bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbans ölçümünü gerçekleştirin. Nihai ürün, üst iç yüzeyi 30 dağınık ışık yayan diyotlar, LED'ler seti ile donatılmış, görünür ışığın farklı spektrumlarını yaymak üzere programlanmış karanlık bir odadan oluşur. İç yüzeylerin düşük yansıtıcılığı ve LED konfigürasyonunun düzgün dağılımı nedeniyle homojen bir ışık insidansı tespit edilmiştir.Kurulum arayüzü kullanıcı dostudur ve yerleşmiş deneysel koşul yeniden üretilebilirdi. Kavramın bir kanıtı olarak, cihaz ışığa maruz kaldıktan sonra 2D HeLa hücre kültüründe Verteporfin'in sitotoksik etkisini arttırmak için kullanıldı. Şekilde gösterildiği gibi, GI50 değeri ışık durumu için 3.1 mikromolar idi.ve karanlık durum için 13.8 mikromolar Bu nedenle, koşulları karşılaştıran verimlilikte dört kattan fazla artış, Verteporfin'in bir fotosensitizör olarak kullanımını ve PhotoAct'in PDT tahlillerine uygulanabilirliğini doğrulamaktadır. Bu çalışmada açıklanan prototipin kullanımını doğrulamak için, fotosensitizör, hücreler ve akıcılık da dahil olmak üzere aynı deneysel koşullar altında ticari bir PDT cihazı kullanılmış ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Şekilde gösterildiği gibi, her iki cihaz da Verteporfin'i eşit şekilde fotoaktif hale getirerek sitotoksik etkiyi arttırır.Son olarak, ışığa maruz kaldıktan sonra Verteporfin tarafından tetiklenen ROS aracılı hücre ölümü, DCFDA testi kullanılarak akış sitometrisi ile doğrulandı. Özetle, cihaz toplam maliyeti 50'den az olan ticari olarak temin edilebilen düşük maliyetli bileşenlerle kolayca inşa edildi. Cihazın diğer başlıca avantajı arasında taşınabilirlik, düşük bakım talebi, birden fazla kültür plakası türünü ışınlama kapasitesi, tahlil başına dört üniteye kadar aynı anda kullanım, doğru ve tekrarlanabilir ışınlama, bilgisayarlara veya diğer makinelere bağlantı gerektirmeyen kullanıcı dostu ve basit kurulum arayüzü bulunmaktadır.Ek olarak, operasyon sırasında problemleri veya hataları bulmak ve düzeltmek için sistematik bir problem çözme yaklaşımı sağlamak için bir karar akış şeması sunulmaktadır. Bu bulgular, PhotoAct'in PDT'yi bilimsel araştırmalara kolaylaştırmak için faydalarını genişletmeye, fotosensitizörlerin etki mekanizmasını ve klinik uygulamalarını keşfetmeye izin vermektedir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...