1.2K Views
•
08:16 min
•
October 6th, 2022
DOI :
October 6th, 2022
•0:04
Introduction
1:15
Small‐Scale Recombinant Caspases Extraction
2:34
Small‐Scale His‐Tagged Caspases Purification
4:09
In Vitro Cleavage Assay with Substrates Generated with RRL
5:29
Results: In Vitro Cleavage Assays to Express and Purify Recombinant Drosophila Caspases
7:33
Conclusion
Transcript
Caspases er cysteinproteaser som spalter substrater under apoptose og ikke-apoptotiske prosesser. Denne protokollen beskriver en in vitro spaltningsanalyse for å identifisere antatte substrater av initiatoren caspase Dronc fra Drosophila. Hvis den følges nøye, gir denne protokollen en pålitelig prosedyre for høy gjennomstrømningsscreening av antatte substrater av caspase Dronc, eller annen caspase.
Selv om denne protokollen er designet for in vitro spaltningsanalyser ved bruk av Drosophila caspase Dronc, kan den enkelt tilpasses for caspaser fra andre organismer, inkludert pattedyr. Det er viktig at rensingen av de rekombinante caspasene og in vitro-spaltningsanalysene utføres samme dag fordi disse caspasepreparatene mister enzymatisk aktivitet raskt. Demonstrere prosedyren vil være Dr.Prathibha Yarikipati, en postdoktor fra laboratoriet mitt.
For å begynne, fjern de frosne rørene med pelleterte kulturer fra minus 80 grader Celsius lagring og hold dem på is i 10 minutter for å myke pelleten. Etter 10 minutter, tilsett 0,6 ml bakteriell cellelysebuffer supplert med nytilsatte proteasehemmere, 10 milligram per milliliter lysozym og 50 enheter per milliliter Benzonase, inn i pelletsholdige rør ved hjelp av en pipettekontroller med en milliliter serologisk pipette. Oppløs pelleten med samme pipettespiss ved å pipettere opp og ned til en klar, svakt gul oppløsning, uten pelletspartikler, er synlig og ruge i 30 minutter på is.
Overfør lysater til passende sentrifugerør og sentrifuger dem ved 17.000 G i 40 minutter ved 4 grader Celsius. Overfør supernatantene til et 1, 5 milliliter mikrocentrifugerør, som er råekstraktet som inneholder caspasene, og hold rørene på is. Tilsett 0,2 milliliter av 50% oppslemming av Ni-nitriloeddiksyre agarose til hvert rør av caspase ekstrakter, og roter rørene på en ende-på-ende rotator i en time ved 4 grader Celsius.
Etter en time, legg ekstraktet med Ni-nitriloeddiksyre agarose til en milliliter polypropylenkolonner med en spiss intakt, plassert i et stativ, og la det stå i fem minutter for å la Ni-nitriloeddiksyre agarose å bosette seg. Etter fem minutter, fjern hetten på kolonnene, og la supernatanten strømme ut av tyngdekraften. Tilsett deretter forsiktig en milliliter av vaskebufferen til kolonnene uten å forstyrre den pakkede harpiksen av Ni-nitriloeddiksyre agarose, og vask den gjennom tyngdekraften.
For eluering av caspasene, plasser 1, 5 milliliter mikrocentrifugerør under kolonnens oppsamlingsdyse, etter fullstendig drenering av vaskebufferen. Deretter legger du til 0, 5 milliliter av elueringsbufferen til hver kolonne og samler eluanten i 1, 5 milliliter mikrocentrifugerør. Hold eluantene på is og mål konsentrasjonen av proteiner ved Bradford-analyse.
Avhengig av ekspresjonsnivået til det antatte substratet, bruk 1 til 10 mikroliter av kaninretikulocyttlysatet programmert med proteinet av interesse i spaltningsanalysen og hold det på is. Tilsett 10 mikrogram renset kaspaseprotein generert tidligere, og bring det totale reaksjonsvolumet til 50 mikroliter med caspase-analysebuffer. Inkuber reaksjonene i et vannbad ved 30 grader Celsius i tre timer, og sørg for å inkludere passende kontroller i spaltningsanalysen.
Etter tre timer, stopp reaksjonene ved å overføre rørene på is, og tilsett ett volum LDS-prøvebuffer som inneholder 50 millimolar DTT. Inkuber prøvene ved 75 grader Celsius i en varmeblokk i 10 minutter. Spinn raskt, bland ved å bla, last inn 24 mikroliter per prøve og kjør SDS-siden eller lagre prøvene ved minus 20 grader Celsius.
Fire forskjellige rekombinante caspaser ble indusert, renset og analysert ved SDS-PAGE, immunoblotted, og flekken ble undersøkt med et antihistidinantistoff. Den ubehandlede 6x-Histidine Dronc kjører med en relativ molekylvekt på 55 kilodalton og den ubehandlede 6x-His DRICE har en molekylvekt på 35 kilodalton. Automatisk behandling av caspasene er synlig ved utseendet av bånd med mindre molekylvekt.
For cleaved Dronc er det et bånd på 40 kilodalton. For cleaved Drice er det et bånd på 23 kilodalton. Etter in vitro-spaltningsreaksjonen ble proteinene separert av SDS-PAGE, immunoblottet, og flekkene ble inkubert med et anti-MYC-antistoff for å oppdage aminoterminalt Myc-merket Drice C211A.
Resultatene viste at det bakterielt produserte og rensede 6x-histidin Dronc villtypepreparatet har enzymatisk aktivitet. Dette er synlig ved tilstedeværelsen av det mindre båndet av spaltet Drice sammenlignet med uncleaved proDrice. Spaltningsreaksjonen in vitro som bruker både rekombinant caspase og substrat ble analysert med SDS-PAGE og immunblot.
For analyse av spaltningsreaksjonen ble det anti-spaltede Drice-antistoffet brukt i denne immunbloten. Resultatene viste at det bakterielt produserte og rensede 6x-His Dronc-preparatet har enzymatisk aktivitet. Dette er synlig ved tilstedeværelsen av det mindre båndet av spaltet Drice sammenlignet med den uberørte proDrice.
Husk at rekombinante caspases mister enzymatisk aktivitet raskt. De kan ikke lagres, ikke engang ved minus 80 grader Celsius. In vitro-spaltningsanalysene må utføres samme dag.
Positive treff i in vitro-spaltningsanalysen bør valideres in vivo. Dette kan gjøres i celler eller i genetiske modellorganismer som Drosophila eller C.elegans.
Her presenterer vi en protokoll for å uttrykke og rense rekombinante Drosophila caspases Dronc og Drice, og deres bruk i in vitro cleavage assays.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved