Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af finansiering fra Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 tildelt Health and Environmental Sciences Institute) og af finansiering fra National Institutes of Health (HL151094 til Dr. Geisse). Vi takker Dr. Alec S. T. Smith for hans hjælp med udarbejdelsen af dette manuskript.

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 150 (2013).</li><li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+density+on+the+maturation+and+contractile+ability+of+muscle+derived+cells+in+a+3D+tissue-engineered+skeletal+muscle+model+and+determination+of+the+cellular+and+mechanical+stimuli+required+for+the+synthesis+of+a+postural+phenotype.">The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype.</a> Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+skeletal+muscle+capable+of+functional+regeneration.">Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration.</a> BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10, 6918 (2020).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics.">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li><li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle.">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle &amp; Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+force+and+frequency+analysis+of+engineered+human+heart+tissue+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+using+magnetic+sensing.">Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing.</a> Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).</li><li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+real-time+monitoring+of+engineered+skeletal+muscle+function+using+magnetic+sensing.">High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing.</a> bioRxiv. , 492879 (2022).</li><li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thrombin-fibrinogen+interaction.">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li><li>Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin:+the+good,+the+bad+and+the+ugly+effect.">Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect.</a> Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).</li><li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+dysfunction+associated+with+a+nucleotide+polymerase+inhibitor+for+treatment+of+hepatitis+C.">Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C.</a> Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).</li><li>Gill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+cover:+Investigative+nonclinical+cardiovascular+safety+and+toxicology+studies+with+BMS-986094,+an+NS5b+RNA-dependent+RNA+polymerase+inhibitor.">From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor.</a> Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).</li><li>Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3-Butanedione+monoxime+(BDM)+as+a+myosin+inhibitor.">2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).</li><li>Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralysis+of+skeletal+muscle+by+butanedione+monoxime,+a+chemical+phosphatase.">Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+tissue+engineered+skeletal+muscle+in+vitro+is+dependent+on+the+inclusion+of+basement+membrane+proteins.">Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins.</a> Cytoskeleton. 76 (6), 371-382 (2019).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Alle forfattere er medarbejdere og kapitalejere i Curi Bio Inc., det firma, der kommercialiserer Mantarray-hardwaren og tilhørende software.

Denne undersøgelse beskriver metoder til generering af 3D-konstrueret hjerte- og skeletmuskelvæv i et 24-brønds forbrugsstof. Ved at følge disse metoder er det muligt konsekvent at opnå et komplet udvalg af 24 væv uden støbefejl til efterfølgende lægemiddelscreening. Kritiske overvejelser for at opnå et sådant resultat er at sikre, at alle trin under støbning udføres på is for at forhindre for tidlig polymerisation af hydrogelerne, fjernelse af celledissociationsreagens inden vævsstøbning, grundig blanding af celle- og hydrogelsuspensionen for hvert væv, udskiftning af pipettespidser mellem væv og anvendelse af varmeinaktiveret FBS (hvis det overhovedet anvendes). Det er også vigtigt at sikre, at stolpegitteret ikke flyttes, når støbningen starter og overføres forsigtigt, når hydrogeler er dannet.
Større ændringer omfatter brugen af forskellige celletyper til at opnå hjerte versus skeletale EMT'er og doping af hydrogeler med variable koncentrationer af kældermembranproteiner for at fremme cellulær modning og vævsstabilitet. De gavnlige virkninger af sådan doping skal testes fra sag til sag, men har vist sig at forbedre funktionelle resultater og vævets levetid under visse omstændigheder14,16,22. Det er også bemærkelsesværdigt, at de anførte celletætheder er vejledende og muligvis skal optimeres til forskellige cellelinjer. Alternative hydrogelsammensætninger kan også overvejes som et middel til at ændre de strukturelle og funktionelle egenskaber af de opnåede EMT'er23,24,25. Det indfødte muskelmikromiljø indeholder også understøttende celletyper til fremme af vaskularisering, innervering og matrixaflejring for at understøtte myocytter i form og funktion26,27. Mens systemet beskrevet her i øjeblikket inkorporerer fibroblaster i 3D-hjertevæv, kan yderligere celletyper skabe en mere fysiologisk relevant model til at studere sikkerheden og effekten af terapeutiske forbindelser in vitro. Tidligere er en række understøttende celletyper med succes blevet integreret i 3D-manipulerede væv, der præsenterer en spændende skabelon til fremtidig undersøgelse ved hjælp af den magnetiske sensing kontraktilitetsplatform28,29,30.
Fejlfinding for denne protokol centrerer sig om dannelsen af upålidelige eller inkonsekvente væv under støbeprocessen. Der skal udvises forsigtighed for at undgå bobledannelse i hydrogelerne, når de støbes, samtidig med at cellerne stadig lettes jævn fordeling under blanding. Optimeringseksperimenter vil sandsynligvis være nødvendige for hver ny celletype for at identificere ideelle celletætheder, celleforhold og matrixsammensætning.
En væsentlig begrænsning for denne teknik er det betydelige antal celler, der kræves for at etablere en fuld plade på 24 EMT'er. For de data, der præsenteres her, blev 15 millioner kardiomyocytter og 18 millioner skeletmyoblaster brugt pr. Plade. Visse forskere har muligvis ikke adgang til så store puljer af cellulært materiale, hvilket kan hæmme deres evne til at bruge denne platform i fuldt omfang. Hvis slutbrugerne ikke har adgang til magnetisk sensorhardware, skal målinger af efterbøjninger udføres optisk, hvilket reducerer gennemstrømningen betydeligt og forhindrer samtidig registrering af muskelsammentrækninger på tværs af flere brønde. Mantarray-hardwaren overvinder imidlertid disse begrænsninger for at tilbyde det første kommercielle system, der er i stand til kontinuerlig, ikke-invasiv analyse af EMT-sammentrækning samtidigt på tværs af flere konstruktioner.
Magnetisk sensing på tværs af 24 brønde letter langsgående undersøgelser af EMT-funktionel udvikling i realtid og muliggør nøjagtig måling af akutte reaktioner på kemisk, miljømæssig eller genetisk manipulation. Mens magnetisk sensing har flere fordele, såsom samtidig måling på tværs af flere væv, og ikke kræver kompliceret dataanalyse, muliggør optiske detektionsmetoder samtidig måling af fysiologiske målinger såsom calciumflux eller spændingskortlægning. Datasæt som dem, der er illustreret i resultatafsnittet, viser imidlertid bredden af applikationer, som denne teknologi har i lægemiddeludviklingsområdet. I betragtning af at få assays på markedet tilbyder midlerne til at udføre en direkte vurdering af kontraktil output i konstruerede muskler, har disse metoder potentialet til at revolutionere den prækliniske udviklingspipeline.

Inducerede pluripotente stamcellemodeller (iPSC) bliver i stigende grad nøgleaktører i den prækliniske pipeline for terapeutisk opdagelse og udvikling samt grundlæggende biologisk forskning og sygdomsmodellering 1,2,3,4,5. Kontraktilt væv, såsom hjerte- og skeletmuskulatur afledt af iPSC'er, har et stort potentiale for at forbedre den prædiktive effekt af humane in vitro-undersøgelser, da direkte vurdering af muskelkontraktil kraft og kinetik er kvantitative målinger til undersøgelse af den samlede vævsfunktion 4,6,7,8. Typisk er målinger af kontraktil kraft opnået enten indirekte ved optisk sporing af substratafbøjning 9,10 eller direkte ved fastgørelse af celler/væv til en krafttransducer4,11,12. Selvom disse metoder er nøjagtige, er de i sagens natur lave gennemløb og kræver typisk højt kvalificerede operatører til at indsamle og analysere data.
Tidligere arbejde har vist, at magnetfeltregistrering omgår disse forhindringer og giver en alternativ metode til at vurdere manipuleret muskelfunktion samtidigt på tværs af flere vævskonstruktioner13. Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bygger på denne teknologi ved hjælp af en enhed, der er i stand til at måle kontraktiliteten af konstruerede muskelvæv på en meget parallel måde, der udnytter kompleksiteten af 3D-cellulære modeller med screening med højere gennemstrømning14. Platformen muliggør etiketfri, kvantitativ, realtidsovervågning af kontraktil funktion i hjerte- og skeletmuskelvæv i eller uden for en standard cellekulturinkubator, hvilket eliminerer behovet for optisk baseret kontraktil billeddannelse og analyse. Denne teknologi letter direkte sammenligning af sunde og syge cellelinjer og muliggør måling af et lægemiddels virkning på kontraktilt væv, etablering af kvantificerbare, in vitro, sikkerheds- og effektivitetsdata for nye og eksisterende terapeutiske forbindelser.
Konstrueret 3D-muskelvæv kan fremstilles mellem to stolper på en meget reproducerbar måde ved hjælp af Mantarray-forbrugspladen, 24-brønds støbeplade (figur 1). Den ene stolpe er stiv, mens den anden stolpe er fleksibel og indeholder en lille magnet. Når vævskonstruktionen trækker sig sammen, fortrænger den den fleksible stolpe og den indlejrede magnet. EMT-pladen er placeret inde i instrumentet, og postforskydning måles via en række magnetiske sensorer på et printkort under pladeholderen. De målte ændringer i magnetfeltet omdannes til absolut kontraktil kraft ved hjælp af en matematisk algoritme. Instrumentet anvender hurtige dataprøvetagningshastigheder for at muliggøre indsamling af detaljerede oplysninger om funktionskapacitet og modenhed af den eller de celletyper, der analyseres, herunder sammentrækningsfrekvens, hastighed og henfaldstid. Disse funktionelle målinger kan opnås på tværs af alle 24 brønde samtidigt med den magnetiske sensorplatform eller individuelt og sekventielt ved hjælp af traditionelle optiske metoder.
Denne undersøgelse beskriver en meget reproducerbar metode til konstruktion af 3D-skeletmuskulatur og hjertemikrovæv i en fibrinbaseret hydrogel. Under en kort 80-minutters reaktion katalyserer thrombin omdannelsen af fibrinogen til fibrin, hvilket giver et stillads for muskelceller at udvikle sig i suspenderet kultur15. Stromaceller hjælper med at ombygge matrixen, og væv bliver kontraktile, da muskelceller danner et syncytium i hydrogelen. Kontraktiliteten af disse væv blev analyseret ved hjælp af den magnetiske sensing tilgang, både før og efter sammensat eksponering, validerer denne modalitet til brug i dosis-respons lægemiddelundersøgelser. Primære humane myoblaster fra en sund donorbiopsi blev opnået kommercielt og dyrket i 2D i henhold til sælgerens protokoller. Celler blev udvidet ved hjælp af et skeletmuskelvækstmedium gennem tre passager for at generere tilstrækkelige cellenumre til at fremstille 3D-væv. Stromaceller og hiPSC-afledte kardiomyocytter blev dyrket i henhold til sælgerens protokol i 3 dage for at muliggøre genopretning fra kryopræservering, før celler blev kastet i væv. Der gives repræsentative resultater, der illustrerer de typer datasæt, der kan indsamles ved hjælp af den magnetiske sensorplatform. Almindelige faldgruber forbundet med generering af manipuleret væv ved hjælp af disse metoder behandles også.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

Nøjagtig modellering af sunde og sygdomstilstande in vitro er afgørende for udviklingen af nye behandlingsstrategier og terapi. For hjerte- og skeletmuskelsygdomme udgør kontraktil kraft og kinetik nøglemålinger til vurdering af muskelfunktion. Nye og forbedrede metoder til generering af manipulerede muskelvæv (EMT'er) fra inducerede pluripotente stamceller har gjort in vitro-sygdomsmodellering mere pålidelig for kontraktilt væv; Imidlertid er reproducerbart fremstilling af væv fra suspenderede cellekulturer og måling af deres kontraktilitet udfordrende. Sådanne teknikker er ofte plaget af høje fejlrater og kræver kompleks instrumentering og tilpassede dataanalyserutiner. En ny platform og enhed, der bruger 3D EMT'er i forbindelse med en etiketfri, meget parallel og automatiseringsvenlig kontraktilitetsanalyse, omgår mange af disse forhindringer. Platformen muliggør let og reproducerbar fremstilling af 3D EMT'er ved hjælp af stort set enhver cellekilde. Vævskontraktilitet måles derefter via et instrument, der samtidig måler 24 væv uden behov for komplekse softwareanalyserutiner. Instrumentet kan pålideligt måle mikronewtonændringer i kraft, hvilket muliggør dosisafhængig sammensat screening for at måle effekten af et lægemiddel eller terapeutisk på kontraktil output. Konstruerede væv fremstillet med denne enhed er fuldt funktionelle, genererer træk og tetaniske sammentrækninger ved elektrisk stimulering og kan analyseres i længderetningen i kultur over uger eller måneder. Her viser vi data fra hjertemuskel-EMT'er under akut og kronisk dosering med kendte toksiske stoffer, herunder et lægemiddel (BMS-986094), der blev trukket fra kliniske forsøg efter patientdødsfald på grund af uventet kardiotoksicitet. Ændret skeletmuskelfunktion i manipuleret væv som reaktion på behandling med en myosinhæmmer præsenteres også. Denne platform gør det muligt for forskeren at integrere komplekse, informationsrige bioengineered modelsystemer i deres lægemiddelopdagelsesworkflow med minimal yderligere træning eller færdigheder, der kræves.

Celler blev støbt ind i manipuleret muskelvæv i 2-post forbrugsplade (figur 1). Succesfulde EMT'er vises ensartede, og matrixen fordeles jævnt mellem stillingerne (figur 2A). Matricen skal også vikles rundt om begge stolper og producere ækvivalente ankerpunkter for vævet. Fejl i støbning er sjældne med denne metode og er normalt indlysende med en visuel inspektion. Mislykket EMT-produktion kan variere fra katastrofale fejl, såsom vævsfrigørelse fra stolperne (figur 2B) til mere subtile strukturelle fejl, såsom luftbobler og løs fastgørelse til stolperne (figur 2C, D). Væv med mindre fejl kan stadig være levedygtige, men dataene fra disse væv bør undersøges omhyggeligt for at sikre, at de er sammenlignelige med kompromisløse EMT'er. For eksempel kan luftbobler i en EMT presses ud, når vævet komprimeres over tid, hvilket giver en fuldt funktionel konstruktion uden kontraktile mangler. Disse væv skal dog vurderes fra sag til sag, da luftboblernes placering kan påvirke funktionel genopretning. Luftbobler, der genereres ved stolperne, kan for eksempel påvirke vævsfastgørelse, hvilket kan hindre langsigtet overholdelse af stolpen.
Væv begynder at komprimere inden for de første 24 timer, da celler ombygger matrixen i hydrogelen (figur 3). Komprimering er en gradvis proces og fortsætter normalt i løbet af de første 2-4 uger af kulturen. Samlet set er vævskomprimering konsistent mellem tekniske og biologiske replikater (figur 4). Det er normalt, at nogle cellelinjer komprimerer matrixen mere end andre, da væv modnes over tid. Procentdelen af myogene celler i en konstruktion påvirker hastigheden og den samlede grad af EMT-komprimering. Det samlede myogene indhold for både hjerte- og skeletmuskelcellelinjer bør være over 80% for at minimere variation mellem manipuleret væv. Dette er især vigtigt, når man sammenligner kontraktile kræfter og kinetik på tværs af cellelinjer.
Inden for de første par dage efter støbning begynder kardiomyocytter spontant at slå i kultur og bøjer rytmisk den fleksible post med hver muskelkontraktion. Skeletmuskulaturkonstruktioner trækker sig sammen som reaktion på elektrisk stimulering på dag 7 efter start af differentiering. Feltstimulering blev anvendt på skeletmuskelvæv via en ekstern stimulator fastgjort til et brugerdefineret 24-brønds elektrodelåg. Låget, fremstillet med et par carbonelektroder til hver brønd, sidder oven på vævspladen med 24 brønde og stimulerer samtidig hver EMT til at fremkalde muskelsammentrækninger. Væv blev pacet ved hjælp af en 10 V stimulus for 10 ms pulsvarighed ved 1 Hz under funktionelle målinger. Kontraktile væv indikerer skeletmyoblaster, der er smeltet sammen og danner myorør komplet med funktionelle sarkomerer og kontraktile maskiner. Skelet-EMT'er pletter positivt for myosin tung kæde (MyHC) og dystrophin er lokaliseret til myorørmembranen og afslører en klassisk ringform i tværsnitsimmunohistokemisk analyse (figur 5). Når EMT'er er funktionelle, kan kontraktilitet måles dagligt i det magnetiske sensorinstrument, sporingskraft og kinetik, når konstruktionerne udvikler sig og modnes over tid. Både hjerte- og skeletmuskelvæv forbliver kontraktilt i uger til måneder i 3D-kultur (figur 6), og de kan bruges til en lang række kontraktilitetsundersøgelser.
Den magnetiske detektionsmetode kan bruges til samtidig at måle akutte og kroniske virkninger af strukturelle kardiotoksiske midler, såsom doxorubicin (figur 7) og BMS-986094 (figur 8) samt andre lægemidler, der påvirker muskelkontraktilitet. Optiske sporingsmetoder til sammentrækningsdetektion kan også bruges, men man skal være forsigtig, når man studerer akutte lægemiddeleffekter, da målinger skal tages sekventielt. Den forlængede levetid for hjerte- og skelet-EMT'er i 3D-kultur muliggør langsigtede lægemiddelundersøgelser i disse væv. Dette giver brugerne mulighed for at undersøge virkningerne af gentagen dosering, samt fortsat, langvarig eksponering for forbindelser, der kan vise kardiotoksiske virkninger over tid, som forekommer med doxorubicin. Doxorubicin (dox) er et kemoterapilægemiddelmod kræft 17. Mængden af lægemiddel administreret til patienter varierer afhængigt af typen af kræft, patientens alder, patientens højde og vægt samt andre faktorer. Af denne grund er det vigtigt at teste effekten af dox på tværs af en lang række koncentrationer og leveringsplaner. Her blev hjerte-EMT'er behandlet i løbet af 27 dage med tre separate koncentrationer (0,1 μM, 1 μM og 10 μM) dox (figur 7). Grupperne blev stratificeret yderligere ved at behandle EMT'er ved hver koncentration med enten en bolusbehandling eller kontinuerlig administration med en medium ændring hver 72 timer. Wells givet bolusbehandlinger af dox blev udsat for lægemidlet på tre separate tidspunkter, hvilket muliggjorde genopretning mellem dosering. De to højeste doser bolus og kontinuerlig eksponering viste en øjeblikkelig og langvarig ophør af kontraktil kraftgenerering gennem hele studiet. Den midterste og laveste koncentration havde varierende virkning på vævene afhængigt af administrationsmetoden. I den laveste koncentration af lægemidlet viste bolusgruppen ingen forskel fra kontrollerne. Imidlertid faldt kontraktil kraft efter 2 ugers kontinuerlig eksponering. Mellemklassekoncentrationen af lægemidlet havde en interessant effekt. Mens kontinuerlig dosering reducerede kraften i løbet af de første par dage af behandlingen og varede gennem hele eksperimentet, viste bolusgruppen en genopretning af kontraktil kraft tilbage til kontrolniveauer, når lægemidlet blev vasket ud efter 3 dage. Imidlertid forårsagede den anden bolus af lægemidlet en fuldstændig ophør af kraft efterfulgt af ingen bedring (figur 7), hvilket indikerer, at gentagen dosering ved denne koncentration kan have en kardiotoksisk virkning hos patienter behandlet med dette lægemiddel. Det brede omfang af denne undersøgelse, både i tid og eksperimentelle forhold, fremhæver nytten af 3D-manipulerede væv i toksicitetsscreening, da de forbliver kontraktile og reagerer på kemisk eksponering over længere perioder, hvilket giver mulighed for langsigtede lægemiddelundersøgelser inden for et enkelt sæt muskelvæv. Dette letter ikke kun identifikation af forbindelser, der kan have en kardiotoksisk virkning med kronisk eksponering, men også detektering af potentiel kardiotoksisk administrationstidspunkt.
In vitro toksicitetstest i manipuleret humant muskelvæv er en måde at hjælpe med at holde humane patienter sikre i kliniske forsøg. BMS-986094 er en nukleotidpolymerase (NS5B) hæmmer, der anvendes til behandling af hepatitis C. Lægemidlet var i klinisk fase II-udvikling, da Bristol-Myers Squibb ophørte med udviklingen på grund af flere tilfælde af uventet hjertesvigt hos patienter18,19. Her blev BMS-986094 anvendt på hjerte-EMT'er for at teste, om 3D-konstruerede muskelvæv ville udvikle en kardiotoksisk reaktion på lægemidlet (figur 8). Tre forskellige koncentrationer af lægemidlet blev påført, og væv blev overvåget over 13 dage. Kontraktil kraft faldt med tilsætning af lægemidlet på en dosisafhængig måde (figur 8A). Twitch-frekvensen blev også signifikant påvirket, da slaghastigheden faldt og til sidst stoppede som forventet med fortsat eksponering for den kardiotoksiske forbindelse (p < 0,05, figur 8B). Disse resultater viser, hvordan 3D-manipuleret humant muskelvæv kan bruges til at lette at bringe nye lægemidler på markedet og markere forbindelser, der i sidste ende fejler på grund af kardiotoksicitet. Desuden kan denne teknologi potentielt redde liv ved at afsløre farlige lægemidler, før de sættes i patienter i kliniske forsøg.
Evnen til at måle effekten af akutte og kronisk anvendte lægemidler på humant kontraktilt væv er et vigtigt første skridt, når man undersøger terapi for sikkerhed og effektivitet. Det er imidlertid vigtigt at vide, at koncentrationen af anvendte lægemidler er fysiologisk relevant og egnet til in vitro-test . Skeletmuskelvæv blev anvendt til at fastsætte en IC50-værdi for 2,3-butandionmonoxim (BDM) i en fuld dosis-responskurve. Dette lægemiddel er en velkarakteriseret ATPase-hæmmer af skeletmuskulatur myosin-II20. BDM hæmmer muskelsammentrækninger ved at forhindre dannelse af myosintværbro med actinfilamentet i sarkomerer21. Resultaterne vist her afslører et dosisafhængigt fald i absolut kraft, når lægemidlet påføres og fuldstændig genopretning af kontraktil kraft, når lægemidlet vaskes ud, hvilket indikerer, at den forbigående effekt forhindrer muskelsammentrækninger og ikke blot dræber celler i vævet (figur 9A). Desuden blev der målt en fuld dosis-responskurve på tværs af de syv undersøgte koncentrationer, hvilket etablerede en IC50 på 3,2 mM i disse humane mikrovæv (figur 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig01.jpg"> Figur 1: EMT-støbning i 2-stolpe-Mantarray-forbrugspladen med 24 brønde . (A) Myogene og stromale celler blev dyrket på 2D-overflader før vævsstøbning. (B) Celler løftes fra 2D-overflader og blandes sammen med ekstracellulære matrixproteiner for at danne hydrogeler i de enkelte pladestøbebrønde vist i indsatsen. C) plade med 24 brønde indeholdende manipuleret væv i hver brønd. (D) Repræsentativt væv, der viser afslappet og kontraheret konstrueret muskel, sammenligning af forskydning af magnetposten (grønne bjælker). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig02.jpg"> Figur 2: Vellykket og mislykket EMT-støbning . (A) Ideelt konstrueret muskelvæv 24 timer efter støbning ensartet komprimeret omkring stolperne med homogen celle/matrixsammensætning i hele vævet. (B) Mislykket EMT, der viser frigørelse af hydrogelen fra den fleksible stolpe. (C) EMT indeholdende luftbobler i hele vævet. (D) Ulige vævsaflejring omkring begge stillinger. Væv er løst forankret til den fleksible stolpe på den ene side. Vægtstænger er 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig03.jpg"> Figur 3: Komprimering i manipuleret muskelvæv over tid. (A) EMT-konstruktion vist 1 dag efter støbning. Væv overføres til differentieringsmedium, begyndende dag 0 af cellefusion og hydrogelkomprimering. (B-E) Den samme EMT på dag 7 til dag 21 viser en lidt kortere samlet længde mellem de to stolper over tid og mindre bredde målt gennem den midterste del af EMT. Vægtstænger er 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig04.jpg"> Figur 4: EMT-diameter over tid. Fire plader af væv blev sporet over 21 dage og sammenlignede EMT-diameter gennem komprimering. Hvert væv blev målt gennem midtersektionen hver uge ved hjælp af optisk mikroskopi. Tidspunkter viser ensartet EMT-størrelse mellem plader. Maksimal komprimering nås på dag 21, da matrixombygning stabiliseres. Tabellen viser standardafvigelsen (% af totalen) for komprimering inden for hver vævsplade og den gennemsnitlige afvigelse for alle plader. Farvede stænger er individuelle plader. Fejlbjælker er SD for EMT'er inden for plader. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig05.jpg"> Figur 5: Immunhistokemi af det konstruerede skeletmuskelvæv. EMT'er blev fastsat på dag 10 i kulturen og indlejret i paraffin. Tynde tværsnit (7 μm) blev farvet med antistoffer mod myosin tung kæde og dystrophin før billeddannelse. Grøn = MyHC, rød = Dystrofin, blå = DAPI. Objektiv forstørrelse er 40X; Skalabjælken er 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig06.jpg"> Figur 6: Kontraktil kraft i manipuleret muskelvæv over tid. (A) Gennemsnitlig absolut trækkraft målt fra hjerte-EMT'er fra dag 7 til dag 63 i kultur; n = 3 pr. gruppe. (B) Gennemsnitlig absolut trækkraft i skelet-EMT'er afledt af en primær cellelinje på dag 7 til dag 53 i kultur; n = 3. Fejlbjælker er SD for begge grafer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig07.jpg"> Figur 7: Akut og kronisk doxorubicinbehandling i det manipulerede muskelvæv. Tre separate dosiskoncentrationer af dox, 0,1 μM, 1 μM og 10 μM, blev leveret enten i bolus eller administreret kontinuerligt til manipuleret muskelvæv i løbet af 27 dage. Bolusdoser af lægemidlet blev tilføjet ved medieændringer på dag 0, 12 og 24, noteret af de grønne pile på X-aksen. Lægemidlet blev tilføjet til medierne ved hver medieændring til kontinuerlig dosering, bemærket af de sorte og grønne pile på X-aksen. Den procentvise ændring i kraft fra baselineværdier (præmedicinsk behandling) er på Y-aksen, og tiden i behandlingsdage er på X-aksen. Lys orange = DMSO kontinuerlig kontrol, mørk orange = DMSO boluskontrol, lysegrøn = 0,1 μM dox kontinuerlig, mørkegrøn = 0,1 μM dox bolus, lyseblå = 1 μM dox kontinuerlig, mørkeblå = 1 μM dox bolus, lysegul = 10 μM dox kontinuerlig, mørkegul = 10 μM dox bolus. Fejlbjælker er SD; n = 3 pr. betingelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig08.jpg"> Figur 8: Kronisk behandling med BMS-986094 i manipuleret muskelvæv. EMT'er blev behandlet med 0,4 μM (grøn), 2 μM (mørkeblå) og 10 μM (lyseblå) BMS-986094 over 13 dage. (A) Kontraktil trækkraft (Y-akse) falder ved alle lægemiddelkoncentrationer i de første 2 dage, mens kontrolvævene i DMSO fortsætter med at blive stærkere over tid (X-aksen). (B) Hjerterytmen eller trækfrekvensen ophører på en dosisafhængig måde i takt med ophør af kontraktil kraft vist i graf A. Kontrolvæv i DMSO (grå) opretholder en regelmæssig slaghastighed under hele eksperimentet. Fejlbjælker er SD; n = 3 pr. betingelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig09.jpg"> Figur 9: Dosisrespons på BDM i manipuleret skeletmuskelvæv . (A) Absolut trækkraft falder på en dosisafhængig måde, når primære celleafledte EMT'er udsættes for 2,3-butandionmonoxim (BDM) på dag 16 i 3D-kultur. Absolut trækkraft vender tilbage til nær baselineværdier, når lægemidlet vaskes ud. (B) Absolut trækkraft normaliseret til basislinjeværdier falder på en dosisafhængig måde, når den udsættes for BDM, hvilket giver en fuld dosis-responskurve og IC50-værdi ; n = 4 pr. dosis. Fejlbjælker er SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Denne protokol indeholder metoder til generering af 3D-manipuleret hjerte- og skeletmuskelvæv og beskriver deres anvendelse i prækliniske lægemiddelscreeningsmetoder. De beskrevne metoder anvender et magnetisk sensorsystem til at lette den samtidige vurdering af 24 væv parallelt.

Præklinisk lægemiddeltest i skalerbart 3D-konstrueret muskelvæv

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Vores platform bruger 3D-konstrueret muskelvæv og magnetisk sensorhardware til at måle kontraktilitet på tværs af 24 brønde samtidigt. Dette giver en højere gennemstrømningsmetode til vurdering af nye lægemidler in vitro ved hjælp af humant muskelvæv. Vores støbemetode forbedrer konsistensen og reproducerbarheden ved fremstilling af 3D-manipuleret muskelvæv.Vi har designet en forbrugsvare 24-brønds støbeplade udstyret med magnetisk sensorhardware til kontraktilitetsmålinger og analyse på vores platform. Denne metode kan give værdifuld indsigt i in vitro sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og genterapi for enhver muskelsygdom, der påvirker kontraktilitet. Vi inkorporerer i øjeblikket motorneuroner i vores 3D-konstruktioner for også at skabe en neuromuskulær krydsmodel.Til at begynde med skal du placere et forkølet vævsstøbesæt på en kold blok eller is inde i cellekulturhætten. Læg støbepladen fladt på is. Tilsæt thrombin til basismediet for at fremstille thrombinopløsningen, og flyt stolpegitteret fra støbepladen til en ny steril plade med 24 brønde.Pipette 50 mikroliter trombinopløsning i hver forkølet brønd på støbepladen, og læg gitteret tilbage på sættet. Sæt støbesættet til side på is. Derefter tilsættes 500 ml RPMI-medium, 10 ml B27 og 2,5 gram aminocapronsyre eller ACA for at forberede hjerte-EMT-mediet.Tag EMT-mediet ud, der skal bruges til at støbe vævene, og tilsæt 10 mikromolær ROCK-hæmmer til det. Forbered skelet-EMT-mediet ved at tilsætte 50 ml F10-medium og 0,25 gram aminocapronsyre eller ACA til primære myoblaster. Brug 0,1 gram ACA til IPSC-afledte myoblaster.Derefter filtreres støbemediet indeholdende ACA sterilt. Opvarm cellekulturens dissociationsreagens og et lige volumen EMT-medium til 37 grader Celsius. Dette opvarmede EMT-medium vil blive brugt til at fortynde dissociationsreagenset.Vask cellerne med PBS og tilsæt det opvarmede dissociationsreagens for at løfte cellerne. Inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter, eller indtil cellerne har løftet sig, og kontroller kulturerne hvert andet til tredje minut ved at banke på siden af pladen. Når cellerne er løftet, skal du overføre dem til et 50 ml konisk rør.Triturat med en P-1000 pipette for at sikre en enkeltcellesuspension. Vask pladen og kolben med et ekstra EMT-medium for at samle de resterende celler og tilsæt dem til det koniske rør. Triturer igen cellerne for at sikre en enkelt cellesuspension.Tilføj EMT-medium for at afslutte dissociationsprocessen, og tag derefter prøver af cellesuspensionerne til celletællinger. Udfør celletællinger ved hjælp af en automatiseret celletæller eller et hæmocytometer i trypanblåt. Centrifuger cellerne ved 200 G i fire minutter, aspirer supernatanten, og genopslæm cellerne i fem ml EMT-basemedium for at fjerne det resterende dissociationsreagens.Efter centrifugering igen i fire minutter aspireres supernatanten, og cellesuspensionerne fremstilles ved passende densiteter. Beregn volumenerne af hver celleopløsning, der kræves for at udgøre det ønskede antal væv, og pipette de beregnede volumener af celler i et 15 ml konisk rør. Tilsæt 10 mikroliter fibrinogen pr. EMT til cellesuspensionen og læg den på is.Sørg for, at hver EMT har 90 mikroliter cellesuspension, 10 mikroliter fibrinogen og 50 mikroliter trombinopløsning i den endelige vævskonstruktion. I en cellekulturhætte skal du fjerne låget på vævsstøbesættet og placere støbepladen med stolpegitteret liggende fladt på isen. Bland cellefibrinogenblandingen og træk 100 mikroliter op med en P-200-pipette.Tilsæt 100 mikroliter af blandingen til brønde fremstillet med 50 mikroliter trombinopløsning og triturer fem gange for at blande godt. Skub ikke pipetten forbi det første stop, og fjern spidsen efter triturering for at undgå at skabe bobler. Bland cellesuspensionen i det koniske rør, før du støber hvert væv.Hold både gitteret og støbebrøndpladen samtidigt ved hjælp af pegefingeren og tommelfingeren på den ene hånd for at undgå bevægelse af gitteret, eller lad pladen ligge fladt på is og rokk isspanden for at se ind i støbepladen. Gentag med en frisk P-200-spids for hvert væv, indtil alt væv er støbt. Overfør forsigtigt det frøede kit til inkubatoren og inkuber ved 37 grader Celsius i 80 minutter.Forbered derefter en frisk 24-brøndplade med to milliliter pr. Brønd i EMT-mediet til hjertevæv og inkuber pladen ved 37 grader Celsius for at opvarme mediet. Efter 80 minutters inkubation tilsættes forsigtigt en milliliter EMT-medium til kanten af støbebrøndene og inkuberes i yderligere 10 minutter ved 37 grader Celsius. Efter 10 minutters inkubation løftes forsigtigt postgitteret og overføres vævene fra støbepladen til en forberedt 24-brøndplade med det opvarmede medium.Endelig returneres pladerne med væv til cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius. Mislykket EMT-produktion kan variere fra katastrofale fejl såsom vævsfrigørelse fra stolperne til mere subtile strukturelle fejl såsom luftbobler og ulige vævsaflejring omkring begge stillinger. EMT-konstruktion en dag efter støbning er vist her.Skeletmuskelvæv blev overført til et differentieringsmedium begyndende dag nul af cellefusion og hydrogelkomprimering. Fra dag syv til dag 28 viste den samme EMT en lidt kortere samlet længde mellem de to stolper og en mindre bredde målt gennem den midterste del af EMT. Fire plader af væv blev sporet over 21 dage og sammenlignede EMT-diameter under komprimering.Tidspunkter viser ensartet EMT-størrelse mellem plader. Maksimal komprimering nås på dag 21, da matrixombygning stabiliseres. EMT'ernes immunhistokemi er afbildet her.EMT'er blev fastsat på dag 10 i kulturen og indlejret i paraffin. Tynde tværsnit blev farvet med antistoffer mod myosin tung kæde og dystrophin før billeddannelse. Disse grafiske billeder repræsenterer den gennemsnitlige absolutte trækkraft målt fra hjerte-EMT'erne og skelet-EMT'erne over tid.Akut og kronisk doxorubicinbehandling i manipuleret hjertevæv er vist her. Tre forskellige dosiskoncentrationer af Dox blev leveret enten i bolus eller administreret kontinuerligt til manipuleret hjertevæv i løbet af 27 dage. Dosisresponset på BDM i manipuleret skeletmuskelvæv er vist i denne figur.Hjerterytmen eller rykfrekvensen ophører på en dosisafhængig måde sammen med ophør af kontraktil kraft, der indikerer kardiotoksicitet, når EMT'er udsættes for denne forbindelse. De vigtigste ting at huske, når du støber væv, er at holde alt koldt hele tiden, inklusive din cellesuspension og reagenser og at holde postgitteret helt stille, når støbningen begynder.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering og potentielle anvendelse af en 3D-Tissue-manipuleret humant Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Udviklet 3D Silke-collagen-baserede model for polariseret nervevæv

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Udviklet vaskulariserede Muskel Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En kombineret 3D manipuleret væv<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lunge Tumor Model for Forudsigelse Drug Effektivitet i specifikke mutations baggrunde

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

anvendelser af<em&gt; In vivo</em&gt; Funktionel Test af Rat tibialis anterior for Evaluering manipuleret væv Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Biomekanisk karakterisering af menneskelige bløddele Brug Indrykning og trækprøvning

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiseret Sammentrækning Analyse af humant Engineered Heart Væv til Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardiseret og skalerbar analyse til undersøgelse af Perfuserende 3D Angiogen spiring af iPSC-afledte endotelceller in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...