Caspases는 세포 사멸 및 비 세포 사멸 과정에서 기질을 절단하는 시스테인 프로테아제입니다. 이 프로토콜은 초파리에서 개시제 카스파아제 Dronc의 추정 기질을 확인하기 위한 시험관내 절단 분석을 설명합니다. 주의 깊게 따를 경우, 이 프로토콜은 카스파아제 Dronc 또는 다른 카스파제의 추정 기질의 고처리량 스크리닝을 위한 신뢰할 수 있는 절차를 제공합니다.
이 프로토콜은 Drosophila 카스파아제 Dronc을 사용하는 시험관 내 절단 분석을 위해 설계되었지만 포유류를 포함한 다른 유기체의 카스파제에 쉽게 적용할 수 있습니다. 재조합 카스파아제의 정제와 시험관내 절단 분석은 이러한 카스파아제 제제가 효소 활성을 빠르게 상실하기 때문에 같은 날에 수행되는 것이 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원 인 Prathibha Yarikipati 박사가 될 것입니다.
시작하려면 펠렛 배양액이 있는 냉동 튜브를 섭씨 영하 80도 보관에서 제거하고 10분 동안 얼음 위에 두어 펠릿을 부드럽게 합니다. 10분 후, 새로 첨가된 프로테아제 억제제가 보충된 박테리아 세포 용해 완충액 0.6밀리리터, 리소자임 밀리리터당 10밀리그램, 벤조나제 밀리리터당 50단위를 1밀리리터 혈청학적 피펫이 있는 피펫 컨트롤러를 사용하여 펠릿이 포함된 튜브에 추가합니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 펠릿 입자가 없는 투명하고 옅은 노란색 용액이 보일 때까지 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 녹이고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
용해물을 적절한 원심 분리 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 40 분 동안 17, 000G에서 원심 분리합니다. 상청액을 카스파제를 포함하는 조추출물인 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 유지합니다. 카스파제 추출물의 각 튜브에 Ni-니트릴로아세트산 아가로스의 50% 슬러리 0.2밀리리터를 추가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 엔드 온 엔드 회전 장치에서 튜브를 회전시킵니다.
1 시간 후, Ni- 니트릴로 아세트산 아가 로스로 추출물을 팁이 손상되지 않은 폴리 프로필렌 컬럼 1 밀리리터에 넣고 랙에 넣고 Ni- 니트릴로 아세트산 아가 로스가 침전 될 수 있도록 5 분 동안 그대로 두십시오. 5분 후, 컬럼의 캡을 제거하고, 상청액이 중력 흐름에 의해 흘러나오도록 한다. 그런 다음 Ni-니트릴로아세트산 아가로스의 패킹된 수지를 방해하지 않고 컬럼에 세척 버퍼 1밀리리터를 조심스럽게 추가하고 중력 흐름을 통해 세척합니다.
카스파아제의 용리를 위해, 세척 완충액을 완전히 배출한 후, 컬럼의 수집 노즐 아래에 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브를 놓는다. 그런 다음 각 컬럼에 0.5ml의 용리 버퍼를 추가하고 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 용리액을 수집합니다. 용리액을 얼음 위에 보관하고 Bradford 분석으로 단백질 농도를 측정합니다.
추정 기질의 발현 수준에 따라, 절단 분석에서 관심 단백질로 프로그래밍된 토끼 망상적혈구 용해물 1 내지 10 마이크로리터를 사용하고 얼음 위에 보관한다. 이전에 생성된 정제된 카스파아제 단백질 10마이크로그램을 추가하고 카스파아제 분석 완충액으로 총 반응 부피를 50마이크로리터로 가져옵니다. 반응을 섭씨 30도의 수조에서 3시간 동안 배양하여 절단 분석에 적절한 대조군이 포함되도록 합니다.
3시간 후, 튜브를 얼음 위에 옮겨 반응을 중지시키고, 50 밀리몰 DTT를 함유하는 LDS 샘플 완충액 1 부피를 첨가한다. 샘플을 열 블록에서 섭씨 75도에서 10분 동안 배양합니다. 빠르게 회전하고, 튕겨서 혼합하고, 샘플당 24마이크로리터를 로드하고, SDS 페이지를 실행하거나 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.
4개의 상이한 재조합 카스파제를 SDS-PAGE에 의해 유도, 정제 및 분석하고, 면역블롯하고, 블롯을 항히스티딘 항체로 프로빙하였다. 처리되지 않은 6x- 히스티딘 Dronc는 55 킬로 달톤의 상대 분자량에서 실행되고 처리되지 않은 6x- His DICE는 35 킬로 달톤의 분자량을 갖는다. 카스파제의 자동 처리는 더 작은 분자량의 밴드의 출현으로 볼 수 있습니다.
쪼개진 Dronc의 경우 40킬로달톤의 밴드입니다. 쪼개진 Drice의 경우 23킬로달톤의 밴드입니다. 시험관내 절단 반응 후, 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 면역블롯하고, 블롯을 항-Myc 항체와 함께 배양하여 아미노 말단 Myc-태그된 Drice C211A를 검출하였다.
결과는 박테리아 생산 및 정제된 6x-히스티딘 Dronc 야생형 제제가 효소 활성을 갖는다는 것을 입증했습니다. 이것은 절단되지 않은 프로드라이스에 비해 더 작은 절단 Drice 밴드의 존재로 볼 수 있습니다. 재조합 카스파아제와 기질 모두를 사용하는 시험관내 절단 반응을 SDS-PAGE 및 면역블롯으로 분석하였다.
절단 반응의 분석을 위해, 항-절단된 Drice 항체를 이 면역블롯에 사용하였다. 결과는 박테리아로 생성 및 정제된 6x-His Dronc 제제가 효소 활성을 갖는다는 것을 입증했습니다. 이것은 절단되지 않은 proDrice에 비해 더 작은 절단 된 Drice의 존재로 볼 수 있습니다.
재조합 카스파제는 효소 활성을 빠르게 잃는다는 것을 기억하십시오. 섭씨 영하 80도에서도 보관할 수 없습니다. 체외 절단 분석은 같은 날에 수행해야 합니다.
시험관내 절단 분석에서 양성 히트는 생체내에서 검증되어야 한다. 이것은 세포 또는 초파리 또는 C.elegans와 같은 유전 모델 유기체에서 수행 할 수 있습니다.
