当社のプラットフォームは、3Dエンジニアリングされた筋肉組織と磁気センシングハードウェアを使用して、24ウェルの収縮性を同時に測定します。これにより、ヒトの筋肉組織を用いてin vitroで新しい治療法を評価するためのより高いスループットの方法が提供されます。当社の鋳造方法は、3Dエンジニアリングされた筋肉組織を製造する際の一貫性と再現性を向上させます。
当社のプラットフォームでの収縮性測定と分析のための磁気センシングハードウェアを備えた消耗可能な24ウェル鋳造プレートを設計しました。この方法は、収縮性に影響を与えるあらゆる筋肉疾患のin vitro疾患モデリング、創薬、および遺伝子治療に関する貴重な洞察を提供することができます。現在、運動ニューロンを3Dコンストラクトに組み込み、神経筋接合部モデルも作成しています。
まず、事前に冷却した組織キャストキットを細胞培養フード内のコールドブロックまたは氷に置きます。キャスティングプレートを氷の上に平らに置きます。トロンビンをベース培地に加えてトロンビン溶液を作り、ポスト格子をキャスティングプレートから新しい滅菌24ウェルプレートに移動します。
50マイクロリットルのトロンビン溶液をキャスティングプレートの各プレチルドウェルにピペットで入れ、格子をキットに戻します。キャスティングキットを氷の上に置いておきます。次に、500ミリリットルのRPMI培地、10ミリリットルのB27、および2.5グラムのアミノカプロン酸(ACA)を加えて、心臓EMT培地を調製します。
組織をキャストするために使用されるEMT培地を取り出し、それに10マイクロモルのROCK阻害剤を追加します。初代筋芽細胞用に50ミリリットルのF10培地と0.25グラムのアミノカプロン酸(ACA)を加えて骨格EMT培地を準備します。IPSC由来の筋芽細胞には0.1グラムのACAを使用してください。
次いで、ACAを含む流延媒体を滅菌濾過する。細胞培養グレードの解離試薬と等量のEMT培地を摂氏37度に温めます。この加温されたEMT培地は、解離試薬を希釈するために使用されます。
細胞をPBSで洗浄し、温めた解離試薬を加えて細胞を持ち上げます。摂氏37度で5分間、または細胞が持ち上がるまでインキュベートし、プレートの側面をタップして2〜3分ごとに培養を確認します。細胞が持ち上げられたら、それらを50ミリリットルの円錐形のチューブに移します。
P-1000ピペットで粉砕し、単一細胞懸濁液を確保します。プレートとフラスコを追加のEMT培地で洗浄して残りの細胞を収集し、それらを円錐管に加えます。ここでも、細胞を粉砕して、単一の細胞懸濁液を確保します。
EMT培地を加えて解離プロセスを終了し、細胞数のために細胞懸濁液のサンプルを採取します。自動セルカウンターまたはトリパンブルーの血球計算盤を使用して細胞カウントを実行します。細胞を200 Gで4分間スピンさせ、上清を吸引し、細胞を5ミリリットルのEMTベース培地に再懸濁して、残留解離試薬を除去します。
再度4分間遠心分離した後、上清を吸引し、適切な密度で細胞懸濁液を調製します。所望の数の組織を構成するのに必要な各細胞溶液の体積を計算し、計算された細胞量を15ミリリットルの円錐管にピペットで入れます。EMTあたり10マイクロリットルのフィブリノーゲンを細胞懸濁液に加え、氷の上に置きます。
各EMTの最終組織構築物に90マイクロリットルの細胞懸濁液、10マイクロリットルのフィブリノーゲン、および50マイクロリットルのトロンビン溶液が含まれていることを確認します。細胞培養フードで、組織キャスティングキットの蓋を外し、ポスト格子を氷の上に平らに置いた状態でキャスティングプレートを置きます。細胞フィブリノーゲン混合物を混合し、P-200ピペットで100マイクロリットルを吸引する。
50マイクロリットルのトロンビン溶液で調製したウェルに100マイクロリットルの混合物を加え、5回粉砕してよく混合する。ピペットを最初のストップを超えて押したり、気泡が発生しないように粉砕後にチップを取り外したりしないでください。すべての組織をキャストする前に、コニカルチューブで細胞懸濁液を混合します。
人差し指と片手の親指を使用して格子と鋳造ウェルプレートの両方を同時に保持して格子の動きを避けるか、プレートを氷の上に平らに保ち、氷のバケツを揺り動かして鋳造プレートを覗き込みます。すべての組織がキャストされるまで、各組織に新しいP-200チップで繰り返します。播種したキットを慎重にインキュベーターに移し、摂氏37度で80分間インキュベートします。
次に、心臓組織用のEMT培地を1ウェルあたり2ミリリットル入れた新しい24ウェルプレートを準備し、プレートを摂氏37度でインキュベートして培地を温めます。80分間のインキュベーションの後、1ミリリットルのEMT培地をキャスティングウェルの端に静かに加え、摂氏37度でさらに10分間インキュベートします。10分間のインキュベーションの後、ポスト格子を注意深く持ち上げ、組織をキャスティングプレートから加温した培地で調製した24ウェルプレートに移します。
最後に、組織を入れたプレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターに戻します。EMTの生成の失敗は、支柱からの組織の剥離などの壊滅的な障害から、気泡や両方の支柱の周りの不均等な組織の堆積などのより微妙な構造上の欠陥にまで及ぶ可能性があります。鋳造の翌日のEMTコンストラクトがここに示されています。
骨格筋組織を、細胞融合およびヒドロゲル圧縮のゼロ日目から分化培地に移した。7日目から28日目まで、同じEMTは、EMTの中央部を通して測定すると、2つの支柱間の全長がわずかに短く、幅が狭くなりました。4枚の組織プレートを21日間にわたって追跡し、圧縮全体を通してEMT直径を比較した。
時点は、プレート間で一貫したEMTサイズを示します。マトリックスのリモデリングが安定する21日目に最大圧縮に達します。EMTの免疫組織化学がここに描かれています。
EMTは培養10日目に固定され、パラフィンに包埋されました。薄い断面は、イメージング前にミオシン重鎖およびジストロフィンに対する抗体で染色した。これらのグラフィック画像は、心臓EMTと骨格EMTから経時的に測定された平均絶対けいれん力を表しています。
人工心臓組織における急性および慢性のドキソルビシン治療がここに示されています。Doxの3つの異なる用量濃度が、ボーラスで送達されるか、または27日間にわたって操作された心臓組織に継続的に投与されました。操作された骨格筋組織におけるBDMに対する用量反応をこの図に示します。
心拍数またはけいれん頻度は、EMTがこの化合物にさらされたときに心毒性を示す収縮力の停止と並行して用量依存的に停止します。.組織を鋳造する際に覚えておくべき最も重要なことは、細胞懸濁液や試薬を含むすべてを常に冷たく保ち、鋳造が開始されたらポスト格子を完全に静止させることです。
