Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av finansiering fra Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 tildelt Health and Environmental Sciences Institute) og ved finansiering fra National Institutes of Health (HL151094 til Dr. Geisse). Vi takker Dr. Alec S. T. Smith for hans hjelp med utarbeidelsen av dette manuskriptet.

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 150 (2013).</li><li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+density+on+the+maturation+and+contractile+ability+of+muscle+derived+cells+in+a+3D+tissue-engineered+skeletal+muscle+model+and+determination+of+the+cellular+and+mechanical+stimuli+required+for+the+synthesis+of+a+postural+phenotype.">The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype.</a> Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+skeletal+muscle+capable+of+functional+regeneration.">Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration.</a> BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10, 6918 (2020).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics.">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li><li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle.">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle &amp; Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+force+and+frequency+analysis+of+engineered+human+heart+tissue+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+using+magnetic+sensing.">Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing.</a> Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).</li><li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+real-time+monitoring+of+engineered+skeletal+muscle+function+using+magnetic+sensing.">High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing.</a> bioRxiv. , 492879 (2022).</li><li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thrombin-fibrinogen+interaction.">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li><li>Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin:+the+good,+the+bad+and+the+ugly+effect.">Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect.</a> Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).</li><li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+dysfunction+associated+with+a+nucleotide+polymerase+inhibitor+for+treatment+of+hepatitis+C.">Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C.</a> Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).</li><li>Gill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+cover:+Investigative+nonclinical+cardiovascular+safety+and+toxicology+studies+with+BMS-986094,+an+NS5b+RNA-dependent+RNA+polymerase+inhibitor.">From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor.</a> Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).</li><li>Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3-Butanedione+monoxime+(BDM)+as+a+myosin+inhibitor.">2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).</li><li>Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralysis+of+skeletal+muscle+by+butanedione+monoxime,+a+chemical+phosphatase.">Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+tissue+engineered+skeletal+muscle+in+vitro+is+dependent+on+the+inclusion+of+basement+membrane+proteins.">Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins.</a> Cytoskeleton. 76 (6), 371-382 (2019).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Alle forfattere er ansatte og egenkapitaleiere i Curi Bio Inc., selskapet som kommersialiserer Mantarray-maskinvaren og tilhørende programvare.

Denne studien beskriver metoder for å generere 3D-konstruert hjerte- og skjelettmuskulaturvev i et 24-brønns forbrukssett. Ved å følge disse metodene er det mulig å konsekvent oppnå et komplett utvalg av 24 vev uten støpefeil for påfølgende legemiddelscreening. Kritiske hensyn for å oppnå et slikt resultat er å sikre at under støping utføres alle trinnene på is for å forhindre for tidlig polymerisering av hydrogelene, fjerning av celledissosiasjonsreagens før vevstøping, grundig blanding av cellen og hydrogelsuspensjonen for hvert vev, utskifting av pipettespisser mellom vev og bruk av varmeinaktivert FBS (hvis det brukes i det hele tatt). Det er også viktig å sikre at stolpegitteret ikke flyttes når støpingen starter og overføres forsiktig når hydrogeler har dannet seg.
Store modifikasjoner inkluderer bruk av forskjellige celletyper for å oppnå hjerte versus skjelett-EMT og doping av hydrogeler med variable konsentrasjoner av kjellermembranproteiner for å fremme cellulær modning og vevsstabilitet. De gunstige effektene av slik doping må testes i hvert enkelt tilfelle, men har vist seg å forbedre funksjonelle utfall og vevets levetid under visse omstendigheter14,16,22. Det er også bemerkelsesverdig at celletetthetene som er oppført, er en veiledning og kanskje må optimaliseres for forskjellige cellelinjer. Alternative hydrogelsammensetninger kan også betraktes som et middel til å modifisere de strukturelle og funksjonelle egenskapene til de oppnådde EMTene23,24,25. Det opprinnelige muskelmikromiljøet inneholder også støttende celletyper for å fremme vaskularisering, innervering og matriksavsetning for å støtte myocytter i form og funksjon26,27. Mens systemet beskrevet her for tiden inkorporerer fibroblaster i 3D-hjertevev, kan flere celletyper skape en mer fysiologisk relevant modell for å studere sikkerheten og effekten av terapeutiske forbindelser in vitro. Tidligere har en rekke støttende celletyper blitt integrert i 3D-konstruerte vev som presenterer en spennende mal for fremtidig studie ved hjelp av magnetisk sensing kontraktilitetsplattform28,29,30.
Feilsøking for denne protokollen fokuserer på dannelsen av upålitelige eller inkonsekvente vev under støpeprosessen. Det må utvises forsiktighet for å unngå bobledannelse i hydrogelene ettersom de støpes, samtidig som det letter jevn fordeling av cellene under blanding. Optimaliseringseksperimenter vil trolig være nødvendig for hver ny celletype for å identifisere ideelle celletettheter, celleforhold og matrisesammensetning.
En stor begrensning for denne teknikken er det betydelige antallet celler som kreves for å etablere en full plate med 24 EMT. For dataene som presenteres her, ble det brukt 15 millioner kardiomyocytter og 18 millioner skjelettmyoblaster per plate. Enkelte forskere har kanskje ikke tilgang til så store bassenger av cellulært materiale, noe som kan hemme deres evne til å bruke denne plattformen i sin fulle utstrekning. Hvis sluttbrukere ikke har tilgang til magnetisk sensormaskinvare, må målinger av etteravbøyninger utføres optisk, noe som reduserer gjennomstrømningen betydelig og forhindrer samtidig registrering av muskelkontraksjoner over flere brønner. Mantarray-maskinvaren overvinner imidlertid disse begrensningene for å tilby det første kommersielle systemet som er i stand til kontinuerlig, ikke-invasiv analyse av EMT-sammentrekning samtidig på tvers av flere konstruksjoner.
Magnetisk sensing over 24 brønner muliggjør langsgående studier av EMT-funksjonell utvikling i sanntid og muliggjør nøyaktig måling av akutte responser på kjemisk, miljømessig eller genetisk manipulasjon. Mens magnetisk sensing har flere fordeler, for eksempel samtidig måling over flere vev, og ikke krever komplisert dataanalyse, muliggjør optiske deteksjonsmetoder samtidig måling av fysiologiske beregninger som kalsiumfluks eller spenningskartlegging. Imidlertid viser datasett som de som er illustrert i resultatseksjonen bredden av applikasjoner denne teknologien har i stoffutviklingsområdet. Gitt at få analyser på markedet gir midler til å utføre en direkte vurdering av kontraktil produksjon i konstruert muskel, holder disse metodene potensialet til å revolusjonere den prekliniske utviklingsrørledningen.

Induserte pluripotente stamcellemodeller (iPSC) blir i økende grad sentrale aktører i den prekliniske rørledningen for terapeutisk oppdagelse og utvikling, samt grunnleggende biologisk forskning og sykdomsmodellering 1,2,3,4,5. Kontraktilt vev, som hjerte- og skjelettmuskulatur avledet fra iPSCs, har stort potensial for å forbedre den prediktive kraften til humane in vitro-studier, da direkte vurdering av muskelkontraktil kraft og kinetikk er kvantitative beregninger for å studere total vevsfunksjon 4,6,7,8. Vanligvis har målinger av kontraktil kraft blitt oppnådd enten indirekte ved optisk sporing av substratavbøyning 9,10 eller direkte ved festing av celler / vev til en krafttransduser4,11,12. Disse metodene, selv om de er nøyaktige, har iboende lav gjennomstrømning og krever vanligvis dyktige operatører for å samle inn og analysere data.
Tidligere arbeid har vist at magnetfeltføling omgår disse hindringene og gir en alternativ metode for å vurdere konstruert muskelfunksjon samtidig over flere vevskonstruksjoner13. Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bygger på denne teknologien ved hjelp av en enhet som er i stand til å måle kontraktiliteten til konstruerte muskelvev på en svært parallell måte som utnytter kompleksiteten til 3D-cellulære modeller med høyere gjennomstrømningsscreening14. Plattformen muliggjør etikettfri, kvantitativ, sanntidsovervåking av kontraktil funksjon i hjerte- og skjelettmuskulaturvev i eller utenfor en standard cellekulturinkubator, og eliminerer behovet for optisk-basert kontraktil avbildning og analyse. Denne teknologien muliggjør direkte sammenligning av friske og syke cellelinjer og muliggjør måling av et legemiddels effekt på kontraktilt vev, etablering av kvantifiserbare, in vitro, sikkerhets- og effektdata for nye og eksisterende terapeutiske forbindelser.
Konstruert 3D-muskelvev kan fremstilles mellom to stolper på en svært reproduserbar måte ved hjelp av Mantarray forbruksvare, 24-brønns støpeplate (figur 1). Det ene innlegget er stivt, mens det andre innlegget er fleksibelt og inneholder en liten magnet. Når vevskonstruksjonen trekker seg sammen, fortrenger den den fleksible stolpen og den innebygde magneten. EMT-platen er plassert i instrumentet, og etter forskyvning måles via en rekke magnetiske sensorer på et kretskort under plateholderen. De målte endringene i magnetfeltet omdannes til absolutt kontraktil kraft ved hjelp av en matematisk algoritme. Instrumentet benytter raske datasamplingshastigheter for å muliggjøre innsamling av detaljert informasjon om funksjonell kapasitet og modenhet av celletypen (e) som analyseres, inkludert sammentrekningsfrekvens, hastighet og forfallstid. Disse funksjonelle målingene kan oppnås på tvers av alle 24 brønner samtidig med magnetisk sensorplattform eller individuelt og sekvensielt ved hjelp av tradisjonelle optiske metoder.
Denne studien beskriver en svært reproduserbar metode for engineering 3D skjelettmuskulatur og hjerte mikrovev i en fibrinbasert hydrogel. Under en kort, 80-minutters reaksjon katalyserer trombin omdannelsen av fibrinogen til fibrin, og gir et stillas for muskelceller å utvikle seg i suspendert kultur15. Stromale celler hjelper til med å omforme matrisen og vev blir kontraktile ettersom muskelceller danner et syncytium i hydrogelen. Kontraktiliteten til disse vevene ble analysert ved hjelp av magnetisk sensing-tilnærming, både før og etter sammensatt eksponering, og validerte denne modaliteten for bruk i dose-respons-legemiddelstudier. Primære humane myoblaster fra en frisk donorbiopsi ble oppnådd kommersielt og dyrket i 2D i henhold til leverandørens protokoller. Celler ble utvidet ved hjelp av et skjelettmuskulaturvekstmedium gjennom tre passasjer for å generere tilstrekkelige cellenumre til å fremstille 3D-vev. Stromale celler og hiPSC-avledede kardiomyocytter ble dyrket i henhold til leverandørens protokoll i 3 dager for å tillate utvinning fra kryopreservering før støping av celler i vev. Representative resultater er gitt som illustrerer hvilke typer datasett som kan samles inn ved hjelp av magnetisk sensorplattform. Vanlige fallgruver forbundet med generering av konstruerte vev ved hjelp av disse metodene blir også adressert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

Nøyaktig modellering av friske og sykdomstilstander in vitro er avgjørende for utviklingen av nye behandlingsstrategier og terapier. For hjerte- og skjelettmuskelsykdommer utgjør kontraktil kraft og kinetikk nøkkeltall for vurdering av muskelfunksjon. Nye og forbedrede metoder for å generere konstruerte muskelvev (EMT) fra induserte pluripotente stamceller har gjort in vitro sykdomsmodellering mer pålitelig for kontraktilt vev; Imidlertid er reproduserbar fremstilling av vev fra suspenderte cellekulturer og måling av kontraktiliteten utfordrende. Slike teknikker er ofte plaget med høye feilrater og krever kompleks instrumentering og tilpassede dataanalyserutiner. En ny plattform og enhet som bruker 3D-EMT-er sammen med en etikettfri, svært parallell og automatiseringsvennlig kontraktilitetsanalyse omgår mange av disse hindringene. Plattformen muliggjør enkel og reproduserbar fabrikasjon av 3D-EMT-er ved bruk av praktisk talt alle cellekilder. Vevskontraktilitet måles deretter via et instrument som samtidig måler 24 vev uten behov for komplekse programvareanalyserutiner. Instrumentet kan på en pålitelig måte måle mikronewtonendringer i kraft, noe som muliggjør doseavhengig sammensatt screening for å måle effekten av et legemiddel eller terapeutisk på kontraktil utgang. Konstruerte vev laget med denne enheten er fullt funksjonelle, genererer rykninger og tetaniske sammentrekninger ved elektrisk stimulering, og kan analyseres i lengderetningen i kultur over uker eller måneder. Her viser vi data fra hjertemuskel-EMT under akutt og kronisk dosering med kjente toksiske stoffer, inkludert et legemiddel (BMS-986094) som ble trukket fra kliniske studier etter pasientdødsfall på grunn av uventet kardiotoksisitet. Endret skjelettmuskulaturfunksjon i konstruert vev som respons på behandling med en myosinhemmer presenteres også. Denne plattformen gjør det mulig for forskeren å integrere komplekse, informasjonsrike bioengineered modellsystemer i deres arbeidsflyt for narkotikaforskning med minimal tilleggsopplæring eller ferdigheter som kreves.

Celler ble støpt inn i konstruert muskelvev i 2-post forbruksplaten (figur 1). Vellykkede EMT-er vil virke ensartede, og matrisen vil være jevnt fordelt mellom innleggene (figur 2A). Matrisen skal også vikle seg rundt begge stolpene, og produsere ekvivalente ankerpunkter for vevet. Feil i støping er sjeldne med denne metoden og er vanligvis åpenbare med en visuell inspeksjon. Mislykket EMT-produksjon kan variere fra katastrofale feil, for eksempel vevsavløsning fra stolpene (figur 2B) til mer subtile strukturelle feil, for eksempel luftbobler og løs festing til stolpene (figur 2C, D). Vev med mindre feil kan fortsatt være levedyktige, men dataene fra disse vevene bør undersøkes nøye for å sikre at det er sammenlignbart med kompromissløse EMT. For eksempel kan luftbobler i en EMT presses ut når vevet komprimeres over tid, noe som gir en fullt funksjonell konstruksjon uten kontraktile mangler. Disse vevene må imidlertid vurderes i hvert enkelt tilfelle, da plasseringen av luftboblene kan påvirke funksjonell restitusjon. Luftbobler generert på innleggene, for eksempel, kan påvirke vevsfeste, noe som kan hindre langvarig overholdelse av innlegget.
Vev begynner å komprimere i løpet av de første 24 timene når celler ombygger matrisen i hydrogelen (figur 3). Komprimering er en gradvis prosess og fortsetter vanligvis i løpet av de første 2-4 ukene av kulturen. Samlet sett er vevskomprimering konsistent mellom tekniske og biologiske replikater (figur 4). Det er normalt for noen cellelinjer å komprimere matrisen mer enn andre ettersom vev modnes over tid. Prosentandelen av myogene celler i en konstruksjon påvirker hastigheten og den totale graden av EMT-komprimering. Totalt myogent innhold for både hjerte- og skjelettmuskelcellelinjer bør være over 80% for å minimere variasjon mellom konstruerte vev. Dette er spesielt viktig når man sammenligner kontraktile krefter og kinetikk på tvers av cellelinjer.
I løpet av de første dagene etter støping begynner kardiomyocytter å spontant slå i kultur, rytmisk bøye det fleksible innlegget med hver muskelkontraksjon. Skjelettmuskelkonstruksjoner trekker seg sammen som respons på elektrisk stimulering innen dag 7 etter start av differensiering. Feltstimulering ble påført skjelettmuskulaturvev via en ekstern stimulator festet til et tilpasset 24-brønns elektrodelokk. Lokket, produsert med et par karbonelektroder for hver brønn, sitter på toppen av den 24-brønns platen av vev, samtidig som hver EMT stimulerer til å indusere muskelkontraksjoner. Vev ble tempoet ved hjelp av en 10 V stimulus for 10 ms pulsvarighet ved 1 Hz under funksjonelle målinger. Kontraktile vev indikerer skjelettmyoblaster som har smeltet, danner myorør komplett med funksjonelle sarkomerer og kontraktilt maskineri. Skjelett-EMT er flekkpositivt for myosin heavy chain (MyHC) og dystrofin er lokalisert til myotubemembranen, og viser en klassisk ringform i tverrsnitts immunhistokjemisk analyse (figur 5). Når EMT er funksjonelt, kan kontraktilitet måles daglig i magnetisk sensorinstrument, sporingskraft og kinetikk etter hvert som konstruksjonene utvikles og modnes over tid. Både hjerte- og skjelettmuskelvev forblir kontraktilt i uker til måneder i 3D-kultur (figur 6), og de kan brukes til et bredt spekter av kontraktilitetsstudier.
Den magnetiske deteksjonsmetoden kan brukes til samtidig å måle akutte og kroniske effekter av strukturelle kardiotoksiske stoffer, som doksorubicin (figur 7) og BMS-986094 (figur 8), samt andre legemidler som påvirker muskelkontraktiliteten. Optiske sporingsmetoder for kontraksjonsdeteksjon kan også brukes, men man må være forsiktig når man studerer akutte legemiddeleffekter, da målinger må tas sekvensielt. Den forlengede levetiden til hjerte- og skjelett-EMT i 3D-kultur muliggjør langsiktige legemiddelstudier i disse vevene. Dette tillater brukere å utforske effekten av gjentatt dosering, samt vedvarende, langsiktig eksponering for forbindelser som kan vise kardiotoksiske effekter over tid som forekommer med doksorubicin. Doksorubicin (dox) er et anti-kreft kjemoterapi stoff17. Mengden medikament administrert til pasienter varierer, avhengig av type kreft, pasientens alder, pasientens høyde og vekt, samt andre faktorer. Av denne grunn er det viktig å teste effekten av dox over et bredt spekter av konsentrasjoner og leveringsplaner. Her ble hjerte-EMT behandlet i løpet av 27 dager med tre separate konsentrasjoner (0,1 μM, 1 μM og 10 μM) dox (figur 7). Gruppene ble stratifisert videre ved å behandle EMT ved hver konsentrasjon med enten bolusbehandling eller kontinuerlig administrering med middels endring hver 72. time. Wells som fikk bolusbehandlinger av dox ble eksponert for stoffet ved tre separate tidspunkter, noe som muliggjorde gjenoppretting mellom dosering. De to høyeste dosene med bolus og kontinuerlig eksponering viste en umiddelbar og langvarig opphør av kontraktil kraftgenerering gjennom hele studien. Den midtre og laveste konsentrasjonen hadde varierende effekter på vevet, avhengig av administrasjonsmetode. I den laveste konsentrasjonen av legemidlet viste bolusgruppen ingen forskjell fra kontrollene. Kontraktilkraften ble imidlertid redusert etter 2 uker med kontinuerlig eksponering. Den midtre konsentrasjonen av stoffet hadde en interessant effekt. Mens kontinuerlig dosering reduserte kraften i løpet av de første par dagene av behandlingen og varte gjennom hele forsøket, viste bolusgruppen en gjenoppretting av kontraktil kraft tilbake til kontrollnivåer når legemidlet ble vasket ut etter 3 dager. Den andre bolusen av legemidlet forårsaket imidlertid full opphør av kraft, etterfulgt av ingen utvinning (figur 7), noe som indikerer at gjentatt dosering ved denne konsentrasjonen kan ha en kardiotoksisk effekt hos pasienter behandlet med dette legemidlet. Det brede omfanget av denne studien, både i tid og eksperimentelle forhold, fremhever bruken av 3D-konstruerte vev i toksisitetsscreening, da de forblir kontraktile og reagerer på kjemisk eksponering over lengre perioder, noe som muliggjør langsiktige legemiddelstudier innenfor et enkelt sett med muskelvev. Dette gjør det ikke bare mulig å identifisere forbindelser som kan ha en kardiotoksisk effekt ved kronisk eksponering, men også å oppdage potensiell kardiotoksisk administreringstid.
In vitro toksisitetstesting i konstruert humant muskelvev er en måte å bidra til å holde menneskelige pasienter trygge i kliniske studier. BMS-986094 er en nukleotidpolymerase (NS5B) hemmer som brukes til å behandle hepatitt C. Legemidlet var i fase II klinisk utvikling da Bristol-Myers Squibb avsluttet utviklingen på grunn av flere tilfeller av uventet hjertesvikt hos pasienter18,19. Her ble BMS-986094 brukt på hjerte-EMT for å teste om 3D-konstruert muskelvev ville utvikle en kardiotoksisk reaksjon på stoffet (figur 8). Tre forskjellige konsentrasjoner av stoffet ble påført, og vev ble overvåket over 13 dager. Kontraktil kraft falt med tillegg av legemidlet på en doseavhengig måte (figur 8A). Twitch-frekvensen ble også signifikant påvirket da slagfrekvensen avtok og til slutt stoppet som forventet med fortsatt eksponering for kardiotoksisk forbindelse (p < 0,05, figur 8B). Disse resultatene demonstrerer hvordan 3D-konstruerte menneskelige muskelvev kan brukes til å lette å bringe nye stoffer til markedet og flagge forbindelser som til slutt mislykkes på grunn av kardiotoksisitet. Videre kan denne teknologien potensielt redde liv ved å eksponere farlige stoffer før de blir satt inn i pasienter i kliniske studier.
Evnen til å måle effekten av akutte og kronisk påførte legemidler på humant kontraktilt vev er et viktig første skritt når man undersøker terapi for sikkerhet og effekt. Det er imidlertid viktig å vite at konsentrasjonen av legemidler som anvendes er fysiologisk relevant og hensiktsmessig for in vitro-testing . Skjelettmuskelvev ble brukt til å etablere en IC50-verdi for 2,3-butandionmonoksim (BDM) i en full dose-responskurve. Dette stoffet er en godt karakterisert ATPase-hemmer av skjelettmuskulatur myosin-II20. BDM hemmer muskelkontraksjoner ved å forhindre myosin-kryssbrodannelse med aktinfilamentet i sarkomerer21. Resultatene vist her viser en doseavhengig reduksjon i absolutt kraft når legemidlet påføres og fullstendig gjenoppretting av kontraktil kraft når stoffet vaskes ut, noe som indikerer at den forbigående effekten forhindrer muskelkontraksjoner og ikke bare dreper celler i vevet (figur 9A). Videre ble en full dose-responskurve målt over de syv konsentrasjonene som ble undersøkt, og etablerte en IC50 på 3,2 mM i disse humane mikrovevene (figur 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig01.jpg"> Figur 1: EMT-støping i 2-post Mantarray forbruksplate 24-brønn . (A) Myogene og stromale celler ble dyrket på 2D-overflater før vevstøping. (B) Celler løftes fra 2D-overflater og blandes sammen med ekstracellulære matriksproteiner for å danne hydrogeler i de enkelte platestøpebrønnene vist i innfelt. (C) 24-brønns plate som inneholder konstruert vev i hver brønn. (D) Representativt vev som viser avslappet og kontrahert konstruert muskel, sammenligner forskyvning av magnetstolpen (grønne søyler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig02.jpg"> Figur 2: Vellykket og mislykket EMT-støping . (A) Ideelt konstruert muskelvev 24 timer etter støping jevnt komprimert rundt stolpene med homogen celle / matrikssammensetning gjennom hele vevet. (B) Mislykket EMT som viser løsrivelse av hydrogelen fra den fleksible stolpen. (C) EMT som inneholder luftbobler i hele vevet. (D) Ulik vevsavsetning rundt begge innleggene. Vevet er løst forankret til den fleksible stolpen på den ene siden. Skalastenger er 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig03.jpg"> Figur 3: Komprimering i konstruert muskelvev over tid. (A) EMT-konstruksjon vist 1 dag etter støping. Vev overføres til differensieringsmedium, som begynner dag 0 av cellefusjon og hydrogelkomprimering. (VG Nett) Den samme EMT på dag 7 til dag 21 viser en litt kortere total lengde mellom de to stolpene over tid og mindre bredde målt gjennom den midtre delen av EMT. Skalastenger er 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig04.jpg"> Figur 4: EMT-diameter over tid. Fire plater med vev ble sporet over 21 dager, og sammenlignet EMT-diameter gjennom komprimering. Hvert vev ble målt gjennom midtseksjonen hver uke ved hjelp av optisk mikroskopi. Tidspunkter viser konsistent EMT-størrelse mellom platene. Maksimal komprimering nås på dag 21 når matriseombyggingen stabiliseres. Tabellen viser standardavviket (% av totalen) av komprimering innenfor hver plate av vev og gjennomsnittlig avvik for alle platene. Fargede barer er individuelle plater. Feilfelt er SD for EMT-er i plater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig05.jpg"> Figur 5 Immunhistokjemi i konstruert skjelettmuskulatur. EMT ble fiksert på dag 10 av kulturen og innebygd i parafin. Tynne tverrsnitt (7 μm) ble farget med antistoffer mot myosin, tungkjede og dystrofin før bildediagnostikk. Grønn = MyHC, rød = Dystrofin, blå = DAPI. Objektiv forstørrelse er 40X; Skala bar er 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig06.jpg"> Figur 6: Kontraktil kraft i konstruert muskelvev over tid. (A) Gjennomsnittlig absolutt rykningskraft målt fra hjerte-EMT fra dag 7 til dag 63 i kultur; n = 3 per gruppe. (B) Gjennomsnittlig absolutt rykningskraft i skjelett-EMT avledet fra en primær cellelinje på dag 7 til dag 53 i kultur; n = 3. Feilfelt er SD for begge grafene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig07.jpg"> Figur 7 Akutt og kronisk doksorubicinbehandling i konstruert muskelvev. Tre separate dosekonsentrasjoner av dox, 0,1 μM, 1 μM og 10 μM, ble levert enten i bolus eller administrert kontinuerlig til konstruert muskelvev i løpet av 27 dager. Bolusdoser av legemidlet ble tilsatt ved medieendringer på dag 0, 12 og 24, notert av de grønne pilene på X-aksen. Stoffet ble lagt til media ved hver medieendring for kontinuerlig dosering, notert av de svarte og grønne pilene på X-aksen. Den prosentvise endringen i kraft fra utgangsverdier (pre-medikamentell behandling) er på Y-aksen, og tiden i behandlingsdager er på X-aksen. Lys oransje = DMSO kontinuerlig kontroll, mørk oransje = DMSO boluskontroll, lysegrønn = 0,1 μM dox kontinuerlig, mørkegrønn = 0,1 μM dox bolus, lyseblå = 1 μM dox kontinuerlig, mørk blå = 1 μM Dox bolus, lys gul = 10 μM dox kontinuerlig, mørk gul = 10 μM dox bolus. Feilfelt er SD; n = 3 per betingelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig08.jpg"> Figur 8: Kronisk behandling med BMS-986094 i konstruert muskelvev. EMT ble behandlet med 0,4 μM (grønn), 2 μM (mørk blå) og 10 μM (lyseblå) BMS-986094 over 13 dager. (A) Kontraktil rykningskraft (Y-aksen) reduseres ved alle legemiddelkonsentrasjoner de første 2 dagene, mens kontrollvevet i DMSO fortsetter å bli sterkere over tid (X-aksen). (B) Hjerterytmen, eller rykningsfrekvensen, opphører på en doseavhengig måte i takt med opphør av kontraktil kraft vist i graf A. Kontrollvev i DMSO (grå) opprettholder en regelmessig slagfrekvens gjennom hele eksperimentet. Feilfelt er SD; n = 3 per betingelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig09.jpg"> Figur 9: Dose-respons på BDM i konstruert skjelettmuskulatur. (A) Absolutt rykningskraft reduseres på en doseavhengig måte når primære celleavledede EMT blir utsatt for 2,3-butandionmonoksim (BDM) på dag 16 i 3D-kultur. Absolutt rykningskraft går tilbake til nær baseline-verdier når stoffet vaskes ut. (B) Absolutt rykningskraft normalisert til baselineverdier reduseres på en doseavhengig måte når den eksponeres for BDM, noe som gir en full dose-responskurve og IC50-verdi; n = 4 per dose. Feilfelt er SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig09large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Denne protokollen gir metoder for å generere 3D-konstruerte hjerte- og skjelettmuskulaturvev og beskriver deres bruk i prekliniske legemiddelscreeningsmodaliteter. De beskrevne metodene benytter et magnetisk sensorsystem for å lette samtidig vurdering av 24 vev parallelt.

Preklinisk legemiddeltesting i skalerbart 3D-konstruert muskelvev

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Plattformen vår bruker 3D-konstruert muskelvev og magnetisk sensormaskinvare for å måle kontraktilitet på tvers av 24 brønner samtidig. Dette gir en metode med høyere gjennomstrømning for vurdering av nye legemidler in vitro ved bruk av humant muskelvev. Vår støpemetode forbedrer konsistensen og reproduserbarheten ved fremstilling av 3D-konstruerte muskelvev.Vi har designet en forbruksplate med 24 brønner utstyrt med magnetisk sensormaskinvare for kontraktilitetsmålinger og analyse på plattformen vår. Denne metoden kan gi verdifull innsikt i in vitro sykdomsmodellering, legemiddeloppdagelse og genterapi for enhver muskelsykdom som påvirker kontraktilitet. Vi inkorporerer for tiden motorneuroner i våre 3D-konstruksjoner for å skape en nevromuskulær kryssmodell også.For å begynne, plasser et forkjølt vevstøpesett på en kald blokk eller is inne i cellekulturhetten. Legg støpeplaten flatt på is. Legg trombin til basemedium for å lage trombinoppløsningen og flytt stolpegitteret fra støpeplaten til en ny steril 24-brønnsplate.Pipett 50 mikroliter trombinoppløsning i hver forkjølt brønn på støpeplaten og plasser gitteret tilbake på settet. Sett støpesettet til side på is. Deretter tilsettes 500 ml RPMI-medium, 10 ml B27 og 2,5 gram aminokapronsyre, eller ACA, for å forberede hjerte-EMT-mediet.Ta ut EMT-mediet som skal brukes til å støpe vevet og tilsett 10 mikromolar ROCK-hemmer til det. Forbered skjelett-EMT-mediet ved å tilsette 50 ml F10-medium og 0,25 gram aminokapronsyre, eller ACA, for primære myoblaster. Bruk 0,1 gram ACA for IPSC-avledede myoblaster.Deretter filtrerer du det sterile støpemediet som inneholder ACA. Varm dissosiasjonsreagenset i cellekulturklasse og et likt volum EMT-medium til 37 grader Celsius. Dette oppvarmede EMT-mediet vil bli brukt til å fortynne dissosiasjonsreagenset.Vask cellene med PBS og tilsett det oppvarmede dissosiasjonsreagenset for å løfte cellene. Inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter eller til cellene har løftet og sjekk kulturen hvert to til tre minutter ved å tappe på siden av platen. Når cellene har løftet, overfør dem til et 50 milliliter konisk rør.Triturat med en P-1000 pipette for å sikre en enkeltcelle suspensjon. Vask platen og kolben med et ekstra EMT-medium for å samle de gjenværende cellene og legge dem til det koniske røret. Igjen, triturere cellene for å sikre en enkelt celle suspensjon.Legg til EMT-medium for å avslutte dissosiasjonsprosessen og deretter ta prøver av cellesuspensjonene for celletelling. Utfør celletellinger ved hjelp av en automatisert celleteller eller et hemocytometer i trypanblått. Spinn cellene ved 200 G i fire minutter, aspirer supernatanten og suspender cellene i fem milliliter av EMT-basemediet for å fjerne det gjenværende dissosiasjonsreagenset.Etter sentrifugering igjen i fire minutter, aspirer supernatanten og klargjør cellesuspensjonene ved passende tettheter. Beregn volumene av hver celleløsning som kreves for å gjøre opp ønsket antall vev og pipettere de beregnede volumene av celler i et 15 milliliter konisk rør. Tilsett 10 mikroliter fibrinogen per EMT til cellesuspensjonen og legg den på is.Sørg for at hver EMT har 90 mikroliter cellesuspensjon, 10 mikroliter fibrinogen og 50 mikroliter trombinoppløsning i den endelige vevskonstruksjonen. I en cellekulturhette, fjern lokket på vevstøpesettet og legg støpeplaten med stolpegitteret liggende flatt på isen. Bland cellefibrinogenblandingen og trekk opp 100 mikroliter med en P-200 pipette.Tilsett 100 mikroliter av blandingen til brønner fremstilt med 50 mikroliter trombinoppløsning og triturer fem ganger for å blande godt. Ikke skyv pipetten forbi første stopp og fjern spissen etter triturering for å unngå å skape bobler. Bland cellesuspensjonen i det koniske røret før du støper hvert vev.Hold både gitteret og støpebrønnplaten samtidig ved hjelp av pekerfingeren og tommelen på den ene hånden for å unngå bevegelse av gitteret eller la platen ligge flatt på is og gyng isbøtta for å se inn i støpeplaten. Gjenta med en frisk P-200 spiss for hvert vev til alle vevene er støpt. Overfør forsiktig frøsettet til inkubatoren og inkuber ved 37 grader Celsius i 80 minutter.Deretter tilberedes en fersk 24-brønnsplate med to milliliter per brønn av EMT-mediet for hjertevev og inkuberer platen ved 37 grader Celsius for å varme mediet. Etter 80 minutters inkubasjon, tilsett forsiktig en milliliter av EMT-mediet til kanten av støpebrønnene og inkuber i ytterligere 10 minutter ved 37 grader Celsius. Etter 10 minutters inkubasjon, løft forsiktig stolpegitteret og overfør vevet fra støpeplaten til en forberedt 24-brønnplate med det oppvarmede medium.Til slutt, returner platene med vev til cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius. Mislykket EMT-produksjon kan variere fra katastrofale feil som vevsløsning fra stolpene, til mer subtile strukturelle feil som luftbobler og ulik vevsavsetning rundt begge stolper. EMT-konstruksjon en dag etter støping er vist her.Skjelettmuskulaturvev ble overført til et differensieringsmedium begynnelsen av dag null av cellefusjon og hydrogelkomprimering. Fra dag syv til dag 28 viste samme EMT en litt kortere total lengde mellom de to stolpene og en mindre bredde målt gjennom den midtre delen av EMT. Fire plater med vev ble sporet over 21 dager som sammenlignet EMT-diameter gjennom komprimering.Tidspunkter viser konsistent EMT-størrelse mellom platene. Maksimal komprimering nås på dag 21 når matriseombyggingen stabiliseres. Immunhistokjemien til EMTene er avbildet her.EMT ble fiksert på dag 10 av kulturen og innebygd i parafin. Tynne tverrsnitt ble farget med antistoffer mot myosin, tungkjede og dystrofin før avbildning. Disse grafiske bildene representerer den gjennomsnittlige absolutte rykningskraften målt fra hjertets EMT og skjelettets EMT over tid.Akutt og kronisk doksorubicinbehandling i konstruert hjertevev er vist her. Tre forskjellige dosekonsentrasjoner av Dox ble levert enten i bolus eller administrert kontinuerlig til konstruert hjertevev i løpet av 27 dager. Doseresponsen på BDM i konstruert skjelettmuskulaturvev er presentert i denne figuren.Hjerterytmen eller rykningsfrekvensen opphører på en doseavhengig måte i takt med opphør av kontraktil kraft som indikerer kardiotoksisitet når EMT eksponeres for denne forbindelsen. Det viktigste å huske når du støper vev er å holde alt kaldt til enhver tid, inkludert celleoppheng og reagenser og å holde stolpegitteret helt stasjonært når støpingen begynner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produksjon, karakterisering og potensielle bruk av en 3D Tissue-konstruert Menneskelig Esophageal slimhinnene Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Engineered 3D Silk-kollagen-basert modell av polarisert Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Konstruert vaskulariserte Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En Kombinert 3D Tissue Konstruert<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lung Tumor modell for å forutsi Drug Effective i Spesifikke mutasjons bakgrunner

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

anvendelser av<em&gt; I Vivo</em&gt; Functional Testing av Rat tibialis anterior for Vurderer Tissue Konstruert Skeletal Muscle Reparasjon

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Biomekaniske Karakterisering av menneske bløtvev Bruke Innrykk og Strekkprøving

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatisert Sammentrekning Analysis of Human Engineered hjertevev for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardisert og skalerbar analyse for å studere Perfusert 3D angiogenic spirende av iPSC-avledet endothelial Cells in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avanserte 3D levermodeller for in vitro gentoksisitetstesting etter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...