קספאזות הן פרוטאזות ציסטאין שמבקעות מצעים במהלך אפופטוזיס ותהליכים לא אפופטוטיים. פרוטוקול זה מתאר בדיקת ביקוע במבחנה לזיהוי מצעים פוטטיביים של היזם caspase Dronc מדרוזופילה. אם עוקבים אחריו בזהירות, פרוטוקול זה מספק הליך אמין לסינון תפוקה גבוהה של מצעים פוטטיביים של ה- caspase Dronc, או כל קספאזה אחרת.
בעוד שפרוטוקול זה תוכנן עבור מבחני ביקוע במבחנה באמצעות Drosophila caspase Dronc, ניתן להתאים אותו בקלות לקספאזות מאורגניזמים אחרים, כולל יונקים. חשוב כי טיהור של caspases רקומביננטי ואת בדיקות מחשוף במבחנה מבוצעים באותו יום כי תכשירים caspase אלה לאבד פעילות אנזימטית במהירות. מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר פראתיבה יריקיפאטי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, להסיר את הצינורות הקפואים עם תרביות גלולה מ מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון ולשמור אותם על קרח במשך 10 דקות כדי לרכך את הכדור. לאחר 10 דקות, הוסיפו 0.6 מיליליטר של חיץ תזה של תאי חיידקים בתוספת מעכבי פרוטאז טריים שנוספו, 10 מיליגרם למיליליטר של ליזוזים, ו-50 יחידות למיליליטר של בנזונאז, לתוך הכדור המכיל צינורות באמצעות בקר פיפטה עם פיפטה סרולוגית של מיליליטר אחד. עם אותו קצה פיפטה, ממיסים את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שתמיסה צהובה בהירה וחיוורת, ללא חלקיקי כדוריות, נראית לעין ודוגרת במשך 30 דקות על קרח.
להעביר lysates לתוך צינורות צנטריפוגה מתאים צנטריפוגה אותם ב 17, 000 G במשך 40 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנאטנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, שהוא התמצית הגולמית המכילה את הקספאזות, ושומרים את הצינורות על קרח. הוסף 0.2 מיליליטר של 50% slurry של חומצה Ni-nitriloacetic agarose לכל צינור של תמציות caspase, ולסובב את הצינורות על סיבוב מקצה לקצה במשך שעה אחת ב 4 מעלות צלזיוס.
לאחר שעה אחת, מוסיפים את התמצית עם חומצה Ni-nitriloacetic agarose לעמודי פוליפרופילן מיליליטר אחד עם קצה שלם, ממוקם במתלה, ולתת לו לעמוד במשך חמש דקות כדי לאפשר חומצה Ni-nitriloacetic agarose לשקוע. לאחר חמש דקות, הסירו את מכסה העמודים, ותנו לסופר-נאטנט לזרום החוצה על ידי זרימת כוח הכבידה. לאחר מכן הוסיפו בזהירות מיליליטר אחד של חיץ הכביסה לעמודים מבלי להפריע לשרף הארוז של חומצה Ni-nitriloacetic, ושטפו אותו דרך זרימת הכבידה.
עבור elution של caspases, למקם צינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר מתחת לזרבובית איסוף של העמודים, לאחר ניקוז מלא של חיץ לשטוף. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של חיץ elution לכל עמודה ולאסוף את eluant בצינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר. שמור את האלואנטים על הקרח ומדוד את ריכוז החלבונים על ידי בדיקת ברדפורד.
בהתאם לרמת הביטוי של המצע putative, להשתמש 1 עד 10 microliters של ארנב reticulocyte lysate מתוכנת עם החלבון של עניין במבחן המחשוף ולשמור אותו על קרח. הוסיפו 10 מיקרוגרם של חלבון קספאז מטוהר שנוצר בעבר, והביאו את נפח התגובה הכולל ל-50 מיקרוליטרים עם מאגר בדיקת קספאז. לדגום את התגובות באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות, תוך הקפדה לכלול את הבקרות המתאימות בבדיקת המחשוף.
לאחר שלוש שעות, עצרו את התגובות על ידי העברת הצינורות על קרח, והוסיפו נפח אחד של מאגר דגימת LDS המכיל 50 מילימולר DTT. לדגום את הדגימות ב 75 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 10 דקות. סובב במהירות, ערבב על ידי הבהוב, טען 24 מיקרוליטרים לדגימה והפעל את דף ה- SDS או אחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס.
ארבעה קספאזות רקומביננטיות שונות הושרו, טוהרו ונותחו על ידי SDS-PAGE, חיסון, והכתם נבדק עם נוגדן אנטיהיסטידין. ה-6x-Histidine Dronc הלא מעובד פועל במשקל מולקולרי יחסי של 55 קילודלטון וה-6x-His DRICE הלא מעובד הוא בעל משקל מולקולרי של 35 קילו-דלטון. עיבוד אוטומטי של caspases גלוי על ידי המראה של להקות בעלות משקל מולקולרי קטן יותר.
עבור Dronc שסוע, זוהי רצועה של 40 קילודלטון. עבור Drice שסוע, זוהי רצועה של 23 קילודלטון. לאחר תגובת המחשוף במבחנה, החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE, אימונובלוט, והכתמים הודגמו עם נוגדן אנטי-Myc כדי לזהות Amino סופני Myc מתויג Drice C211A.
התוצאות הראו כי לתכשיר ה-6x-histidine Dronc המיוצר באופן חיידקי ומטוהר יש פעילות אנזימטית. ניתן לראות זאת על ידי נוכחותה של הלהקה הקטנה יותר של Drice השסוע בהשוואה ל- proDrice המנוקד. תגובת המחשוף במבחנה המשתמשת הן בקספאז רקומביננטי והן במצע נותחה על ידי SDS-PAGE ואימונובלוט.
לצורך ניתוח תגובת המחשוף, נעשה שימוש בנוגדן Drice נגד שסוע באימונובלוט זה. התוצאות הראו כי לתכשיר 6x-His Dronc המיוצר באופן חיידקי ומטוהר יש פעילות אנזימטית. ניתן לראות זאת על ידי נוכחותה של הלהקה הקטנה יותר של Drice השסוע בהשוואה ל- proDrice המדולד.
יש לזכור כי קספאזות רקומביננטיות מאבדות פעילות אנזימטית במהירות. הם לא יכולים להיות מאוחסנים, אפילו לא במינוס 80 מעלות צלזיוס. מבחני המחשוף במבחנה צריכים להתבצע באותו היום.
יש לאמת פגיעות חיוביות בבדיקת המחשוף במבחנה in vivo. זה יכול להיעשות בתאים או באורגניזמים מודל גנטי כגון Drosophila או C.elegans.
