Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal finanziamento della Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 assegnato all'Istituto di scienze della salute e dell'ambiente) e dal finanziamento del National Institutes of Health (HL151094 al Dr. Geisse). Ringraziamo il Dr. Alec S. T. Smith per la sua assistenza nella preparazione di questo manoscritto.

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 150 (2013).</li><li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+density+on+the+maturation+and+contractile+ability+of+muscle+derived+cells+in+a+3D+tissue-engineered+skeletal+muscle+model+and+determination+of+the+cellular+and+mechanical+stimuli+required+for+the+synthesis+of+a+postural+phenotype.">The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype.</a> Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+skeletal+muscle+capable+of+functional+regeneration.">Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration.</a> BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10, 6918 (2020).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics.">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li><li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle.">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle &amp; Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+force+and+frequency+analysis+of+engineered+human+heart+tissue+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+using+magnetic+sensing.">Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing.</a> Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).</li><li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+real-time+monitoring+of+engineered+skeletal+muscle+function+using+magnetic+sensing.">High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing.</a> bioRxiv. , 492879 (2022).</li><li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thrombin-fibrinogen+interaction.">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li><li>Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin:+the+good,+the+bad+and+the+ugly+effect.">Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect.</a> Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).</li><li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+dysfunction+associated+with+a+nucleotide+polymerase+inhibitor+for+treatment+of+hepatitis+C.">Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C.</a> Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).</li><li>Gill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+cover:+Investigative+nonclinical+cardiovascular+safety+and+toxicology+studies+with+BMS-986094,+an+NS5b+RNA-dependent+RNA+polymerase+inhibitor.">From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor.</a> Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).</li><li>Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3-Butanedione+monoxime+(BDM)+as+a+myosin+inhibitor.">2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).</li><li>Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralysis+of+skeletal+muscle+by+butanedione+monoxime,+a+chemical+phosphatase.">Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+tissue+engineered+skeletal+muscle+in+vitro+is+dependent+on+the+inclusion+of+basement+membrane+proteins.">Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins.</a> Cytoskeleton. 76 (6), 371-382 (2019).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Tutti gli autori sono dipendenti e azionisti di Curi Bio Inc., la società che commercializza l'hardware Mantarray e il software associato.

Questo studio descrive i metodi per generare tessuti muscolari cardiaci e scheletrici ingegnerizzati in 3D all'interno di un kit di fusione consumabile da 24 pozzetti. Seguendo questi metodi, è possibile ottenere costantemente una gamma completa di 24 tessuti senza errori di fusione per il successivo screening farmacologico. Le considerazioni critiche per ottenere un tale risultato sono garantire che durante la colata tutte le fasi vengano eseguite su ghiaccio per prevenire la polimerizzazione prematura degli idrogel, la rimozione del reagente di dissociazione cellulare prima della fusione tissutale, la miscelazione accurata della cellula e della sospensione di idrogel per ciascun tessuto, la sostituzione delle punte delle pipette tra i tessuti e l'uso di FBS inattivato dal calore (se utilizzato). Inoltre, è importante assicurarsi che il reticolo del palo non venga spostato una volta iniziata la colata e venga trasferito delicatamente una volta che si sono formati gli idrogel.
Le principali modifiche includono l'uso di diversi tipi di cellule per ottenere EMT cardiaci rispetto a quelli scheletrici e il drogaggio di idrogel con concentrazioni variabili di proteine di membrana basale per promuovere la maturazione cellulare e la stabilità dei tessuti. Gli effetti benefici di tale drogaggio devono essere testati caso per caso, ma è stato dimostrato che migliorano i risultati funzionali e la longevità dei tessuti in determinate circostanze14,16,22. È anche interessante notare che le densità cellulari elencate sono una guida e potrebbero dover essere ottimizzate per diverse linee cellulari. Composizioni alternative di idrogel potrebbero anche essere considerate come un mezzo per modificare le proprietà strutturali e funzionali degli EMT raggiunti23,24,25. Il microambiente muscolare nativo contiene anche tipi cellulari di supporto per promuovere la vascolarizzazione, l'innervazione e la deposizione della matrice per supportare i miociti nella forma e nella funzione26,27. Mentre il sistema qui descritto attualmente incorpora fibroblasti nei tessuti cardiaci 3D, ulteriori tipi di cellule possono creare un modello più fisiologico rilevante per studiare la sicurezza e l'efficacia dei composti terapeutici in vitro. In precedenza, una serie di tipi di cellule di supporto sono stati integrati con successo in tessuti ingegnerizzati in 3D presentando un modello entusiasmante per studi futuri utilizzando la piattaforma di contrattilità di rilevamento magnetico28,29,30.
La risoluzione dei problemi per questo protocollo si concentra sulla formazione di tessuti inaffidabili o incoerenti durante il processo di fusione. Bisogna fare attenzione per evitare la formazione di bolle negli idrogel mentre vengono lanciati, facilitando comunque la distribuzione uniforme delle cellule durante la miscelazione. Saranno probabilmente necessari esperimenti di ottimizzazione per ogni nuovo tipo di cellula per identificare le densità cellulari ideali, i rapporti cellulari e la composizione della matrice.
Una delle principali limitazioni per questa tecnica è il numero significativo di cellule necessarie per stabilire una piastra completa di 24 EMT. Per i dati qui presentati, sono stati utilizzati 15 milioni di cardiomiociti e 18 milioni di mioblasti scheletrici per piastra. Alcuni ricercatori potrebbero non avere accesso a tali grandi pool di materiale cellulare, il che potrebbe inibire la loro capacità di utilizzare questa piattaforma nella sua massima estensione. Se gli utenti finali non hanno accesso all'hardware di rilevamento magnetico, le misurazioni delle deflessioni devono essere eseguite otticamente, il che riduce significativamente la produttività e impedisce la registrazione simultanea delle contrazioni muscolari attraverso più pozzetti. Tuttavia, l'hardware Mantarray supera queste limitazioni per offrire il primo sistema commerciale in grado di eseguire un'analisi continua e non invasiva della contrazione EMT simultaneamente su più costrutti.
Il rilevamento magnetico attraverso 24 pozzetti facilita gli studi longitudinali dello sviluppo funzionale EMT in tempo reale e consente una misurazione accurata delle risposte acute alla manipolazione chimica, ambientale o genetica. Mentre il rilevamento magnetico presenta diversi vantaggi come la misurazione simultanea su più tessuti e non richiede complicate analisi dei dati, i metodi di rilevamento ottico consentono la misurazione simultanea di metriche fisiologiche come il flusso di calcio o la mappatura della tensione. Tuttavia, set di dati come quelli illustrati nella sezione dei risultati dimostrano l'ampiezza delle applicazioni che questa tecnologia ha nello spazio di sviluppo di farmaci. Dato che pochi test sul mercato offrono i mezzi per eseguire una valutazione diretta della produzione contrattile nel muscolo ingegnerizzato, questi metodi hanno il potenziale per rivoluzionare la pipeline di sviluppo preclinico.

I modelli di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) stanno diventando sempre più attori chiave nella pipeline preclinica per la scoperta e lo sviluppo terapeutico, nonché nella ricerca biologica di base e nella modellizzazione delle malattie 1,2,3,4,5. I tessuti contrattili, come il muscolo cardiaco e scheletrico derivati da iPSCs hanno un grande potenziale per migliorare il potere predittivo degli studi umani in vitro poiché la valutazione diretta della forza contrattile muscolare e della cinetica sono metriche quantitative per studiare la funzione complessiva del tessuto 4,6,7,8. Tipicamente, le misure della forza contrattile sono state ottenute indirettamente mediante tracciamento ottico della deflessione del substrato 9,10 o direttamente mediante l'attacco di cellule/tessuti ad un trasduttore di forza4,11,12. Questi metodi, sebbene accurati, sono intrinsecamente a basso throughput e in genere richiedono operatori altamente qualificati per raccogliere e analizzare i dati.
Lavori precedenti hanno dimostrato che il rilevamento del campo magnetico aggira questi ostacoli e fornisce un metodo alternativo per valutare la funzione muscolare ingegnerizzata simultaneamente attraverso più costrutti tissutali13. La piattaforma di contrattilità 3D Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) si basa su questa tecnologia utilizzando un dispositivo in grado di misurare la contrattilità dei tessuti muscolari ingegnerizzati in modo altamente parallelo che sfrutta la complessità dei modelli cellulari 3D con screening a più alto rendimento14. La piattaforma consente il monitoraggio senza etichetta, quantitativo e in tempo reale della funzione contrattile nei tessuti muscolari cardiaci e scheletrici all'interno o all'esterno di un incubatore di coltura cellulare standard, eliminando la necessità di imaging e analisi contrattile basati su ottica. Questa tecnologia facilita il confronto diretto di linee cellulari sane e malate e consente di misurare l'effetto di un farmaco sui tessuti contrattili, stabilendo dati quantificabili, in vitro, di sicurezza ed efficacia per composti terapeutici nuovi ed esistenti.
I tessuti muscolari 3D ingegnerizzati possono essere fabbricati tra due pali in modo altamente riproducibile utilizzando la piastra di colata a 24 pozzetti con consumabile Mantarray (Figura 1). Un palo è rigido, mentre l'altro palo è flessibile e contiene un piccolo magnete. Quando il costrutto di tessuto si contrae, sposta il palo flessibile e il magnete incorporato. La piastra EMT è posizionata all'interno dello strumento e lo spostamento del palo viene misurato tramite una serie di sensori magnetici su un circuito stampato sotto il supporto della piastra. I cambiamenti misurati nel campo magnetico vengono convertiti in forza contrattile assoluta utilizzando un algoritmo matematico. Lo strumento impiega rapide frequenze di campionamento dei dati per consentire la raccolta di informazioni dettagliate sulla capacità funzionale e la maturità del tipo o dei tipi di cellule da analizzare, tra cui frequenza di contrazione, velocità e tempo di decadimento. Queste misurazioni funzionali possono essere ottenute su tutti i 24 pozzetti contemporaneamente alla piattaforma di rilevamento magnetico o singolarmente e sequenzialmente utilizzando metodi ottici tradizionali.
Questo studio descrive un metodo altamente riproducibile per l'ingegneria del muscolo scheletrico 3D e dei microtessuti cardiaci in un idrogel a base di fibrina. Durante una breve reazione di 80 minuti, la trombina catalizza la conversione del fibrinogeno in fibrina, fornendo un'impalcatura per lo sviluppo delle cellule muscolari in coltura sospesa15. Le cellule stromali aiutano a rimodellare la matrice e i tessuti diventano contrattili mentre le cellule muscolari formano un sincizio all'interno dell'idrogel. La contrattilità di questi tessuti è stata analizzata utilizzando l'approccio del rilevamento magnetico, sia prima che dopo l'esposizione al composto, convalidando questa modalità per l'uso negli studi farmacologici dose-risposta. I mioblasti umani primari da una biopsia di donatore sano sono stati ottenuti commercialmente e coltivati in 2D secondo i protocolli del fornitore. Le cellule sono state espanse utilizzando un mezzo di crescita muscolare scheletrico attraverso tre passaggi per generare un numero di cellule sufficiente per fabbricare tessuti 3D. Le cellule stromali e i cardiomiociti derivati da hiPSC sono stati coltivati secondo il protocollo del fornitore per 3 giorni per consentire il recupero dalla crioconservazione prima di lanciare le cellule nei tessuti. Vengono forniti risultati rappresentativi che illustrano i tipi di set di dati che possono essere raccolti utilizzando la piattaforma di rilevamento magnetico. Vengono inoltre affrontate le insidie comuni associate alla generazione di tessuti ingegnerizzati utilizzando questi metodi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

La modellazione accurata delle condizioni di salute e di malattia in vitro è vitale per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento e terapie. Per le malattie cardiache e del muscolo scheletrico, la forza contrattile e la cinetica costituiscono metriche chiave per valutare la funzione muscolare. Metodi nuovi e migliorati per generare tessuti muscolari ingegnerizzati (EMT) da cellule staminali pluripotenti indotte hanno reso la modellizzazione della malattia in vitro più affidabile per i tessuti contrattili; Tuttavia, fabbricare in modo riproducibile tessuti da colture cellulari sospese e misurare la loro contrattilità è impegnativo. Tali tecniche sono spesso afflitte da alti tassi di guasto e richiedono strumentazione complessa e routine di analisi dei dati personalizzate. Una nuova piattaforma e un nuovo dispositivo che utilizza EMT 3D in combinazione con un test di contrattilità senza etichetta, altamente parallelo e compatibile con l'automazione aggirano molti di questi ostacoli. La piattaforma consente la fabbricazione semplice e riproducibile di EMT 3D utilizzando praticamente qualsiasi sorgente cellulare. La contrattilità tissutale viene quindi misurata tramite uno strumento che misura simultaneamente 24 tessuti senza la necessità di complesse routine di analisi software. Lo strumento può misurare in modo affidabile i cambiamenti di forza del micronewton, consentendo lo screening dei composti dose-dipendenti per misurare l'effetto di un farmaco o di una terapia sulla produzione contrattile. I tessuti ingegnerizzati realizzati con questo dispositivo sono perfettamente funzionanti, generano contrazioni e contrazioni tetaniche sulla stimolazione elettrica e possono essere analizzati longitudinalmente in coltura per settimane o mesi. Qui, mostriamo i dati degli EMT del muscolo cardiaco sotto dosaggio acuto e cronico con sostanze tossiche note, incluso un farmaco (BMS-986094) che è stato estratto dagli studi clinici dopo decessi dei pazienti a causa di cardiotossicità imprevista. Viene inoltre presentata l'alterata funzione del muscolo scheletrico nei tessuti ingegnerizzati in risposta al trattamento con un inibitore della miosina. Questa piattaforma consente al ricercatore di integrare sistemi modello bioingegnerizzati complessi e ricchi di informazioni nel proprio flusso di lavoro di scoperta di farmaci con una formazione o competenze aggiuntive minime richieste.

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Questo protocollo fornisce metodi per generare tessuti muscolari cardiaci e scheletrici ingegnerizzati in 3D e descrive il loro uso nelle modalità di screening preclinico dei farmaci. I metodi descritti utilizzano un sistema di rilevamento magnetico per facilitare la valutazione simultanea di 24 tessuti in parallelo.

Test preclinici di farmaci in tessuti muscolari ingegnerizzati 3D scalabili

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

La nostra piattaforma utilizza tessuti muscolari ingegnerizzati 3D e hardware di rilevamento magnetico per misurare la contrattilità su 24 pozzetti contemporaneamente. Ciò fornisce un metodo di produttività più elevato per valutare nuove terapie in vitro utilizzando tessuti muscolari umani. Il nostro metodo di fusione migliora la coerenza e la riproducibilità nella fabbricazione di tessuti muscolari ingegnerizzati in 3D.Abbiamo progettato una piastra di colata consumabile a 24 pozzetti dotata di hardware di rilevamento magnetico per misurazioni e analisi della contrattilità sulla nostra piattaforma. Questo metodo può fornire preziose informazioni sulla modellizzazione in vitro della malattia, sulla scoperta di farmaci e sulla terapia genica per qualsiasi malattia muscolare che colpisce la contrattilità. Attualmente stiamo incorporando i motoneuroni nei nostri costrutti 3D per creare anche un modello di giunzione neuromuscolare.Per iniziare, posizionare un kit di fusione di tessuto pre-refrigerato su un blocco freddo o ghiaccio all'interno del cappuccio di coltura cellulare. Appoggiare la piastra di colata piatta sul ghiaccio. Aggiungere trombina al mezzo di base per ottenere la soluzione di trombina e spostare il reticolo post dalla piastra di colata a una nuova piastra sterile a 24 pozzetti.Pipettare 50 microlitri di soluzione di trombina in ciascun pozzetto pre-raffreddato della piastra di colata e riposizionare il reticolo sul kit. Mettere da parte il kit di fusione sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 500 millilitri di mezzo RPMI, 10 millilitri di B27 e 2,5 grammi di acido aminocaproico, o ACA, per preparare il mezzo EMT cardiaco.Estrarre il mezzo EMT che verrà utilizzato per lanciare i tessuti e aggiungere 10 inibitori micromolari ROCK ad esso. Preparare il mezzo EMT scheletrico aggiungendo 50 millilitri di terreno F10 e 0,25 grammi di acido aminocaproico, o ACA, per i mioblasti primari. Utilizzare 0,1 grammi di ACA per mioblasti derivati da IPSC.Quindi, filtrare sterile il mezzo di colata contenente ACA. Riscaldare il reagente di dissociazione di grado di coltura cellulare e un volume uguale di EMT medio a 37 gradi Celsius. Questo mezzo EMT riscaldato sarà utilizzato per diluire il reagente di dissociazione.Lavare le cellule con PBS e aggiungere il reagente di dissociazione riscaldato per sollevare le cellule. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando le cellule si sono sollevate e controllare le colture ogni due o tre minuti toccando il lato della piastra. Una volta che le cellule si sono sollevate, trasferirle in un tubo conico da 50 millilitri.Triturare con una pipetta P-1000 per garantire una sospensione a cella singola. Lavare la piastra e il pallone con un ulteriore mezzo EMT per raccogliere le celle rimanenti e aggiungerle al tubo conico. Ancora una volta, triturare le cellule per garantire una sospensione a singola cellula.Aggiungere il mezzo EMT per terminare il processo di dissociazione e quindi prelevare campioni delle sospensioni cellulari per la conta cellulare. Eseguire la conta delle cellule utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro in tripano blu. Ruotare le cellule a 200 G per quattro minuti, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in cinque millilitri del mezzo base EMT per rimuovere il reagente di dissociazione residuo.Dopo aver centrifugato nuovamente per quattro minuti, aspirare il surnatante e preparare le sospensioni cellulari alle densità appropriate. Calcolare i volumi di ciascuna soluzione cellulare necessaria per comporre il numero desiderato di tessuti e pipettare i volumi calcolati di cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere 10 microlitri di fibrinogeno per EMT alla sospensione cellulare e posizionarla sul ghiaccio.Assicurarsi che ogni EMT abbia 90 microlitri di sospensione cellulare, 10 microlitri di fibrinogeno e 50 microlitri di soluzione di trombina nel costrutto tissutale finale. In una cappa di coltura cellulare, rimuovere il coperchio del kit di fusione del tessuto e posizionare la piastra di colata con il reticolo post disteso sul ghiaccio. Mescolare la miscela di fibrinogeno cellulare e aspirare 100 microlitri con una pipetta P-200.Aggiungere 100 microlitri della miscela ai pozzetti preparati con 50 microlitri di soluzione di trombina e triturare cinque volte per mescolare bene. Non spingere la pipetta oltre il primo stop e rimuovere la punta dopo la triturazione per evitare di creare bolle. Mescolare la sospensione cellulare nel tubo conico prima di colare ogni tessuto.Tenere contemporaneamente il reticolo e la piastra del pozzo di lancio usando il dito puntatore e il pollice di una mano per evitare qualsiasi movimento del reticolo o lasciare la piastra piatta sul ghiaccio e scuotere il secchiello del ghiaccio per vedere nella piastra di fusione. Ripetere con una punta P-200 fresca per ogni tessuto fino a quando tutti i tessuti sono fusi. Trasferire con cura il kit seminato nell'incubatore e incubare a 37 gradi Celsius per 80 minuti.Quindi, preparare una piastra fresca a 24 pozzetti con due millilitri per pozzetto del mezzo EMT per i tessuti cardiaci e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per riscaldare il mezzo. Dopo l'incubazione di 80 minuti, aggiungere delicatamente un millilitro di mezzo EMT sul bordo dei pozzetti di colata e incubare per altri 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti di incubazione, sollevare con attenzione il reticolo post e trasferire i tessuti dalla piastra di colata a una piastra a 24 pozzetti preparata con il mezzo riscaldato.Infine, riportare le piastre con i tessuti all'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius. La produzione di EMT infruttuosa può variare da guasti catastrofici come il distacco del tessuto dai pali, a difetti strutturali più sottili come bolle d'aria e deposizione di tessuto diseguale attorno a entrambi i pali. Il costrutto EMT un giorno dopo il casting è mostrato qui.I tessuti muscolari scheletrici sono stati trasferiti in un mezzo di differenziazione a partire dal giorno zero della fusione cellulare e della compattazione dell'idrogel. Dal settimo giorno al giorno 28, lo stesso EMT ha mostrato una lunghezza complessiva leggermente più corta tra i due pali e una larghezza minore se misurata attraverso la sezione centrale dell'EMT. Quattro piastre di tessuti sono state monitorate per 21 giorni confrontando il diametro EMT durante la compattazione.I punti temporali mostrano dimensioni EMT coerenti tra le piastre. La compattazione massima viene raggiunta il giorno 21 quando il rimodellamento della matrice viene stabilizzato. L'immunoistochimica degli EMT è raffigurata qui.Gli EMT sono stati fissati il giorno 10 della cultura e incorporati nella paraffina. Le sezioni trasversali sottili sono state colorate con anticorpi contro la catena pesante della miosina e la distrofina prima dell'imaging. Queste immagini grafiche rappresentano la forza di contrazione assoluta media misurata dagli EMT cardiaci e dagli EMT scheletrici nel tempo.Il trattamento con doxorubicina acuta e cronica nei tessuti cardiaci ingegnerizzati è mostrato qui. Tre diverse concentrazioni di dose di Dox sono state somministrate in bolo o somministrate continuamente ai tessuti cardiaci ingegnerizzati nel corso di 27 giorni. La risposta alla dose di BDM nei tessuti muscolari scheletrici ingegnerizzati è presentata in questa figura.La frequenza del battito cardiaco o la frequenza delle contrazioni cessa in modo dose-dipendente in tandem con una cessazione della forza contrattile che indica cardiotossicità quando gli EMT sono esposti a questo composto. Le cose più importanti da ricordare quando si colano i tessuti sono di mantenere tutto freddo in ogni momento, comprese le sospensioni cellulari e i reagenti e di mantenere il reticolo post completamente fermo una volta iniziata la fusione.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Ricerca

Bioingegneria

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

A base di seta-collagene Engineered Modello 3D del tessuto neurale polarizzata

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Un Tessuto 3D combinata Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Polmone tumore per predire l&#39;efficacia della droga in specifici Sfondi mutazionali

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

applicazioni di<em&gt; In Vivo</em&gt; Test funzionale del Topo tibiale anteriore per la valutazione di ingegneria tessutale muscolo scheletrico di riparazione

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Caratterizzazione biomeccanica di morbidi tessuti umani usando una indentazione e prove di trazione

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Analisi standardizzata e scalabile per studiare la germogliazione angiogenica 3D perfusa di cellule endoteliali derivate da iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...