Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van de Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 toegekend aan het Health and Environmental Sciences Institute) en door financiering van de National Institutes of Health (HL151094 aan Dr. Geisse). Wij danken Dr. Alec S. T. Smith voor zijn hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 150 (2013).</li><li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+density+on+the+maturation+and+contractile+ability+of+muscle+derived+cells+in+a+3D+tissue-engineered+skeletal+muscle+model+and+determination+of+the+cellular+and+mechanical+stimuli+required+for+the+synthesis+of+a+postural+phenotype.">The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype.</a> Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+skeletal+muscle+capable+of+functional+regeneration.">Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration.</a> BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10, 6918 (2020).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics.">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li><li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle.">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle &amp; Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+force+and+frequency+analysis+of+engineered+human+heart+tissue+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+using+magnetic+sensing.">Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing.</a> Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).</li><li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+real-time+monitoring+of+engineered+skeletal+muscle+function+using+magnetic+sensing.">High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing.</a> bioRxiv. , 492879 (2022).</li><li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thrombin-fibrinogen+interaction.">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li><li>Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin:+the+good,+the+bad+and+the+ugly+effect.">Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect.</a> Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).</li><li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+dysfunction+associated+with+a+nucleotide+polymerase+inhibitor+for+treatment+of+hepatitis+C.">Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C.</a> Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).</li><li>Gill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+cover:+Investigative+nonclinical+cardiovascular+safety+and+toxicology+studies+with+BMS-986094,+an+NS5b+RNA-dependent+RNA+polymerase+inhibitor.">From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor.</a> Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).</li><li>Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3-Butanedione+monoxime+(BDM)+as+a+myosin+inhibitor.">2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).</li><li>Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralysis+of+skeletal+muscle+by+butanedione+monoxime,+a+chemical+phosphatase.">Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+tissue+engineered+skeletal+muscle+in+vitro+is+dependent+on+the+inclusion+of+basement+membrane+proteins.">Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins.</a> Cytoskeleton. 76 (6), 371-382 (2019).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Alle auteurs zijn werknemers en aandeelhouders in Curi Bio Inc., het bedrijf dat de Mantarray-hardware en bijbehorende software commercialiseert.

Deze studie beschrijft methoden voor het genereren van 3D-gemanipuleerde hart- en skeletspierweefsels in een 24-well verbruiksmateriaal gietset. Door deze methoden te volgen, is het mogelijk om consequent een complete reeks van 24 weefsels te bereiken zonder gietfouten voor daaropvolgende medicijnscreening. Kritische overwegingen voor het bereiken van een dergelijk resultaat zijn ervoor te zorgen dat tijdens het gieten alle stappen op ijs worden uitgevoerd om voortijdige polymerisatie van de hydrogels te voorkomen, verwijdering van celdissociatie-reagens voorafgaand aan weefselgieten, grondige menging van de cel en hydrogelsuspensie voor elk weefsel, vervanging van pipetpunten tussen weefsels en het gebruik van warmte-geïnactiveerde FBS (indien gebruikt). Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat het paalrooster niet wordt verplaatst zodra het gieten begint en voorzichtig wordt overgebracht zodra hydrogels zijn gevormd.
Belangrijke wijzigingen omvatten het gebruik van verschillende celtypen om cardiale versus skeletale EMT's te bereiken en de doping van hydrogels met variabele concentraties van keldermembraaneiwitten om cellulaire rijping en weefselstabiliteit te bevorderen. De gunstige effecten van dergelijke doping moeten van geval tot geval worden getest, maar het is aangetoond dat het de functionele uitkomsten en de levensduur van het weefsel onder bepaalde omstandigheden verbetert14,16,22. Het is ook opmerkelijk dat de vermelde celdichtheden een gids zijn en mogelijk moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen. Alternatieve hydrogelsamenstellingen kunnen ook worden beschouwd als een middel om de structurele en functionele eigenschappen van de bereikte EMT'ste wijzigen 23,24,25. De inheemse spiermicro-omgeving bevat ook ondersteunende celtypen om vascularisatie, innervatie en matrixafzetting te bevorderen om myocyten in vorm en functie te ondersteunen26,27. Hoewel het hier beschreven systeem momenteel fibroblasten in 3D-hartweefsels bevat, kunnen extra celtypen een meer fysiologisch relevant model creëren om de veiligheid en werkzaamheid van therapeutische verbindingen in vitro te bestuderen. Eerder zijn een reeks ondersteunende celtypen met succes geïntegreerd in 3D-gemanipuleerde weefsels die een opwindende sjabloon vormen voor toekomstig onderzoek met behulp van het magnetische detectiecontractiliteitsplatform28,29,30.
Probleemoplossing voor dit protocol richt zich op de vorming van onbetrouwbare of inconsistente weefsels tijdens het gietproces. Er moet voor worden gezorgd dat bubbelvorming in de hydrogels wordt voorkomen terwijl ze worden gegoten, terwijl de gelijkmatige verdeling van de cellen tijdens het mengen wordt vergemakkelijkt. Optimalisatie-experimenten zullen waarschijnlijk nodig zijn voor elk nieuw celtype om ideale celdichtheden, celverhoudingen en matrixsamenstelling te identificeren.
Een belangrijke beperking voor deze techniek is het aanzienlijke aantal cellen dat nodig is om een volledige plaat van 24 EMT's te vormen. Voor de hier gepresenteerde gegevens werden 15 miljoen cardiomyocyten en 18 miljoen skeletmyoblasten per plaat gebruikt. Bepaalde onderzoekers hebben mogelijk geen toegang tot dergelijke grote pools celmateriaal, wat hun vermogen om dit platform ten volle te gebruiken kan belemmeren. Als eindgebruikers geen toegang hebben tot magnetische detectiehardware, moeten metingen van postafbuigingen optisch worden uitgevoerd, wat de doorvoer aanzienlijk vermindert en de gelijktijdige registratie van spiercontracties over meerdere putten voorkomt. De Mantarray-hardware overwint deze beperkingen echter om het eerste commerciële systeem te bieden dat in staat is tot continue, niet-invasieve analyse van EMT-contractie tegelijkertijd over meerdere constructies.
Magnetische detectie in 24 putten vergemakkelijkt longitudinale studies van EMT-functionele ontwikkeling in realtime en maakt nauwkeurige meting van acute reacties op chemische, milieu- of genetische manipulatie mogelijk. Hoewel magnetische detectie verschillende voordelen heeft, zoals gelijktijdige meting over meerdere weefsels, en geen ingewikkelde gegevensanalyse vereist, maken optische detectiemethoden gelijktijdige meting van fysiologische metrieken mogelijk, zoals calciumflux of spanningskartering. Datasets zoals die in de resultatensectie worden geïllustreerd, tonen echter de breedte van de toepassingen die deze technologie heeft in de ontwikkelingsruimte van geneesmiddelen. Gezien het feit dat weinig testen op de markt de middelen bieden om een directe beoordeling van contractiele output in engineered muscle uit te voeren, hebben deze methoden het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de preklinische ontwikkelingspijplijn.

Geïnduceerde pluripotente stamcelmodellen (iPSC) worden steeds meer belangrijke spelers in de preklinische pijplijn voor therapeutische ontdekking en ontwikkeling, evenals fundamenteel biologisch onderzoek en ziektemodellering 1,2,3,4,5. Contractiele weefsels, zoals hart- en skeletspieren afgeleid van iPSC's, hebben een groot potentieel voor het verbeteren van de voorspellende kracht van menselijke in vitro studies, aangezien directe beoordeling van spiercontractiele kracht en kinetiek kwantitatieve maatstaven zijn om de algehele weefselfunctie te bestuderen 4,6,7,8. Doorgaans zijn metingen van contractiele kracht verkregen hetzij indirect door optische tracking van substraatafbuiging 9,10, hetzij direct door bevestiging van cellen/weefsels aan een krachtopnemer4,11,12. Deze methoden, hoewel nauwkeurig, hebben inherent een lage doorvoer en vereisen meestal zeer bekwame operators om gegevens te verzamelen en te analyseren.
Eerder werk heeft aangetoond dat magnetische velddetectie deze obstakels omzeilt en een alternatieve methode biedt om de gemanipuleerde spierfunctie tegelijkertijd over meerdere weefselconstructies te beoordelen13. Het Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bouwt voort op deze technologie met behulp van een apparaat dat in staat is om de contractiliteit van gemanipuleerde spierweefsels op een zeer parallelle manier te meten die gebruik maakt van de complexiteit van 3D-cellulaire modellen met screening met hogere doorvoer14. Het platform maakt labelvrije, kwantitatieve, real-time monitoring van de contractiele functie in hart- en skeletspierweefsels in of buiten een standaard celkweekincubator mogelijk, waardoor de noodzaak voor optische contractiele beeldvorming en analyse wordt geëlimineerd. Deze technologie vergemakkelijkt directe vergelijking van gezonde en zieke cellijnen en maakt het mogelijk om het effect van een geneesmiddel op contractiele weefsels te meten, waarbij kwantificeerbare, in vitro, veiligheids- en werkzaamheidsgegevens voor nieuwe en bestaande therapeutische verbindingen worden vastgesteld.
Gemanipuleerde 3D-spierweefsels kunnen op een zeer reproduceerbare manier tussen twee palen worden vervaardigd met behulp van de Mantarray-verbruikstoevoegplaat met 24 putten (figuur 1). De ene paal is stijf, terwijl de andere paal flexibel is en een kleine magneet bevat. Wanneer het weefselconstruct samentrekt, verplaatst het de flexibele paal en de ingebedde magneet. De EMT-plaat wordt in het instrument geplaatst en de postverplaatsing wordt gemeten via een reeks magnetische sensoren op een printplaat onder de plaathouder. De gemeten veranderingen in het magnetisch veld worden met behulp van een wiskundig algoritme omgezet in absolute contractiele kracht. Het instrument maakt gebruik van snelle gegevensbemonsteringssnelheden om gedetailleerde informatie te verzamelen over de functionele capaciteit en volwassenheid van het (de) celtype (en) dat wordt getest, inclusief contractiefrequentie, snelheid en vervaltijd. Deze functionele metingen kunnen worden verkregen over alle 24 putten tegelijkertijd met het magnetische detectieplatform of individueel en sequentieel met behulp van traditionele optische methoden.
Deze studie beschrijft een zeer reproduceerbare methode voor het engineeren van 3D-skeletspieren en hartmicrotweefsels in een op fibrine gebaseerde hydrogel. Tijdens een korte reactie van 80 minuten katalyseert trombine de omzetting van fibrinogeen in fibrine, waardoor spiercellen zich kunnen ontwikkelen in gesuspendeerde cultuur15. Stromale cellen helpen de matrix te hermodelleren en weefsels worden contractiel omdat spiercellen een syncytium vormen in de hydrogel. De contractiliteit van deze weefsels werd geanalyseerd met behulp van de magnetische detectiebenadering, zowel voor als na blootstelling aan verbindingen, waarbij deze modaliteit werd gevalideerd voor gebruik in dosis-respons geneesmiddelenstudies. Primaire menselijke myoblasten van een gezonde donorbiopsie werden commercieel verkregen en gekweekt in 2D volgens de protocollen van de leverancier. Cellen werden uitgebreid met behulp van een skeletspiergroeimedium door drie passages om voldoende celaantallen te genereren om 3D-weefsels te fabriceren. Stromale cellen en hiPSC-afgeleide cardiomyocyten werden gedurende 3 dagen gekweekt volgens het protocol van de leverancier om herstel van cryopreservatie mogelijk te maken voordat cellen in weefsels werden gegoten. Er worden representatieve resultaten verstrekt die de soorten datasets illustreren die kunnen worden verzameld met behulp van het magnetische detectieplatform. Veel voorkomende valkuilen in verband met het genereren van gemanipuleerde weefsels met behulp van deze methoden worden ook aangepakt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

Het nauwkeurig modelleren van gezonde en ziekteomstandigheden in vitro is van vitaal belang voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën en therapeutica. Voor hart- en skeletspierziekten vormen contractiele kracht en kinetiek belangrijke maatstaven voor het beoordelen van de spierfunctie. Nieuwe en verbeterde methoden voor het genereren van gemanipuleerde spierweefsels (EMT's) uit geïnduceerde pluripotente stamcellen hebben in vitro ziektemodellering betrouwbaarder gemaakt voor contractiele weefsels; Het reproduceerbaar fabriceren van weefsels uit gesuspendeerde celculturen en het meten van hun contractiliteit is echter een uitdaging. Dergelijke technieken worden vaak geplaagd door hoge uitvalpercentages en vereisen complexe instrumentatie en aangepaste data-analyseroutines. Een nieuw platform en apparaat dat 3D EMT's gebruikt in combinatie met een labelvrije, zeer parallelle en automatiseringsvriendelijke contractiliteitstest omzeilt veel van deze obstakels. Het platform maakt eenvoudige en reproduceerbare fabricage van 3D-EMT's mogelijk met behulp van vrijwel elke celbron. Weefselcontractiliteit wordt vervolgens gemeten via een instrument dat tegelijkertijd 24 weefsels meet zonder dat complexe software-analyseroutines nodig zijn. Het instrument kan op betrouwbare wijze micronewtonveranderingen in kracht meten, waardoor dosisafhankelijke samengestelde screening mogelijk is om het effect van een geneesmiddel of therapeutisch middel op de contractiele output te meten. Gemanipuleerde weefsels gemaakt met dit apparaat zijn volledig functioneel, genereren spiertrekkingen en tetanische contracties bij elektrische stimulatie en kunnen longitudinaal in cultuur gedurende weken of maanden worden geanalyseerd. Hier tonen we gegevens van hartspier-EMT's onder acute en chronische dosering met bekende toxische stoffen, waaronder een medicijn (BMS-986094) dat uit klinische onderzoeken werd gehaald na sterfgevallen bij patiënten als gevolg van onverwachte cardiotoxiciteit. Veranderde skeletspierfunctie in gemanipuleerde weefsels als reactie op behandeling met een myosineremmer wordt ook gepresenteerd. Dit platform stelt de onderzoeker in staat om complexe, informatierijke bio-engineered modelsystemen te integreren in hun workflow voor het ontdekken van geneesmiddelen met minimale aanvullende training of vereiste vaardigheden.

Cellen werden gegoten in gemanipuleerde spierweefsels in de 2-post verbruiksplaat (figuur 1). Succesvolle EMT's zullen uniform lijken en de matrix zal gelijkmatig over de posten worden verdeeld (figuur 2A). De matrix moet zich ook om beide palen wikkelen, waardoor gelijkwaardige ankerpunten voor het weefsel worden geproduceerd. Fouten in het gieten zijn zeldzaam met deze methode en zijn meestal duidelijk bij een visuele inspectie. Mislukte EMT-productie kan variëren van catastrofale storingen, zoals weefselloslating van de palen (figuur 2B) tot meer subtiele structurele gebreken, zoals luchtbellen en losse bevestiging aan de palen (figuur 2C, D). Weefsels met kleine gebreken kunnen nog steeds levensvatbaar zijn, maar de gegevens van deze weefsels moeten zorgvuldig worden onderzocht om ervoor te zorgen dat deze vergelijkbaar zijn met compromisloze EMT's. Luchtbellen in een EMT kunnen bijvoorbeeld worden uitgeknepen als het weefsel in de loop van de tijd compacter wordt, waardoor een volledig functionele constructie ontstaat zonder contractiele tekortkomingen. Deze weefsels moeten echter van geval tot geval worden beoordeeld, omdat de locatie van de luchtbellen het functionele herstel kan beïnvloeden. Luchtbellen die bij de palen worden gegenereerd, kunnen bijvoorbeeld de weefselaanhechting beïnvloeden, wat de langdurige hechting aan de paal kan belemmeren.
Weefsels beginnen binnen de eerste 24 uur te verdichten als cellen de matrix in de hydrogel hermodelleren (figuur 3). Verdichting is een geleidelijk proces en verloopt meestal gedurende de eerste 2-4 weken van de cultuur. Over het algemeen is weefselverdichting consistent tussen technische en biologische replicaties (figuur 4). Het is normaal dat sommige cellijnen de matrix meer verdichten dan andere, omdat weefsels in de loop van de tijd rijpen. Het percentage myogene cellen binnen een construct beïnvloedt de snelheid en de algehele mate van EMT-verdichting. Het totale myogene gehalte voor zowel hart- als skeletspiercellijnen moet hoger zijn dan 80% om variatie tussen gemanipuleerde weefsels te minimaliseren. Dit is vooral belangrijk bij het vergelijken van contractiele krachten en kinetiek over cellijnen heen.
Binnen de eerste paar dagen na het gieten beginnen cardiomyocyten spontaan in cultuur te kloppen, waarbij de flexibele paal ritmisch wordt gebogen bij elke spiercontractie. Skeletspierconstructies trekken samen als reactie op elektrische stimulatie op dag 7 na het starten van differentiatie. Veldstimulatie werd toegepast op skeletspierweefsels via een externe stimulator bevestigd aan een aangepast 24-well elektrodedeksel. Het deksel, vervaardigd met een paar koolstofelektroden voor elke put, zit bovenop de 24-putplaat van weefsels en stimuleert tegelijkertijd elke EMT om spiercontracties op te wekken. Weefsels werden getemporiseerd met behulp van een 10 V-stimulus gedurende 10 ms pulsduur bij 1 Hz tijdens functionele metingen. Contractiele weefsels duiden op skeletmyoblasten die zijn gefuseerd en myotubes vormen, compleet met functionele sarcomeren en contractiele machines. Skelet-EMT's kleuren positief voor myosine zware keten (MyHC) en dystrofine is gelokaliseerd op het myotube-membraan en onthult een klassieke ringvorm in cross-sectionele immunohistochemische analyse (figuur 5). Zodra EMT's functioneel zijn, kan contractiliteit dagelijks worden gemeten in het magnetische detectie-instrument, waarbij de kracht en kinetiek worden gevolgd naarmate de constructen zich ontwikkelen en rijpen in de loop van de tijd. Zowel hart- als skeletspierweefsel blijven weken tot maanden contractiel in 3D-cultuur (figuur 6) en kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan contractiliteitsstudies.
De magnetische detectiebenadering kan worden gebruikt om tegelijkertijd acute en chronische effecten van structurele cardiotoxische stoffen te meten, zoals doxorubicine (figuur 7) en BMS-986094 (figuur 8), evenals andere geneesmiddelen die de spiercontractiliteit beïnvloeden. Optische trackingmethoden voor contractiedetectie kunnen ook worden gebruikt, maar voorzichtigheid is geboden bij het bestuderen van acute medicijneffecten, omdat metingen sequentieel moeten worden uitgevoerd. De verlengde levensduur van cardiale en skeletale EMT's in 3D-cultuur maakt langdurige geneesmiddelenstudies in deze weefsels mogelijk. Dit stelt gebruikers in staat om de effecten van herhaalde toediening te onderzoeken, evenals voortdurende, langdurige blootstelling aan verbindingen die in de loop van de tijd cardiotoxische effecten kunnen vertonen, zoals gebeurt met doxorubicine. Doxorubicine (dox) is een anti-kanker chemotherapie drug17. De hoeveelheid geneesmiddel die aan patiënten wordt toegediend, varieert, afhankelijk van het type kanker, de leeftijd van de patiënt, de lengte en het gewicht van de patiënt, evenals andere factoren. Om deze reden is het belangrijk om het effect van dox te testen in een breed scala van concentraties en leveringsschema's. Hier werden cardiale EMT's in de loop van 27 dagen behandeld met drie afzonderlijke concentraties (0,1 μM, 1 μM en 10 μM) dox (figuur 7). De groepen werden verder gestratificeerd door EMT's bij elke concentratie te behandelen met een bolusbehandeling of continue toediening met een gemiddelde verandering om de 72 uur. Putten die bolusbehandelingen van dox kregen, werden op drie verschillende tijdstippen aan het medicijn blootgesteld, waardoor herstel tussen de dosering mogelijk was. De twee hoogste doses bolus en continue blootstelling toonden een onmiddellijke en langdurige stopzetting van de contractiele krachtgeneratie gedurende het onderzoek. De middelste en laagste concentraties hadden verschillende effecten op de weefsels, afhankelijk van de toedieningsmethode. In de laagste concentratie van het geneesmiddel vertoonde de bolusgroep geen verschil met de controles. De contractiele kracht nam echter af na 2 weken continue blootstelling. De mid-range concentratie van het medicijn had een interessant effect. Terwijl continue dosering de kracht verminderde gedurende de eerste paar dagen van de behandeling en gedurende het hele experiment duurde, vertoonde de bolusgroep een herstel van de contractiele kracht terug naar controleniveaus wanneer het medicijn na 3 dagen werd uitgewassen. De tweede bolus van het geneesmiddel veroorzaakte echter een volledige stopzetting van de kracht, gevolgd door geen herstel (figuur 7), wat aangeeft dat herhaalde dosering in deze concentratie een cardiotoxisch effect kan hebben bij patiënten die met dit geneesmiddel worden behandeld. De brede reikwijdte van deze studie, zowel in tijd als in experimentele omstandigheden, benadrukt het nut van 3D-gemanipuleerde weefsels bij toxiciteitsscreening, omdat ze contractiel blijven en reageren op chemische blootstelling gedurende langere tijd, waardoor langdurige geneesmiddelenstudies binnen een enkele set spierweefsels mogelijk zijn. Dit vergemakkelijkt niet alleen het identificeren van verbindingen die een cardiotoxisch effect kunnen hebben bij chronische blootstelling, maar ook het detecteren van potentiële cardiotoxische timing van toediening.
In vitro toxiciteitstests in gemanipuleerde menselijke spierweefsels zijn een manier om menselijke patiënten veilig te houden in klinische onderzoeken. BMS-986094 is een nucleotidepolymerase (NS5B)-remmer die wordt gebruikt voor de behandeling van hepatitis C. Het geneesmiddel bevond zich in fase II klinische ontwikkeling toen Bristol-Myers Squibb de ontwikkeling staakte vanwege verschillende gevallen van onverwacht hartfalen bij patiënten18,19. Hier werd BMS-986094 toegepast op cardiale EMT's om te testen of 3D-gemanipuleerde spierweefsels een cardiotoxische reactie op het medicijn zouden ontwikkelen (figuur 8). Drie verschillende concentraties van het medicijn werden toegepast en weefsels werden gedurende 13 dagen gecontroleerd. De contractiele kracht daalde met de toevoeging van het geneesmiddel op een dosisafhankelijke manier (figuur 8A). De twitch-frequentie werd ook aanzienlijk beïnvloed toen de slagsnelheid vertraagde en uiteindelijk stopte zoals verwacht met voortdurende blootstelling aan de cardiotoxische verbinding (p < 0,05, figuur 8B). Deze resultaten laten zien hoe 3D-gemanipuleerde menselijke spierweefsels kunnen worden gebruikt om het op de markt brengen van nieuwe geneesmiddelen te vergemakkelijken en verbindingen te markeren die uiteindelijk falen als gevolg van cardiotoxiciteit. Bovendien kan deze technologie mogelijk levens redden door gevaarlijke geneesmiddelen bloot te stellen voordat ze in klinische onderzoeken bij patiënten worden geplaatst.
Het vermogen om het effect van acute en chronisch toegepaste geneesmiddelen op menselijk contractiel weefsel te meten, is een essentiële eerste stap bij het onderzoeken van therapieën op veiligheid en werkzaamheid. Het is echter belangrijk om te weten dat de concentratie van de toegepaste geneesmiddelen fysiologisch relevant en geschikt is voor in vitro testen. Skeletspierweefsels werden gebruikt om een IC50-waarde vast te stellen voor 2,3-butaandionemonoxime (BDM) in een volledige dosis-responscurve. Dit medicijn is een goed gekarakteriseerde ATPase-remmer van skeletspiermyosine-II20. BDM remt spiercontracties door myosine cross-bridge vorming met het actine filament in sarcomerente voorkomen 21. De hier getoonde resultaten onthullen een dosisafhankelijke afname van de absolute kracht wanneer het geneesmiddel wordt toegepast en volledig herstel van de contractiele kracht wanneer het geneesmiddel wordt uitgewassen, wat aangeeft dat het voorbijgaande effect spiercontracties voorkomt en niet alleen cellen in het weefsel doodt (figuur 9A). Bovendien werd een volledige dosis-responscurve gemeten over de zeven onderzochte concentraties, waarbij een IC50 van 3,2 mM in deze menselijke microtweefsels werd vastgesteld (figuur 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig01.jpg"> Figuur 1: EMT gieten in de 2-post Mantarray verbruiksplaat met 24 putten . (A) Myogene en stromale cellen werden gekweekt op 2D-oppervlakken voorafgaand aan het gieten van weefsel. (B) Cellen worden opgetild van 2D-oppervlakken en gemengd met extracellulaire matrixeiwitten om hydrogels te vormen in de individuele plaatgietputten die in de inzet worden weergegeven. C) 24-putplaat met gemanipuleerde weefsels in elke put. (D) Representatieve weefsels die ontspannen en samengetrokken gemanipuleerde spieren vertonen, waarbij de verplaatsing van de magnetische paal (groene balken) wordt vergeleken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig02.jpg"> Figuur 2: Succesvol en mislukt EMT-gieten . (A) Ideaal gemanipuleerd spierweefsel 24 uur na het gieten gelijkmatig verdicht rond de palen met een homogene cel/matrixsamenstelling door het hele weefsel. (B) Mislukte EMT met loslating van de hydrogel van de flexibele paal. (C) EMT met luchtbellen door het weefsel. (D) Ongelijke weefselafzetting rond beide palen. Weefsel is aan één kant losjes verankerd aan de flexibele paal. Schaalstaven zijn 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig03.jpg"> Figuur 3: Verdichting in gemanipuleerd spierweefsel in de loop van de tijd. (A) EMT-constructie getoond 1 dag na het gieten. Weefsels worden overgebracht naar differentiatiemedium, beginnend op dag 0 van celfusie en hydrogelverdichting. (B-E) Dezelfde EMT op dag 7 tot en met dag 21 met een iets kortere totale lengte tussen de twee palen in de loop van de tijd en een kleinere breedte wanneer gemeten door het middelste gedeelte van de EMT. Schaalstaven zijn 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig04.jpg"> Figuur 4: EMT-diameter in de loop van de tijd. Vier platen van weefsels werden gedurende 21 dagen gevolgd, waarbij de EMT-diameter gedurende de hele verdichting werd vergeleken. Elk weefsel werd elke week door het middengedeelte gemeten met behulp van optische microscopie. Tijdstippen tonen een consistente EMT-grootte tussen platen. Maximale verdichting wordt bereikt op dag 21 als matrixremodellering wordt gestabiliseerd. De tabel toont de standaardafwijking (% van het totaal) van verdichting binnen elke plaat van weefsels en de gemiddelde afwijking voor alle platen. Gekleurde balken zijn individuele platen. Foutbalken zijn SD van EMT's binnen platen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig05.jpg"> Figuur 5: Immunohistochemie van de gemanipuleerde skeletspierweefsels. EMT's werden gefixeerd op dag 10 van de cultuur en ingebed in paraffine. Dunne doorsneden (7 μm) werden gekleurd met antilichamen tegen myosine zware keten en dystrofine voorafgaand aan beeldvorming. Groen = MyHC, rood = Dystrofine, blauw = DAPI. Objectieve vergroting is 40X; Schaalbalk is 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig06.jpg"> Figuur 6: Contractiele kracht in gemanipuleerde spierweefsels in de loop van de tijd. (A) Gemiddelde absolute spierkracht gemeten van cardiale EMT's van dag 7 tot en met dag 63 in cultuur; n = 3 per groep. (B) Gemiddelde absolute spierkracht in skelet-EMT's afgeleid van een primaire cellijn op dag 7 tot en met dag 53 in cultuur; n = 3. Foutbalken zijn SD voor beide grafieken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig07.jpg"> Figuur 7: Acute en chronische behandeling met doxorubicine in het gemanipuleerde spierweefsel. Drie afzonderlijke dosisconcentraties van dox, 0,1 μM, 1 μM en 10 μM, werden in de loop van 27 dagen in bolus toegediend of continu toegediend aan gemanipuleerde spierweefsels. Bolusdoses van het medicijn werden toegevoegd bij mediaveranderingen op dag 0, 12 en 24, opgemerkt door de groene pijlen op de X-as. Het medicijn werd bij elke mediawissel aan de media toegevoegd voor continue dosering, opgemerkt door de zwarte en groene pijlen op de X-as. De procentuele verandering in kracht ten opzichte van de uitgangswaarden (pre-medicamenteuze behandeling) bevindt zich op de Y-as en de tijd in dagen van behandeling ligt op de X-as. Lichtoranje = DMSO continue controle, donkeroranje = DMSO bolusregeling, lichtgroen = 0,1 μM dox continu, donkergroen = 0,1 μM dox bolus, lichtblauw = 1 μM dox continu, donkerblauw = 1 μM Dox bolus, lichtgeel = 10 μM dox continu, donkergeel = 10 μM dox bolus. Foutbalken zijn SD; n = 3 per voorwaarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig08.jpg"> Figuur 8: Chronische behandeling met BMS-986094 in gemanipuleerd spierweefsel. EMT's werden behandeld met 0,4 μM (groen), 2 μM (donkerblauw) en 10 μM (lichtblauw) BMS-986094 gedurende 13 dagen. (A) Contractiele spierkracht (Y-as) neemt af bij alle geneesmiddelconcentraties in de eerste 2 dagen, terwijl de controleweefsels in DMSO in de loop van de tijd sterker worden (X-as). (B) De hartslagsnelheid, of twitchfrequentie, stopt op een dosisafhankelijke manier in combinatie met een stopzetting van de contractiele kracht weergegeven in grafiek A. Controleweefsels in DMSO (grijs) handhaven een regelmatige slagsnelheid gedurende het experiment. Foutbalken zijn SD; n = 3 per voorwaarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig09.jpg"> Figuur 9: Dosis-respons op BDM in gemanipuleerde skeletspierweefsels . (A) De absolute spierkracht neemt op een dosisafhankelijke manier af wanneer primaire cel-afgeleide EMT's worden blootgesteld aan 2,3-butaandionemonoxiem (BDM) op dag 16 in 3D-cultuur. Absolute twitch-kracht keert terug naar bijna basiswaarden wanneer het medicijn wordt uitgewassen. (B) De absolute spierkracht genormaliseerd tot basiswaarden neemt af op een dosisafhankelijke manier bij blootstelling aan BDM, wat een volledige dosis-responscurve en IC50-waarde oplevert; n = 4 per dosis. Foutbalken zijn SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Dit protocol biedt methoden voor het genereren van 3D-gemanipuleerde hart- en skeletspierweefsels en beschrijft het gebruik ervan in preklinische screeningsmodaliteiten voor geneesmiddelen. De beschreven methoden maken gebruik van een magnetisch detectiesysteem om de gelijktijdige beoordeling van 24 weefsels parallel te vergemakkelijken.

Preklinische geneesmiddelentests in schaalbare 3D-gemanipuleerde spierweefsels

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Ons platform maakt gebruik van 3D-gemanipuleerde spierweefsels en magnetische detectiehardware om contractiliteit in 24 putten tegelijkertijd te meten. Dit biedt een hogere doorvoermethode voor het beoordelen van nieuwe therapieën in vitro met behulp van menselijke spierweefsels. Onze gietmethode verbetert de consistentie en reproduceerbaarheid bij het fabriceren van 3D-gemanipuleerde spierweefsels.We hebben een verbruiksplaat met 24 putten ontworpen die is uitgerust met magnetische detectiehardware voor contractiliteitsmetingen en -analyse op ons platform. Deze methode kan waardevol inzicht bieden in in vitro ziektemodellering, medicijnontdekking en gentherapie voor elke spierziekte die contractiliteit beïnvloedt. We nemen momenteel motorneuronen op in onze 3D-constructies om ook een neuromusculair junctiemodel te maken.Plaats om te beginnen een voorgekoelde weefselgietset op een koud blok of ijs in de celkweekkap. Leg de gietplaat plat op ijs. Voeg trombine toe aan het basismedium om de trombineoplossing te maken en verplaats het paalrooster van de gietplaat naar een nieuwe steriele 24-putplaat.Pipetteer 50 microliter trombineoplossing in elke voorgekoelde put van de gietplaat en plaats het rooster terug op de kit. Zet de werpset opzij op ijs. Voeg vervolgens 500 milliliter RPMI-medium, 10 milliliter B27 en 2,5 gram aminocapronzuur of ACA toe om het cardiale EMT-medium te bereiden.Verwijder het EMT-medium dat zal worden gebruikt om de weefsels te gieten en voeg er 10 micromolaire ROCK-remmer aan toe. Bereid het skelet-EMT-medium voor door 50 milliliter F10-medium en 0,25 gram aminocapronzuur of ACA toe te voegen voor primaire myoblasten. Gebruik 0,1 gram ACA voor IPSC-afgeleide myoblasten.Filter vervolgens het gietmedium dat ACA bevat steriel. Verwarm het dissociatiereagens van celkweekkwaliteit en een gelijk volume EMT-medium tot 37 graden Celsius. Dit verwarmde EMT-medium wordt gebruikt om het dissociatiereagens te verdunnen.Was de cellen met PBS en voeg het verwarmde dissociatiereagens toe om de cellen op te tillen. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten of totdat de cellen zijn opgetild en controleer de culturen om de twee tot drie minuten door op de zijkant van de plaat te tikken. Zodra de cellen zijn opgetild, breng je ze over naar een conische buis van 50 milliliter.Triturate met een P-1000 pipet om een enkelcellige suspensie te garanderen. Was de plaat en de kolf met een extra EMT-medium om de resterende cellen te verzamelen en voeg ze toe aan de conische buis. Nogmaals, tritueer de cellen om een enkele celsuspensie te garanderen.Voeg EMT-medium toe om het dissociatieproces te beëindigen en neem vervolgens monsters van de celsuspensies voor celtellingen. Voer celtellingen uit met behulp van een geautomatiseerde celteller of een hemocytometer in trypanblauw. Draai de cellen gedurende vier minuten op 200 G, zuig het supernatant op en suspensie de cellen opnieuw in vijf milliliter van het EMT-basismedium om het resterende dissociatiereagens te verwijderen.Na het opnieuw centrifugeren gedurende vier minuten, zuigt u het supernatant op en bereidt u de celsuspensies voor op de juiste dichtheden. Bereken de volumes van elke celoplossing die nodig zijn om het gewenste aantal weefsels te vormen en pipetteer de berekende volumes cellen in een conische buis van 15 milliliter. Voeg 10 microliter fibrinogeen per EMT toe aan de celsuspensie en plaats deze op ijs.Zorg ervoor dat elke EMT 90 microliter celsuspensie, 10 microliter fibrinogeen en 50 microliter trombineoplossing in het uiteindelijke weefselconstruct heeft. Verwijder in een celkweekkap het deksel van de weefselgietset en plaats de gietplaat met het paalrooster plat op het ijs. Meng het celfibrinogeenmengsel en zuig 100 microliter op met een P-200-pipet.Voeg 100 microliter van het mengsel toe aan putten bereid met 50 microliter trombineoplossing en tritueer vijf keer om goed te mengen. Duw de pipet niet voorbij de eerste stop en verwijder de punt na trituratie om te voorkomen dat er bubbels ontstaan. Meng de celsuspensie in de conische buis voordat u elk weefsel giet.Houd zowel het rooster als de gietputplaat tegelijkertijd vast met de wijsvinger en duim van één hand om beweging van het rooster te voorkomen of laat de plaat plat op ijs en schommel de ijsemmer om in de gietplaat te kijken. Herhaal met een verse P-200 tip voor elk weefsel totdat alle weefsels zijn gegoten. Breng de gezaaide kit voorzichtig over naar de incubator en incuber gedurende 80 minuten bij 37 graden Celsius.Maak vervolgens een verse 24-putplaat met twee milliliter per put van het EMT-medium voor hartweefsels en incuber de plaat bij 37 graden Celsius om het medium op te warmen. Voeg na de incubatie van 80 minuten voorzichtig een milliliter van het EMT-medium toe aan de rand van de gietputten en incuber nog eens 10 minuten bij 37 graden Celsius. Til na 10 minuten incubatie voorzichtig het paalrooster op en breng de weefsels over van de gietplaat naar een voorbereide 24-putplaat met het verwarmde medium.Breng ten slotte de platen met weefsels terug naar de celkweekincubator bij 37 graden Celsius. Mislukte EMT-productie kan variëren van catastrofale mislukkingen zoals weefselloslating van de palen, tot meer subtiele structurele gebreken zoals luchtbellen en ongelijke weefselafzetting rond beide palen. EMT construct een dag na het gieten is hier te zien.Skeletspierweefsels werden overgebracht naar een differentiatiemedium vanaf dag nul van celfusie en hydrogelverdichting. Van dag zeven tot en met dag 28 vertoonde dezelfde EMT een iets kortere totale lengte tussen de twee palen en een kleinere breedte wanneer gemeten door het middelste gedeelte van de EMT. Vier platen van weefsels werden gedurende 21 dagen gevolgd en vergeleken de EMT-diameter gedurende de verdichting.Tijdstippen tonen een consistente EMT-grootte tussen platen. Maximale verdichting wordt bereikt op dag 21 als matrixremodellering wordt gestabiliseerd. De immunohistochemie van de EMT's wordt hier afgebeeld.EMT's werden gefixeerd op dag 10 van de cultuur en ingebed in paraffine. Dunne doorsneden werden vóór de beeldvorming gekleurd met antilichamen tegen myosine, zware keten en dystrofine. Deze grafische afbeeldingen vertegenwoordigen de gemiddelde absolute spierkracht gemeten van de cardiale EMT's en de skelet-EMT's in de loop van de tijd.Acute en chronische doxorubicine behandeling in gemanipuleerde hartweefsels wordt hier getoond. Drie verschillende dosisconcentraties van Dox werden toegediend in bolus of continu toegediend aan gemanipuleerde hartweefsels in de loop van 27 dagen. De dosisrespons op BDM in gemanipuleerde skeletspierweefsels wordt in deze figuur weergegeven.De hartslag of twitchfrequentie stopt op een dosisafhankelijke manier in combinatie met een stopzetting van de contractiele kracht die cardiotoxiciteit aangeeft wanneer EMT's aan deze verbinding worden blootgesteld. De belangrijkste dingen om te onthouden bij het gieten van weefsels zijn om alles te allen tijde koud te houden, inclusief uw celsuspensie en reagentia en om het paalarmat volledig stationair te houden zodra het gieten begint.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Engineered 3D Silk-collageen-gebaseerde model van de gepolariseerde zenuwweefsel

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered Gevasculariseerd Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

toepassingen van<em&gt; In Vivo</em&gt; Functioneel testen van de Rat tibialis anterior voor de evaluatie van Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Biomechanische karakterisering van menselijke zachte weefsels met behulp van inspringen en Trekproeven

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...