Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Ce travail a été partiellement financé par la Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 attribué à l’Institut des sciences de la santé et de l’environnement) et par le financement des National Institutes of Health (HL151094 au Dr Geisse). Nous remercions le Dr Alec S. T. Smith pour son aide dans la préparation de ce manuscrit.

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Tous les auteurs sont des employés et des actionnaires de Curi Bio Inc., la société qui commercialise le matériel Mantarray et les logiciels associés.

Cette étude décrit des méthodes pour générer des tissus cardiaques et musculaires squelettiques modifiés en 3D dans un kit de coulée consommable de 24 puits. En suivant ces méthodes, il est possible d’obtenir systématiquement un ensemble complet de 24 tissus sans échec de coulée pour le dépistage ultérieur des médicaments. Les considérations essentielles pour obtenir un tel résultat sont de s’assurer que pendant la coulée toutes les étapes sont effectuées sur de la glace pour éviter la polymérisation prématurée des hydrogels, l’élimination du réactif de dissociation cellulaire avant la coulée des tissus, le mélange complet de la cellule et de la suspension d’hydrogel pour chaque tissu, le remplacement des pointes de pipette entre les tissus et l’utilisation de FBS inactivé par la chaleur (le cas échéant). En outre, il est important de s’assurer que le réseau de poteaux n’est pas déplacé une fois que la coulée commence et est transféré doucement une fois que les hydrogels se sont formés.
Les modifications majeures comprennent l’utilisation de différents types de cellules pour obtenir des EMT cardiaques par rapport aux cellules d’urgence squelettiques et le dopage d’hydrogels à concentrations variables de protéines de la membrane basale pour favoriser la maturation cellulaire et la stabilité des tissus. Les effets bénéfiques d’un tel dopage doivent être testés au cas par cas, mais il a été démontré qu’ils améliorent les résultats fonctionnels et la longévité des tissus dans certaines circonstances14,16,22. Il convient également de noter que les densités cellulaires énumérées sont un guide et peuvent avoir besoin d’être optimisées pour différentes lignées cellulaires. D’autres compositions d’hydrogel pourraient également être considérées comme un moyen de modifier les propriétés structurelles et fonctionnelles des EMT 23,24,25 obtenues. Le microenvironnement musculaire natif contient également des types de cellules de soutien pour favoriser la vascularisation, l’innervation et le dépôt de matrice pour soutenir les myocytes dans la forme et la fonction26,27. Alors que le système décrit ici incorpore actuellement des fibroblastes dans les tissus cardiaques 3D, d’autres types de cellules peuvent créer un modèle plus pertinent sur le plan physiologique pour étudier l’innocuité et l’efficacité des composés thérapeutiques in vitro. Auparavant, une gamme de types de cellules de soutien ont été intégrées avec succès dans des tissus conçus en 3D, ce qui présente un modèle passionnant pour une étude future utilisant la plate-forme de contractilité de détection magnétique28,29,30.
Le dépannage de ce protocole est centré sur la formation de tissus peu fiables ou incohérents pendant le processus de coulée. Il faut prendre soin d’éviter la formation de bulles dans les hydrogels lorsqu’ils sont coulés tout en facilitant une distribution uniforme des cellules pendant le mélange. Des expériences d’optimisation seront probablement nécessaires pour chaque nouveau type de cellule afin d’identifier les densités cellulaires idéales, les rapports cellulaires et la composition matricielle.
Une limitation majeure de cette technique est le nombre important de cellules nécessaires pour établir une plaque complète de 24 EMT. Pour les données présentées ici, 15 millions de cardiomyocytes et 18 millions de myoblastes squelettiques ont été utilisés par plaque. Certains chercheurs peuvent ne pas avoir accès à de tels bassins de matériel cellulaire, ce qui peut nuire à leur capacité d’utiliser pleinement cette plateforme. Si les utilisateurs finaux n’ont pas accès à du matériel de détection magnétique, les mesures des post-déflexions doivent être effectuées optiquement, ce qui réduit considérablement le débit et empêche l’enregistrement simultané des contractions musculaires sur plusieurs puits. Cependant, le matériel Mantarray surmonte ces limitations pour offrir le premier système commercial capable d’analyser en continu et non invasif la contraction EMT simultanément sur plusieurs constructions.
La détection magnétique à travers 24 puits facilite les études longitudinales du développement fonctionnel de l’EMT en temps réel et permet une mesure précise des réponses aiguës à des manipulations chimiques, environnementales ou génétiques. Bien que la détection magnétique présente plusieurs avantages, tels que la mesure simultanée sur plusieurs tissus, et ne nécessite pas d’analyse de données compliquée, les méthodes de détection optique permettent de mesurer simultanément des mesures physiologiques telles que le flux de calcium ou la cartographie de tension. Cependant, des ensembles de données tels que ceux illustrés dans la section des résultats démontrent l’étendue des applications de cette technologie dans le domaine du développement de médicaments. Étant donné que peu de tests sur le marché offrent les moyens d’effectuer une évaluation directe du débit contractile dans le muscle modifié, ces méthodes ont le potentiel de révolutionner le pipeline de développement préclinique.

Les modèles de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) deviennent de plus en plus des acteurs clés dans le pipeline préclinique pour la découverte et le développement thérapeutiques, ainsi que la recherche biologique fondamentale et la modélisation des maladies 1,2,3,4,5. Les tissus contractiles, tels que les muscles cardiaques et squelettiques dérivés des CSPi, présentent un grand potentiel pour améliorer le pouvoir prédictif des études in vitro humaines, car l’évaluation directe de la force contractile musculaire et de la cinétique sont des paramètres quantitatifs pour étudier la fonction tissulaire globale 4,6,7,8. Typiquement, les mesures de force contractile ont été obtenues soit indirectement par suivi optique de la déviation du substrat 9,10, soit directement par fixation de cellules/tissus à un transducteur de force4,11,12. Ces méthodes, bien que précises, sont intrinsèquement à faible débit et nécessitent généralement des opérateurs hautement qualifiés pour collecter et analyser les données.
Des travaux antérieurs ont montré que la détection de champ magnétique contourne ces obstacles et fournit une méthode alternative pour évaluer simultanément la fonction musculaire modifiée sur plusieurs constructions tissulaires13. La plate-forme de contractilité 3D Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) s’appuie sur cette technologie à l’aide d’un dispositif capable de mesurer la contractilité des tissus musculaires modifiés d’une manière hautement parallèle qui exploite la complexité des modèles cellulaires 3D avec un criblage à débit plusélevé 14. La plateforme permet une surveillance quantitative, en temps réel et sans marquage de la fonction contractile dans les tissus musculaires cardiaques et squelettiques à l’intérieur ou à l’extérieur d’un incubateur de culture cellulaire standard, éliminant ainsi le besoin d’imagerie et d’analyse contractiles optiques. Cette technologie facilite la comparaison directe de lignées cellulaires saines et malades et permet de mesurer l’effet d’un médicament sur les tissus contractiles, en établissant des données quantifiables, in vitro, d’innocuité et d’efficacité pour les composés thérapeutiques nouveaux et existants.
Les tissus musculaires 3D modifiés peuvent être fabriqués entre deux poteaux de manière hautement reproductible à l’aide de la plaque de coulée consommable Mantarray à 24 puits (Figure 1). Un poteau est rigide, tandis que l’autre poteau est flexible et contient un petit aimant. Lorsque la construction du tissu se contracte, elle déplace le poteau flexible et l’aimant intégré. La plaque EMT est positionnée à l’intérieur de l’instrument et le post-déplacement est mesuré via un réseau de capteurs magnétiques sur une carte de circuit imprimé sous le support de plaque. Les changements mesurés dans le champ magnétique sont convertis en force contractile absolue à l’aide d’un algorithme mathématique. L’instrument utilise des taux d’échantillonnage de données rapides pour permettre la collecte d’informations détaillées sur la capacité fonctionnelle et la maturité du ou des types de cellules testés, y compris la fréquence de contraction, la vitesse et le temps de désintégration. Ces mesures fonctionnelles peuvent être obtenues sur les 24 puits simultanément avec la plate-forme de détection magnétique ou individuellement et séquentiellement à l’aide de méthodes optiques traditionnelles.
Cette étude décrit une méthode hautement reproductible pour l’ingénierie des microtissus musculaires et cardiaques squelettiques 3D dans un hydrogel à base de fibrine. Au cours d’une brève réaction de 80 minutes, la thrombine catalyse la conversion du fibrinogène en fibrine, fournissant un échafaudage pour que les cellules musculaires se développent en culture suspendue15. Les cellules stromales aident à remodeler la matrice et les tissus deviennent contractiles lorsque les cellules musculaires forment un syncytium dans l’hydrogel. La contractilité de ces tissus a été analysée à l’aide de l’approche de détection magnétique, avant et après l’exposition au composé, validant cette modalité pour une utilisation dans les études dose-réponse médicamenteuse. Les myoblastes humains primaires provenant d’une biopsie de donneur sain ont été obtenus commercialement et cultivés en 2D selon les protocoles du fournisseur. Les cellules ont été dilatées à l’aide d’un milieu de croissance musculaire squelettique à travers trois passages pour générer un nombre suffisant de cellules pour fabriquer des tissus 3D. Les cellules stromales et les cardiomyocytes dérivés de l’hiPSC ont été cultivés selon le protocole du fournisseur pendant 3 jours pour permettre la récupération de la cryoconservation avant de couler les cellules dans les tissus. Des résultats représentatifs sont fournis illustrant les types d’ensembles de données qui peuvent être collectés à l’aide de la plate-forme de détection magnétique. Les pièges courants associés à la génération de tissus modifiés à l’aide de ces méthodes sont également abordés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

La modélisation précise in vitro des conditions saines et des maladies est essentielle au développement de nouvelles stratégies de traitement et de traitements. Pour les maladies cardiaques et musculaires squelettiques, la force contractile et la cinétique constituent des paramètres clés pour évaluer la fonction musculaire. Des méthodes nouvelles et améliorées de génération de tissus musculaires modifiés (EMT) à partir de cellules souches pluripotentes induites ont rendu la modélisation in vitro des maladies plus fiable pour les tissus contractiles; Cependant, il est difficile de fabriquer de manière reproductible des tissus à partir de cultures cellulaires en suspension et de mesurer leur contractilité. Ces techniques sont souvent en proie à des taux de défaillance élevés et nécessitent une instrumentation complexe et des routines d’analyse de données personnalisées. Une nouvelle plate-forme et un nouvel appareil qui utilise des EMT 3D en conjonction avec un test de contractilité sans étiquette, hautement parallèle et convivial pour l’automatisation contournent bon nombre de ces obstacles. La plate-forme permet la fabrication facile et reproductible d’EMT 3D en utilisant pratiquement n’importe quelle source de cellules. La contractilité tissulaire est ensuite mesurée à l’aide d’un instrument qui mesure simultanément 24 tissus sans avoir besoin de routines d’analyse logicielle complexes. L’instrument peut mesurer de manière fiable les changements de force du micronewton, ce qui permet un criblage de composés dose-dépendants pour mesurer l’effet d’un médicament ou d’un traitement sur la production contractile. Les tissus fabriqués avec cet appareil sont entièrement fonctionnels, générant des contractions tranchées et tétaniques lors de la stimulation électrique, et peuvent être analysés longitudinalement en culture pendant des semaines ou des mois. Ici, nous montrons les données des ambulanciers du muscle cardiaque sous administration aiguë et chronique avec des substances toxiques connues, y compris un médicament (BMS-986094) qui a été retiré des essais cliniques après des décès de patients dus à une cardiotoxicité imprévue. Une altération de la fonction des muscles squelettiques dans les tissus modifiés en réponse à un traitement avec un inhibiteur de la myosine est également présentée. Cette plate-forme permet au chercheur d’intégrer des systèmes de modèles de bioingénierie complexes et riches en informations dans son flux de travail de découverte de médicaments avec un minimum de formation ou de compétences supplémentaires requises.

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Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Ce protocole fournit des méthodes pour générer des tissus cardiaques et musculaires squelettiques modifiés en 3D et décrit leur utilisation dans les modalités de dépistage préclinique des médicaments. Les méthodes décrites utilisent un système de détection magnétique pour faciliter l’évaluation simultanée de 24 tissus en parallèle.

Tests précliniques de médicaments dans des tissus musculaires 3D évolutifs

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Notre plateforme utilise des tissus musculaires conçus en 3D et du matériel de détection magnétique pour mesurer la contractilité sur 24 puits simultanément. Cela fournit une méthode à débit plus élevé pour évaluer de nouveaux traitements in vitro en utilisant des tissus musculaires humains. Notre méthode de coulée améliore la consistance et la reproductibilité dans la fabrication de tissus musculaires issus de l’ingénierie 3D.Nous avons conçu une plaque de coulée consommable de 24 puits équipée d’un matériel de détection magnétique pour les mesures et l’analyse de contractilité sur notre plate-forme. Cette méthode peut fournir des informations précieuses sur la modélisation in vitro des maladies, la découverte de médicaments et la thérapie génique pour toute maladie musculaire affectant la contractilité. Nous intégrons actuellement des motoneurones dans nos constructions 3D pour créer également un modèle de jonction neuromusculaire.Pour commencer, placez un kit de moulage de tissus pré-réfrigéré sur un bloc froid ou de la glace à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire. Posez la plaque de coulée à plat sur de la glace. Ajouter la thrombine au milieu de base pour obtenir la solution de thrombine et déplacer le réseau post-lit de la plaque de coulée vers une nouvelle plaque stérile à 24 puits.Pipeter 50 microlitres de solution de thrombine dans chaque puits pré-refroidi de la plaque de coulée et replacer le treillis sur le kit. Mettez le kit de coulée de côté sur la glace. Ensuite, ajoutez 500 millilitres de milieu RPMI, 10 millilitres de B27 et 2,5 grammes d’acide aminocaproïque, ou ACA, pour préparer le milieu EMT cardiaque.Retirez le milieu EMT qui sera utilisé pour couler les tissus et ajoutez-y 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Préparez le milieu EMT squelettique en ajoutant 50 millilitres de milieu F10 et 0,25 gramme d’acide aminocaproïque, ou ACA, pour les myoblastes primaires. Utilisez 0,1 gramme d’ACA pour les myoblastes dérivés de l’IPSC.Ensuite, filtrer stérile le milieu de coulée contenant de l’ACA. Réchauffer le réactif de dissociation de qualité culture cellulaire et un volume égal de milieu EMT à 37 degrés Celsius. Ce milieu EMT chauffé sera utilisé pour diluer le réactif de dissociation.Lavez les cellules avec du PBS et ajoutez le réactif de dissociation chauffé pour soulever les cellules. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que les cellules se soient levées et vérifier les cultures toutes les deux à trois minutes en tapotant le côté de la plaque. Une fois les cellules soulevées, transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres.Triturate avec une pipette P-1000 pour assurer une suspension unicellulaire. Laver la plaque et le ballon avec un milieu EMT supplémentaire pour recueillir les cellules restantes et les ajouter au tube conique. Encore une fois, triturez les cellules pour assurer une suspension unicellulaire.Ajouter un milieu EMT pour mettre fin au processus de dissociation, puis prélever des échantillons des suspensions cellulaires pour le nombre de cellules. Effectuer le comptage cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre en bleu trypan. Faites tourner les cellules à 200 g pendant quatre minutes, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres du milieu de base EMT pour éliminer le réactif de dissociation résiduel.Après avoir centrifugé à nouveau pendant quatre minutes, aspirer le surnageant et préparer les suspensions cellulaires aux densités appropriées. Calculer les volumes de chaque solution cellulaire nécessaire pour constituer le nombre souhaité de tissus et pipeter les volumes calculés de cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez 10 microlitres de fibrinogène par EMT à la suspension cellulaire et placez-la sur de la glace.Assurez-vous que chaque EMT contient 90 microlitres de suspension cellulaire, 10 microlitres de fibrinogène et 50 microlitres de solution de thrombine dans la construction finale du tissu. Dans une hotte de culture cellulaire, retirez le couvercle du kit de coulée de tissus et placez la plaque de coulée avec le réseau de poteaux posé à plat sur la glace. Mélanger le mélange de fibrinogène cellulaire et aspirer 100 microlitres avec une pipette P-200.Ajouter 100 microlitres du mélange dans des puits préparés avec 50 microlitres de solution de thrombine et triturer cinq fois pour bien mélanger. Ne poussez pas la pipette au-delà de la première butée et retirez l’embout après la trituration pour éviter de créer des bulles. Mélanger la suspension cellulaire dans le tube conique avant de couler chaque tissu.Tenez simultanément le treillis et la plaque de puits de coulée à l’aide du doigt et du pouce d’une main pour éviter tout mouvement du réseau ou laissez la plaque à plat sur la glace et secouez le seau à glace pour voir dans la plaque de coulée. Répétez avec une nouvelle pointe P-200 pour chaque tissu jusqu’à ce que tous les tissus soient moulés. Transférez soigneusement le kit ensemencé dans l’incubateur et incuber à 37 degrés Celsius pendant 80 minutes.Ensuite, préparez une nouvelle assiette de 24 puits avec deux millilitres par puits du milieu EMT pour les tissus cardiaques et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pour réchauffer le milieu. Après l’incubation de 80 minutes, ajoutez doucement un millilitre de milieu EMT au bord des puits de coulée et incuber pendant 10 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes d’incubation, soulevez soigneusement le post-treillis et transférez les tissus de la plaque de coulée vers une plaque préparée à 24 puits avec le milieu chauffé.Enfin, retournez les plaques avec des tissus dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius. La production infructueuse d’EMT peut aller de défaillances catastrophiques telles que le détachement des tissus des poteaux, à des défauts structurels plus subtils tels que des bulles d’air et un dépôt tissulaire inégal autour des deux poteaux. La construction EMT un jour après le casting est montrée ici.Les tissus musculaires squelettiques ont été transférés dans un milieu de différenciation à partir du jour zéro de la fusion cellulaire et du compactage de l’hydrogel. Du septième au jour 28, le même EMT a affiché une longueur totale légèrement plus courte entre les deux poteaux et une largeur plus petite lorsqu’elle a été mesurée à travers la section centrale de l’EMT. Quatre plaques de tissus ont été suivies pendant 21 jours en comparant le diamètre EMT tout au long du compactage.Les points temporels montrent une taille EMT cohérente entre les plaques. Le compactage maximal est atteint au jour 21 lorsque le remodelage de la matrice est stabilisé. L’immunohistochimie des EMT est représentée ici.Les EMT ont été fixés au jour 10 de culture et incorporés dans de la paraffine. Des coupes transversales minces ont été colorées avec des anticorps contre la chaîne lourde de myosine et la dystrophine avant l’imagerie. Ces images graphiques représentent la force de contraction absolue moyenne mesurée à partir des ambulanciers cardiaques et des ambulanciers squelettiques au fil du temps.Le traitement aigu et chronique à la doxorubicine dans les tissus cardiaques modifiés est présenté ici. Trois doses différentes de Dox ont été administrées en bolus ou administrées en continu à des tissus cardiaques modifiés pendant 27 jours. La relation dose-réponse à la BDM dans les tissus musculaires squelettiques modifiés est présentée dans cette figure.La fréquence des battements cardiaques ou la fréquence des contractions cesse de manière dose-dépendante en tandem avec un arrêt de la force contractile indiquant une cardiotoxicité lorsque les ambulanciers sont exposés à ce composé. Les choses les plus importantes à retenir lors de la coulée des tissus sont de garder tout froid en tout temps, y compris votre suspension cellulaire et vos réactifs, et de garder le post-réseau complètement stationnaire une fois que la coulée commence.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d&#39;un humain de l&#39;oesophage muqueux modèle 3D de l&#39;ingénierie tissulaire

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Recherche

Bio-ingénierie

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Modèle de polarisée Neural Tissue base-Silk-collagène ingénierie 3D

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Conçu vascularisé Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

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Un tissu combiné 3D Conçu<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor modèle de prévision de l&#39;efficacité des médicaments dans le Fond mutationnelles spécifiques

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

des applications de<em&gt; In Vivo</em&gt; Tests fonctionnels du Rat jambier antérieur pour l&#39;évaluation de l&#39;ingénierie tissulaire Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Caractérisation biomécanique des tissus mous humains à l&#39;aide d&#39;essais indentation et traction

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatisé Contraction L&#39;analyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Test standardisé et évolutif pour étudier perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...