Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo financiamento da Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 concedido ao Instituto de Ciências da Saúde e do Ambiente) e pelo financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (HL151094 para o Dr. Geisse). Agradecemos ao Dr. Alec S. T. Smith por sua assistência na preparação deste manuscrito.

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 150 (2013).</li><li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Todos os autores são funcionários e acionistas da Curi Bio Inc., a empresa que comercializa o hardware Mantarray e o software associado.

Este estudo descreve métodos para gerar tecidos cardíacos e musculares esqueléticos modificados em 3D dentro de um kit de fundição consumível de 24 poços. Seguindo esses métodos, é possível alcançar consistentemente uma matriz completa de 24 tecidos sem falhas de fundição para triagem subsequente de drogas. Considerações críticas para alcançar tal resultado são garantir que, durante a fundição, todas as etapas sejam realizadas no gelo para evitar a polimerização prematura dos hidrogéis, a remoção do reagente de dissociação celular antes da fundição do tecido, a mistura completa da suspensão de células e hidrogel para cada tecido, a substituição das pontas da pipeta entre os tecidos e o uso de FBS inativado pelo calor (se usado). Além disso, é importante garantir que a rede de pós-rede não seja movida uma vez que a fundição comece e seja transferida suavemente uma vez que os hidrogéis tenham se formado.
As principais modificações incluem o uso de diferentes tipos de células para alcançar EMTs cardíacos versus esqueléticos e o doping de hidrogéis com concentrações variáveis de proteínas da membrana basal para promover a maturação celular e a estabilidade tecidual. Os efeitos benéficos desse doping devem ser testados caso a caso, mas tem demonstrado melhorar os resultados funcionais e a longevidade tecidual em determinadas circunstâncias14,16,22. Também é digno de nota que as densidades celulares listadas são um guia e podem precisar ser otimizadas para diferentes linhagens celulares. Composições alternativas de hidrogel também podem ser consideradas como um meio de modificar as propriedades estruturais e funcionais dos EMTs alcançados23,24,25. O microambiente muscular nativo também contém tipos de células de suporte para promover vascularização, inervação e deposição de matriz para apoiar os miócitos na forma e função26,27. Embora o sistema descrito aqui atualmente incorpore fibroblastos em tecidos cardíacos 3D, tipos adicionais de células podem criar um modelo mais fisiológico relevante para estudar a segurança e a eficácia de compostos terapêuticos in vitro. Anteriormente, uma variedade de tipos de células de suporte foram integradas com sucesso em tecidos de engenharia 3D, apresentando um modelo empolgante para estudos futuros usando a plataforma de contratilidade de detecção magnética28,29,30.
A solução de problemas para este protocolo centra-se na formação de tecidos não confiáveis ou inconsistentes durante o processo de fundição. Deve-se tomar cuidado para evitar a formação de bolhas nos hidrogéis à medida que são fundidos, facilitando a distribuição uniforme das células durante a mistura. Experimentos de otimização provavelmente serão necessários para cada novo tipo de célula para identificar densidades celulares ideais, proporções celulares e composição de matrizes.
Uma grande limitação para esta técnica é o número significativo de células necessárias para estabelecer uma placa cheia de 24 EMTs. Para os dados aqui apresentados, foram utilizados 15 milhões de cardiomiócitos e 18 milhões de mioblastos esqueléticos por placa. Certos pesquisadores podem não ter acesso a piscinas tão grandes de material celular, o que pode inibir sua capacidade de usar essa plataforma em toda a sua extensão. Se os usuários finais não tiverem acesso ao hardware de detecção magnética, as medições de pós-deflexões precisam ser realizadas opticamente, o que reduz significativamente a taxa de transferência e impede o registro simultâneo de contrações musculares em vários poços. No entanto, o hardware Mantarray supera essas limitações para oferecer o primeiro sistema comercial capaz de análise contínua e não invasiva da contração EMT simultaneamente em várias construções.
A detecção magnética em 24 poços facilita estudos longitudinais do desenvolvimento funcional da EMT em tempo real e permite a medição precisa de respostas agudas à manipulação química, ambiental ou genética. Embora a detecção magnética tenha várias vantagens, como a medição simultânea em vários tecidos, e não exija análise de dados complicada, os métodos de detecção óptica permitem a medição simultânea de métricas fisiológicas, como fluxo de cálcio ou mapeamento de tensão. No entanto, conjuntos de dados como os ilustrados na seção de resultados demonstram a amplitude das aplicações que essa tecnologia tem no espaço de desenvolvimento de medicamentos. Dado que poucos ensaios no mercado oferecem os meios para realizar uma avaliação direta da produção contrátil no músculo projetado, esses métodos têm o potencial de revolucionar o pipeline de desenvolvimento pré-clínico.

Os modelos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) estão se tornando cada vez mais atores-chave no pipeline pré-clínico para a descoberta e o desenvolvimento terapêutico, bem como a pesquisa biológica básica e a modelagem de doenças 1,2,3,4,5. Tecidos contráteis, como músculos cardíacos e esqueléticos derivados de iPSCs, possuem grande potencial para melhorar o poder preditivo de estudos in vitro em humanos, pois a avaliação direta da força contrátil muscular e da cinética são métricas quantitativas para estudar a função tecidual geral 4,6,7,8. Tipicamente, as medidas da força contrátil têm sido obtidas indiretamente pelo rastreamento óptico da deflexão do substrato 9,10 ou diretamente pela fixação de células/tecidos a um transdutor de força4,11,12. Esses métodos, embora precisos, são inerentemente de baixo rendimento e normalmente exigem operadores altamente qualificados para coletar e analisar dados.
Trabalhos anteriores mostraram que a detecção do campo magnético contorna esses obstáculos e fornece um método alternativo para avaliar a função muscular projetada simultaneamente em vários construtos teciduais13. A Plataforma de Contratilidade 3D Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) baseia-se nessa tecnologia usando um dispositivo capaz de medir a contratilidade de tecidos musculares projetados de maneira altamente paralela que aproveita a complexidade de modelos celulares 3D com triagem de maior rendimento14. A plataforma permite o monitoramento em tempo real, quantitativo e livre de rótulos da função contrátil nos tecidos musculares cardíacos e esqueléticos dentro ou fora de uma incubadora de cultura celular padrão, eliminando a necessidade de imagens e análises contráteis baseadas em óptica. Essa tecnologia facilita a comparação direta de linhagens celulares saudáveis e doentes e permite a medição do efeito de uma droga em tecidos contráteis, estabelecendo dados quantificáveis, in vitro, de segurança e eficácia para compostos terapêuticos novos e existentes.
Os tecidos musculares 3D projetados podem ser fabricados entre dois postes de maneira altamente reprodutível usando a placa de fundição de 24 poços consumível Mantarray (Figura 1). Um poste é rígido, enquanto o outro poste é flexível e contém um pequeno ímã. Quando a construção do tecido se contrai, ela desloca o poste flexível e o ímã incorporado. A placa EMT é posicionada dentro do instrumento, e o deslocamento do poste é medido através de uma matriz de sensores magnéticos em uma placa de circuito abaixo do suporte da placa. As mudanças medidas no campo magnético são convertidas em força contrátil absoluta usando um algoritmo matemático. O instrumento emprega taxas rápidas de amostragem de dados para permitir a coleta de informações detalhadas sobre a capacidade funcional e a maturidade do(s) tipo(s) de célula(s) a ser ensaiado(s), incluindo frequência de contração, velocidade e tempo de decaimento. Essas medições funcionais podem ser obtidas em todos os 24 poços simultaneamente com a plataforma de detecção magnética ou individual e sequencialmente usando métodos ópticos tradicionais.
Este estudo descreve um método altamente reprodutível para a engenharia de músculos esqueléticos 3D e microtecidos cardíacos em um hidrogel à base de fibrina. Durante uma breve reação de 80 minutos, a trombina catalisa a conversão de fibrinogênio em fibrina, fornecendo um andaime para que as células musculares se desenvolvam em cultura suspensa15. As células estromais ajudam a remodelar a matriz e os tecidos tornam-se contráteis à medida que as células musculares formam um sincício dentro do hidrogel. A contratilidade desses tecidos foi analisada por meio da abordagem de sensoriamento magnético, tanto antes quanto após a exposição composta, validando essa modalidade para uso em estudos de fármacos dose-resposta. Os mioblastos humanos primários de uma biópsia de doador saudável foram obtidos comercialmente e cultivados em 2D de acordo com os protocolos do fornecedor. As células foram expandidas usando um meio de crescimento muscular esquelético através de três passagens para gerar números de células suficientes para fabricar tecidos 3D. Células estromais e cardiomiócitos derivados de hiPSC foram cultivados de acordo com o protocolo do fornecedor por 3 dias para permitir a recuperação da criopreservação antes da fundição de células nos tecidos. Resultados representativos são fornecidos ilustrando os tipos de conjuntos de dados que podem ser coletados usando a plataforma de detecção magnética. Armadilhas comuns associadas à geração de tecidos modificados usando esses métodos também são abordadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

Modelar com precisão as condições saudáveis e de doença in vitro é vital para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento e terapêuticas. Para doenças cardíacas e musculares esqueléticas, a força contrátil e a cinética constituem métricas-chave para avaliar a função muscular. Métodos novos e aprimorados para gerar tecidos musculares modificados (EMTs) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas tornaram a modelagem de doenças in vitro mais confiável para tecidos contráteis; no entanto, fabricar de forma reprodutível tecidos a partir de culturas de células suspensas e medir sua contratilidade é um desafio. Tais técnicas são frequentemente atormentadas por altas taxas de falha e exigem instrumentação complexa e rotinas personalizadas de análise de dados. Uma nova plataforma e dispositivo que utiliza EMTs 3D em conjunto com um ensaio de contratilidade sem rótulos, altamente paralelo e amigável à automação contorna muitos desses obstáculos. A plataforma permite a fabricação fácil e reprodutível de EMTs 3D usando praticamente qualquer fonte de célula. A contratilidade tecidual é então medida através de um instrumento que mede simultaneamente 24 tecidos sem a necessidade de rotinas complexas de análise de software. O instrumento pode medir de forma confiável as mudanças de micronewton em vigor, permitindo a triagem de compostos dependentes da dose para medir o efeito de uma droga ou terapêutica na saída contrátil. Os tecidos modificados feitos com este dispositivo são totalmente funcionais, gerando contrações tônicas e tetânicas após a estimulação elétrica, e podem ser analisados longitudinalmente em cultura ao longo de semanas ou meses. Aqui, mostramos dados de EMTs de músculos cardíacos sob dosagem aguda e crônica com tóxicos conhecidos, incluindo uma droga (BMS-986094) que foi retirada de ensaios clínicos após mortes de pacientes devido a cardiotoxicidade imprevista. A função alterada do músculo esquelético em tecidos modificados em resposta ao tratamento com um inibidor de miosina também é apresentada. Essa plataforma permite que o pesquisador integre sistemas de modelos de bioengenharia complexos e ricos em informações em seu fluxo de trabalho de descoberta de medicamentos com o mínimo de treinamento adicional ou habilidades necessárias.

As células foram moldadas em tecidos musculares modificados na placa consumível de 2 pós (Figura 1). Os EMTs bem-sucedidos aparecerão uniformes e a matriz será distribuída uniformemente entre os postes (Figura 2A). A matriz também deve envolver ambos os postes, produzindo pontos de ancoragem equivalentes para o tecido. Falhas na fundição são raras com este método e geralmente são óbvias com uma inspeção visual. A produção malsucedida de EMT pode variar de falhas catastróficas, como o descolamento de tecido dos postes (Figura 2B) a falhas estruturais mais sutis, como bolhas de ar e fixação solta aos postes (Figura 2C,D). Tecidos com pequenas falhas ainda podem ser viáveis, mas os dados desses tecidos devem ser examinados cuidadosamente para garantir que sejam comparáveis aos EMTs não comprometidos. Por exemplo, bolhas de ar dentro de um EMT podem ser espremidas à medida que o tecido se compacta ao longo do tempo, tornando uma construção totalmente funcional sem deficiências contráteis. Esses tecidos devem ser avaliados caso a caso, no entanto, pois a localização das bolhas de ar pode afetar a recuperação funcional. As bolhas de ar geradas nos postes, por exemplo, podem afetar a fixação tecidual, o que poderia impedir a adesão a longo prazo ao poste.
Os tecidos começam a se compactar nas primeiras 24 h à medida que as células remodelam a matriz dentro do hidrogel (Figura 3). A compactação é um processo gradual e geralmente prossegue ao longo das primeiras 2-4 semanas de cultura. No geral, a compactação tecidual é consistente entre as replicações técnicas e biológicas (Figura 4). É normal que algumas linhagens celulares compactem a matriz mais do que outras, à medida que os tecidos amadurecem ao longo do tempo. A porcentagem de células miogênicas dentro de um construto influencia a taxa e o grau geral de compactação da EMT. O conteúdo miogênico total para linhagens celulares de músculo cardíaco e esquelético deve estar acima de 80% para minimizar a variação entre os tecidos modificados. Isto é particularmente importante quando se compara forças contráteis e cinética entre linhagens celulares.
Nos primeiros dias após a fundição, os cardiomiócitos começam a bater espontaneamente em cultura, dobrando ritmicamente o poste flexível a cada contração muscular. Os construtos do músculo esquelético se contraem em resposta à estimulação elétrica no dia 7 após o início da diferenciação. A estimulação de campo foi aplicada aos tecidos musculares esqueléticos através de um estimulador externo ligado a uma tampa de eletrodo personalizada de 24 poços. A tampa, fabricada com um par de eletrodos de carbono para cada poço, fica em cima da placa de 24 poços de tecidos, estimulando simultaneamente cada EMT a induzir contrações musculares. Os tecidos foram estimulados utilizando-se um estímulo de 10 V por uma duração de pulso de 10 ms a 1 Hz durante as medidas funcionais. Os tecidos contráteis indicam mioblastos esqueléticos que se fundiram, formando miotubos completos com sarcômeros funcionais e máquinas contráteis. Os EMTs esqueléticos são positivos para cadeia pesada de miosina (MyHC) e a distrofina está localizada na membrana do miotubo, revelando uma forma clássica de anel na análise imuno-histoquímica transversal (Figura 5). Uma vez que os EMTs são funcionais, a contratilidade pode ser medida diariamente no instrumento de detecção magnética, força de rastreamento e cinética à medida que as construções se desenvolvem e amadurecem ao longo do tempo. Tanto os tecidos cardíacos quanto os do músculo esquelético permanecem contráteis por semanas a meses em cultura 3D (Figura 6), e podem ser usados para uma ampla gama de estudos de contratilidade.
A abordagem de detecção magnética pode ser utilizada para medir simultaneamente os efeitos agudos e crônicos de cardiotóxicos estruturais, como a doxorrubicina (Figura 7) e o BMS-986094 (Figura 8), além de outras drogas que afetam a contratilidade muscular. Métodos de rastreamento óptico de detecção de contração também podem ser usados, mas deve-se tomar cuidado ao estudar os efeitos agudos da droga, pois as medições devem ser tomadas sequencialmente. A longevidade prolongada dos EMTs cardíacos e esqueléticos em cultura 3D permite estudos de drogas de longo prazo nesses tecidos. Isso permite que os usuários explorem os efeitos da dosagem repetida, bem como a exposição contínua e a longo prazo a compostos que podem mostrar efeitos cardiotóxicos ao longo do tempo, como ocorre com a doxorrubicina. A doxorrubicina (dox) é um quimioterápico anticâncer17. A quantidade de droga administrada aos pacientes varia, dependendo do tipo de câncer, idade do paciente, altura e peso do paciente, bem como outros fatores. Por esta razão, é importante testar o efeito da dox em uma ampla gama de concentrações e cronogramas de entrega. Aqui, os EMTs cardíacos foram tratados ao longo de 27 dias com três concentrações separadas (0,1 μM, 1 μM e 10 μM) de dox (Figura 7). Os grupos foram estratificados ainda mais pelo tratamento de EMTs em cada concentração com um tratamento em bolus ou administração contínua com uma mudança média a cada 72 h. Os poços que receberam tratamentos em bolus de dox foram expostos à droga em três pontos de tempo separados, permitindo a recuperação entre a dosagem. As duas maiores doses de bolus e exposição contínua mostraram uma cessação imediata e prolongada da geração de força contrátil ao longo do estudo. As concentrações média e mais baixa tiveram efeitos variados sobre os tecidos, dependendo do método de administração. Na menor concentração da droga, o grupo bolus não apresentou diferença em relação aos controles. No entanto, a força contrátil diminuiu após 2 semanas de exposição contínua. A concentração de médio alcance da droga teve um efeito interessante. Enquanto a dosagem contínua reduziu a força nos primeiros dois dias de tratamento e durou todo o experimento, o grupo bolus mostrou uma recuperação da força contrátil de volta aos níveis de controle quando a droga foi lavada após 3 dias. No entanto, o segundo bolus da droga causou uma cessação total da força, seguida de nenhuma recuperação (Figura 7), indicando que a dosagem repetida nessa concentração pode ter um efeito cardiotóxico em pacientes tratados com essa droga. O amplo escopo deste estudo, tanto no tempo quanto em condições experimentais, destaca a utilidade dos tecidos modificados em 3D na triagem de toxicidade, pois permanecem contráteis e responsivos à exposição química por longos períodos de tempo, permitindo estudos de drogas de longo prazo dentro de um único conjunto de tecidos musculares. Isso facilita não apenas a identificação de compostos que podem ter um efeito cardiotóxico com exposição crônica, mas também a detecção de possíveis momentos cardiotóxicos de administração.
O teste de toxicidade in vitro em tecidos musculares humanos modificados é uma maneira de ajudar a manter os pacientes humanos seguros em ensaios clínicos. BMS-986094 é um inibidor da nucleotídeo polimerase (NS5B) usado para tratar a hepatite C. A droga estava em desenvolvimento clínico de Fase II quando Bristol-Myers Squibb interrompeu o desenvolvimento devido a vários casos de insuficiência cardíaca inesperada em pacientes18,19. Aqui, o BMS-986094 foi aplicado a EMTs cardíacos para testar se os tecidos musculares modificados em 3D desenvolveriam uma reação cardiotóxica à droga (Figura 8). Três concentrações diferentes da droga foram aplicadas, e os tecidos foram monitorados ao longo de 13 dias. A força contrátil caiu com a adição do fármaco de forma dose-dependente (Figura 8A). A frequência de contração também foi significativamente afetada à medida que a taxa de batimento diminuiu e, eventualmente, parou como esperado com a exposição contínua ao composto cardiotóxico (p < 0,05, Figura 8B). Esses resultados demonstram como os tecidos musculares humanos modificados em 3D podem ser usados para facilitar a introdução de novas drogas no mercado e sinalizar compostos que eventualmente falham devido à cardiotoxicidade. Além disso, essa tecnologia poderia potencialmente salvar vidas, expondo drogas perigosas antes de serem colocadas em pacientes em ensaios clínicos.
A capacidade de medir o efeito de drogas agudas e cronicamente aplicadas no tecido contrátil humano é um primeiro passo vital ao investigar a terapêutica quanto à segurança e eficácia. É importante saber, no entanto, que a concentração de fármacos aplicados é fisiologicamente relevante e apropriada para testes in vitro . Tecidos musculares esqueléticos foram utilizados para estabelecer um valor de IC50 para o monóxido de 2,3-butanodiona (BDM) em uma curva dose-resposta completa. Esta droga é um inibidor da ATPase bem caracterizado da miosina II do músculo esquelético20. O BDM inibe as contrações musculares, impedindo a formação de pontes cruzadas de miosina com o filamento de actina em sarcômeros21. Os resultados aqui apresentados revelam uma diminuição dose-dependente da força absoluta quando a droga é aplicada e a recuperação completa da força contrátil quando a droga é lavada, indicando que o efeito transitório está prevenindo contrações musculares e não apenas matando células dentro do tecido (Figura 9A). Além disso, uma curva dose-resposta completa foi medida nas sete concentrações examinadas, estabelecendo um CI50 de 3,2 mM nesses microtecidos humanos (Figura 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig01.jpg"> Figura 1: Fundição EMT na placa de 24 poços consumível Mantarray de 2 postes . (A) Células miogênicas e estromais foram cultivadas em superfícies 2D antes da fundição do tecido. (B) As células são retiradas de superfícies 2D e misturadas com proteínas da matriz extracelular para formar hidrogéis nos poços de fundição de placas individuais mostrados na inserção. (C) Placa de 24 poços contendo tecidos modificados em cada poço. (D) Tecidos representativos mostrando músculo modificado relaxado e contraído, comparando o deslocamento do poste magnético (barras verdes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig02.jpg"> Figura 2: Fundição EMT bem-sucedida e malsucedida . (A) Tecido muscular projetado ideal 24 h pós-fundição uniformemente compactado em torno dos postes com composição homogênea de célula/matriz em todo o tecido. (B) EMT com falha mostrando descolamento do hidrogel do poste flexível. (C) EMT contendo bolhas de ar em todo o tecido. (D) Deposição desigual de tecido em torno de ambos os postos. O tecido é frouxamente ancorado ao poste flexível de um lado. As barras de escala são de 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig03.jpg"> Figura 3: Compactação no tecido muscular modificado ao longo do tempo. (A) Construto EMT mostrado 1 dia após a fundição. Os tecidos são transferidos para o meio de diferenciação, a partir do dia 0 de fusão celular e compactação em hidrogel. (B-E) O mesmo EMT no dia 7 até o dia 21 mostrando um comprimento total ligeiramente menor entre os dois postes ao longo do tempo e menor largura quando medido através da seção do meio do EMT. As barras de escala são de 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig04.jpg"> Figura 4: Diâmetro da EMT ao longo do tempo. Quatro placas de tecidos foram rastreadas ao longo de 21 dias, comparando-se o diâmetro da EMT ao longo da compactação. Cada tecido foi medido através da seção intermediária a cada semana usando microscopia óptica. Os pontos de tempo mostram o tamanho consistente do EMT entre as placas. A compactação máxima é alcançada no dia 21 à medida que a remodelação da matriz é estabilizada. A tabela mostra o desvio padrão (% do total) de compactação dentro de cada placa de tecidos e o desvio médio para todas as placas. Barras coloridas são placas individuais. As barras de erro são SD de EMTs dentro de placas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig05.jpg"> Figura 5: Imuno-histoquímica dos tecidos musculares esqueléticos modificados. Os EMTs foram fixados no dia 10 de cultura e embutidos em parafina. Cortes transversais finos (7 μm) foram corados com anticorpos contra a cadeia pesada da miosina e distrofina antes da imagem. Verde = MyHC, vermelho = distrofina, azul = DAPI. A ampliação objetiva é de 40X; barra de escala é de 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig06.jpg"> Figura 6: Força contrátil em tecidos musculares modificados ao longo do tempo. (A) Força de contração absoluta média medida a partir de EMTs cardíacos do dia 7 ao dia 63 em cultura; n = 3 por grupo. (B) Força de contração absoluta média em EMTs esqueléticos derivados de uma linhagem celular primária no dia 7 até o dia 53 em cultura; n = 3. As barras de erro são SD para ambos os gráficos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig06large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig07.jpg"> Figura 7: Tratamento agudo e crônico com doxorrubicina no tecido muscular modificado. Três concentrações de dose separadas de dox, 0,1 μM, 1 μM e 10 μM, foram administradas em bolus ou administradas continuamente aos tecidos musculares modificados ao longo de 27 dias. Doses em bolus da droga foram adicionadas em mudanças de mídia nos dias 0, 12 e 24, observadas pelas setas verdes no eixo X. A droga foi adicionada à mídia a cada mudança de mídia para dosagem contínua, notada pelas setas pretas e verdes no eixo X. A variação percentual em vigor em relação aos valores basais (pré-tratamento medicamentoso) está no eixo Y, e o tempo em dias de tratamento está no eixo X. Laranja claro = controle contínuo DMSO, laranja escuro = controle DMSO bolus, verde claro = 0,1 μM dox contínuo, verde escuro = 0,1 μM dox bolus, azul claro = 1 μM dox contínuo, azul escuro = 1 μM Dox bolus, amarelo claro = 10 μM dox contínuo, amarelo escuro = 10 μM dox bolus. As barras de erro são SD; n = 3 por condição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig07large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig08.jpg"> Figura 8: Tratamento crônico com BMS-986094 em tecido muscular modificado. Os EMTs foram tratados com 0,4 μM (verde), 2 μM (azul escuro) e 10 μM (azul claro) BMS-986094 durante 13 dias. (A) A força de contração contrátil (eixo Y) diminui em todas as concentrações de drogas nos primeiros 2 dias, enquanto os tecidos de controle no DMSO continuam a ficar mais fortes ao longo do tempo (eixo X). (B) A frequência de batimento cardíaco, ou frequência de contração, cessa de maneira semelhante à dose-dependente em conjunto com uma cessação da força contrátil mostrada no gráfico A. Os tecidos de controle no DMSO (cinza) mantêm uma taxa de batimento regular durante todo o experimento. As barras de erro são SD; n = 3 por condição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig08large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig09.jpg"> Figura 9: Dose-resposta ao BDM em tecidos musculares esqueléticos modificados . (A) A força de contração absoluta diminui de maneira dose-dependente quando os EMTs primários derivados de células são expostos ao monóxido de 2,3-butanodiona (BDM) no dia 16 em cultura 3D. A força de contração absoluta retorna aos valores basais próximos quando a droga é lavada. (B) A força de contração absoluta normalizada para valores basais diminui de forma dose-dependente quando exposta ao BDM, produzindo uma curva dose-resposta completa e um valor de IC50 ; n = 4 por dose. As barras de erro são SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Este protocolo fornece métodos para gerar tecidos cardíacos e musculares esqueléticos modificados em 3D e descreve seu uso em modalidades de triagem pré-clínica de medicamentos. Os métodos descritos utilizam um sistema de detecção magnética para facilitar a avaliação simultânea de 24 tecidos em paralelo.

Teste pré-clínico de drogas em tecidos musculares escaláveis de engenharia 3D

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Nossa plataforma usa tecidos musculares projetados em 3D e hardware de detecção magnética para medir a contratilidade em 24 poços simultaneamente. Isso fornece um método de maior rendimento para avaliar novas terapias in vitro usando tecidos musculares humanos. Nosso método de fundição melhora a consistência e a reprodutibilidade na fabricação de tecidos musculares projetados em 3D.Projetamos uma placa de fundição consumível de 24 poços equipada com hardware de detecção magnética para medições e análises de contratilidade em nossa plataforma. Este método pode fornecer informações valiosas sobre a modelagem de doenças in vitro, a descoberta de medicamentos e a terapia gênica para qualquer doença muscular que afete a contratilidade. Atualmente, estamos incorporando neurônios motores em nossas construções 3D para criar um modelo de junção neuromuscular também.Para começar, coloque um kit de fundição de tecido pré-resfriado em um bloco frio ou gelo dentro do exaustor de cultura de células. Coloque a placa de fundição plana no gelo. Adicione trombina ao meio de base para fazer a solução de trombina e mova a rede de pós-treliça da placa de fundição para uma nova placa estéril de 24 poços.Pipetar 50 microlitros de solução de trombina em cada poço pré-refrigerado da placa de fundição e colocar a treliça de volta no kit. Coloque o kit de fundição de lado no gelo. Em seguida, adicione 500 mililitros de meio RPMI, 10 mililitros de B27 e 2,5 gramas de ácido aminocapróico, ou ACA, para preparar o meio EMT cardíaco.Retire o meio EMT que será usado para moldar os tecidos e adicione 10 inibidores micromolares de ROCK a ele. Prepare o meio EMT esquelético adicionando 50 mililitros de meio F10 e 0,25 gramas de ácido aminocapróico, ou ACA, para mioblastos primários. Use 0,1 gramas de ACA para mioblastos derivados de IPSC.Em seguida, filtre estéril, o meio de fundição contendo ACA. Aqueça o reagente de dissociação do grau de cultura celular e um volume igual de EMT médio a 37 graus Celsius. Este meio EMT aquecido será usado para diluir o reagente de dissociação.Lave as células com PBS e adicione o reagente de dissociação aquecido para levantar as células. Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos ou até que as células tenham levantado e verifique as culturas a cada dois ou três minutos, tocando no lado da placa. Uma vez que as células tenham levantado, transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros.Triturar com uma pipeta P-1000 para garantir uma suspensão de célula única. Lavar a placa e o balão com um meio EMT adicional para recolher as células restantes e adicioná-las ao tubo cónico. Novamente, triture as células para garantir uma única suspensão celular.Adicione o meio EMT para encerrar o processo de dissociação e, em seguida, tire amostras das suspensões celulares para contagens de células. Realize contagens de células usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro em azul de tripano. Gire as células a 200 G por quatro minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em cinco mililitros do meio de base EMT para remover o reagente de dissociação residual.Depois de centrifugar novamente por quatro minutos, aspirar o sobrenadante e preparar as suspensões celulares nas densidades apropriadas. Calcular os volumes de cada solução celular necessária para compor o número desejado de tecidos e pipetar os volumes calculados de células para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 10 microlitros de fibrinogênio por EMT à suspensão celular e coloque-a no gelo.Certifique-se de que cada EMT tenha 90 microlitros de suspensão celular, 10 microlitros de fibrinogênio e 50 microlitros de solução de trombina na construção final do tecido. Em um exaustor de cultura de células, remova a tampa do kit de fundição de tecido e coloque a placa de fundição com a pós-treliça deitada no gelo. Misture a mistura de fibrinogênio celular e desenhe 100 microlitros com uma pipeta P-200.Adicione 100 microlitros da mistura a poços preparados com 50 microlitros de solução de trombina e triturar cinco vezes para misturar bem. Não empurre a pipeta para além da primeira paragem e remova a ponta após a trituração para evitar a criação de bolhas. Misture a suspensão celular no tubo cônico antes de fundir cada tecido.Segure a treliça e a placa do poço de fundição simultaneamente usando o dedo indicador e o polegar de uma mão para evitar qualquer movimento da rede ou deixe a placa plana no gelo e agite o balde de gelo para ver a placa de fundição. Repita com uma ponta P-200 fresca para cada tecido até que todos os tecidos estejam moldados. Transfira cuidadosamente o kit semeado para a incubadora e incube a 37 graus Celsius por 80 minutos.Em seguida, prepare uma placa fresca de 24 poços com dois mililitros por poço do meio EMT para tecidos cardíacos e incube a placa a 37 graus Celsius para aquecer o meio. Após a incubação de 80 minutos, adicione suavemente um mililitro do meio EMT à borda dos poços de fundição e incube por mais 10 minutos a 37 graus Celsius. Após 10 minutos de incubação, levante cuidadosamente a pós-treliça e transfira os tecidos da placa de fundição para uma placa preparada de 24 poços com o meio aquecido.Finalmente, devolva as placas com tecidos à incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius. A produção malsucedida de EMT pode variar de falhas catastróficas, como o descolamento de tecido dos postes, a falhas estruturais mais sutis, como bolhas de ar e deposição desigual de tecido em torno de ambos os postes. A construção EMT um dia após o casting é mostrada aqui.Os tecidos musculares esqueléticos foram transferidos para um meio de diferenciação a partir do dia zero de fusão celular e compactação em hidrogel. Do sétimo dia até o dia 28, o mesmo EMT exibiu um comprimento total ligeiramente menor entre os dois postes e uma largura menor quando medido através da seção do meio do EMT. Quatro placas de tecidos foram rastreadas ao longo de 21 dias comparando o diâmetro da EMT ao longo da compactação.Os pontos de tempo mostram o tamanho consistente do EMT entre as placas. A compactação máxima é alcançada no dia 21, à medida que a remodelação da matriz é estabilizada. A imuno-histoquímica dos EMTs é descrita aqui.Os EMTs foram fixados no dia 10 de cultura e embutidos em parafina. Cortes transversais finos foram corados com anticorpos contra a cadeia pesada de miosina e distrofina antes da imagem. Essas imagens gráficas representam a força de contração absoluta média medida a partir dos EMTs cardíacos e dos EMTs esqueléticos ao longo do tempo.O tratamento com doxorrubicina aguda e crônica em tecidos cardíacos modificados é mostrado aqui. Três concentrações de dose diferentes de Dox foram administradas em bolus ou administradas continuamente aos tecidos cardíacos modificados ao longo de 27 dias. A resposta à dose de BDM em tecidos musculares esqueléticos modificados é apresentada nesta figura.A frequência de batimento cardíaco ou de contração cessa de forma dose-dependente em conjunto com uma cessação da força contrátil indicando cardiotoxicidade quando os EMTs são expostos a este composto. As coisas mais importantes a lembrar ao fundir tecidos são manter tudo frio em todos os momentos, incluindo sua suspensão celular e reagentes e manter a rede de pós-poste completamente estacionária assim que a fundição começar.

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Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...