Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Este trabajo fue parcialmente apoyado por fondos de la Administración de Alimentos y Medicamentos (U01 FD006676-01 otorgado al Instituto de Ciencias de la Salud y el Medio Ambiente) y por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (HL151094 al Dr. Geisse). Agradecemos al Dr. Alec S. T. Smith por su ayuda con la preparación de este manuscrito.

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 150 (2013).</li><li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Todos los autores son empleados y accionistas de Curi Bio Inc., la compañía que comercializa el hardware Mantarray y el software asociado.

Este estudio describe métodos para generar tejidos cardíacos y esqueléticos diseñados en 3D dentro de un kit de fundición consumible de 24 pocillos. Al seguir estos métodos, es posible lograr consistentemente una gama completa de 24 tejidos sin fallas de fundición para la posterior detección de fármacos. Las consideraciones críticas para lograr tal resultado son garantizar que durante la fundición todos los pasos se realicen en hielo para evitar la polimerización prematura de los hidrogeles, la eliminación del reactivo de disociación celular antes de la fundición del tejido, la mezcla completa de la célula y la suspensión de hidrogel para cada tejido, el reemplazo de las puntas de pipeta entre los tejidos y el uso de FBS inactivado por calor (si se usa en absoluto). Además, es importante asegurarse de que la celosía posterior no se mueva una vez que comience la fundición y se transfiera suavemente una vez que se hayan formado los hidrogeles.
Las principales modificaciones incluyen el uso de diferentes tipos de células para lograr EMT cardíacos versus esqueléticos y el dopaje de hidrogeles con concentraciones variables de proteínas de la membrana basal para promover la maduración celular y la estabilidad del tejido. Los efectos beneficiosos de dicho dopaje deben probarse caso por caso, pero se ha demostrado que mejoran los resultados funcionales y la longevidad de los tejidos en ciertas circunstancias14,16,22. También es digno de mención que las densidades celulares enumeradas son una guía y pueden necesitar ser optimizadas para diferentes líneas celulares. Las composiciones alternativas de hidrogel también podrían considerarse como un medio para modificar las propiedades estructurales y funcionales de los EMT logrados23,24,25. El microambiente muscular nativo también contiene tipos de células de soporte para promover la vascularización, inervación y deposición de matriz para apoyar a los miocitos en forma y función26,27. Si bien el sistema descrito aquí actualmente incorpora fibroblastos en tejidos cardíacos 3D, los tipos de células adicionales pueden crear un modelo fisiológico más relevante para estudiar la seguridad y eficacia de los compuestos terapéuticos in vitro. Anteriormente, una gama de tipos de células de soporte se han integrado con éxito en tejidos de ingeniería 3D que presentan una plantilla emocionante para futuros estudios utilizando la plataforma de contractilidad de detección magnética28,29,30.
La solución de problemas para este protocolo se centra en la formación de tejidos poco confiables o inconsistentes durante el proceso de fundición. Se debe tener cuidado para evitar la formación de burbujas en los hidrogeles a medida que se funden y al mismo tiempo se facilita la distribución uniforme de las células durante la mezcla. Es probable que se necesiten experimentos de optimización para cada nuevo tipo de célula para identificar las densidades celulares ideales, las proporciones celulares y la composición de la matriz.
Una limitación importante para esta técnica es el número significativo de células requeridas para establecer una placa completa de 24 EMT. Para los datos presentados aquí, se utilizaron 15 millones de cardiomiocitos y 18 millones de mioblastos esqueléticos por placa. Ciertos investigadores pueden no tener acceso a grupos tan grandes de material celular, lo que puede inhibir su capacidad para usar esta plataforma en toda su extensión. Si los usuarios finales no tienen acceso al hardware de detección magnética, las mediciones de las deflexiones posteriores deben realizarse ópticamente, lo que reduce significativamente el rendimiento y evita el registro simultáneo de contracciones musculares en múltiples pocillos. Sin embargo, el hardware Mantarray supera estas limitaciones para ofrecer el primer sistema comercial capaz de realizar un análisis continuo y no invasivo de la contracción de EMT simultáneamente en múltiples construcciones.
La detección magnética en 24 pozos facilita los estudios longitudinales del desarrollo funcional de EMT en tiempo real y permite la medición precisa de las respuestas agudas a la manipulación química, ambiental o genética. Si bien la detección magnética tiene varias ventajas, como la medición simultánea en múltiples tejidos, y no requiere un análisis de datos complicado, los métodos de detección óptica permiten la medición simultánea de métricas fisiológicas como el flujo de calcio o el mapeo de voltaje. Sin embargo, conjuntos de datos como los que se ilustran en la sección de resultados demuestran la amplitud de aplicaciones que esta tecnología tiene en el espacio de desarrollo de fármacos. Dado que pocos ensayos en el mercado ofrecen los medios para realizar una evaluación directa de la producción contráctil en el músculo diseñado, estos métodos tienen el potencial de revolucionar la línea de desarrollo preclínico.

Los modelos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se están convirtiendo cada vez más en actores clave en la línea preclínica para el descubrimiento y desarrollo terapéutico, así como la investigación biológica básica y el modelado de enfermedades 1,2,3,4,5. Los tejidos contráctiles, como el músculo cardíaco y esquelético derivado de las iPSCs, tienen un gran potencial para mejorar el poder predictivo de los estudios in vitro en humanos, ya que la evaluación directa de la fuerza contráctil muscular y la cinética son métricas cuantitativas para estudiar la función tisular general 4,6,7,8. Típicamente, las mediciones de la fuerza contráctil se han obtenido indirectamente mediante el seguimiento óptico de la deflexión del sustrato 9,10 o directamente mediante la unión de células/tejidos a un transductor de fuerza4,11,12. Estos métodos, aunque precisos, son inherentemente de bajo rendimiento y, por lo general, requieren operadores altamente calificados para recopilar y analizar datos.
Trabajos anteriores han demostrado que la detección del campo magnético evita estos obstáculos y proporciona un método alternativo para evaluar la función muscular diseñada simultáneamente a través de múltiples construcciones de tejido13. La plataforma de contractilidad 3D Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) se basa en esta tecnología utilizando un dispositivo capaz de medir la contractilidad de los tejidos musculares diseñados de una manera altamente paralela que aprovecha la complejidad de los modelos celulares 3D con un cribado de mayor rendimiento14. La plataforma permite el monitoreo cuantitativo, en tiempo real y sin etiquetas de la función contráctil en tejidos musculares cardíacos y esqueléticos dentro o fuera de una incubadora de cultivo celular estándar, eliminando la necesidad de imágenes y análisis contráctiles basados en óptica. Esta tecnología facilita la comparación directa de líneas celulares sanas y enfermas y permite medir el efecto de un fármaco en los tejidos contráctiles, estableciendo datos cuantificables, in vitro, de seguridad y eficacia para compuestos terapéuticos nuevos y existentes.
Los tejidos musculares 3D diseñados se pueden fabricar entre dos postes de una manera altamente reproducible utilizando la placa de fundición de 24 pocillos consumible Mantarray (Figura 1). Un poste es rígido, mientras que el otro poste es flexible y contiene un pequeño imán. Cuando la construcción del tejido se contrae, desplaza el poste flexible y el imán incrustado. La placa EMT se coloca dentro del instrumento, y el desplazamiento posterior se mide a través de una serie de sensores magnéticos en una placa de circuito debajo del soporte de la placa. Los cambios medidos en el campo magnético se convierten en fuerza contráctil absoluta utilizando un algoritmo matemático. El instrumento emplea velocidades rápidas de muestreo de datos para permitir la recopilación de información detallada sobre la capacidad funcional y la madurez de los tipos de células que se están ensayando, incluida la frecuencia de contracción, la velocidad y el tiempo de desintegración. Estas mediciones funcionales se pueden obtener en los 24 pozos simultáneamente con la plataforma de detección magnética o de forma individual y secuencial utilizando métodos ópticos tradicionales.
Este estudio describe un método altamente reproducible para diseñar músculo esquelético 3D y microtejidos cardíacos en un hidrogel a base de fibrina. Durante una breve reacción de 80 minutos, la trombina cataliza la conversión de fibrinógeno en fibrina, proporcionando un andamio para que las células musculares se desarrollen en cultivo suspendido15. Las células estromales ayudan a remodelar la matriz y los tejidos se vuelven contráctiles a medida que las células musculares forman un sincitio dentro del hidrogel. La contractilidad de estos tejidos se analizó mediante el enfoque de detección magnética, tanto antes como después de la exposición al compuesto, validando esta modalidad para su uso en estudios de fármaco dosis-respuesta. Los mioblastos humanos primarios de una biopsia de donante sano se obtuvieron comercialmente y se cultivaron en 2D de acuerdo con los protocolos del proveedor. Las células se expandieron utilizando un medio de crecimiento del músculo esquelético a través de tres pasajes para generar un número suficiente de células para fabricar tejidos 3D. Las células estromales y los cardiomiocitos derivados de hiPSC se cultivaron de acuerdo con el protocolo del proveedor durante 3 días para permitir la recuperación de la criopreservación antes de fundir células en los tejidos. Se proporcionan resultados representativos que ilustran los tipos de conjuntos de datos que se pueden recopilar utilizando la plataforma de detección magnética. También se abordan las trampas comunes asociadas con la generación de tejidos diseñados utilizando estos métodos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

Modelar con precisión las condiciones saludables y de la enfermedad in vitro es vital para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento y terapéuticas. Para las enfermedades cardíacas y del músculo esquelético, la fuerza contráctil y la cinética constituyen métricas clave para evaluar la función muscular. Los métodos nuevos y mejorados para generar tejidos musculares diseñados (EMT) a partir de células madre pluripotentes inducidas han hecho que el modelado de enfermedades in vitro sea más confiable para los tejidos contráctiles; Sin embargo, la fabricación reproducible de tejidos a partir de cultivos celulares suspendidos y la medición de su contractilidad es un desafío. Tales técnicas a menudo están plagadas de altas tasas de falla y requieren instrumentación compleja y rutinas de análisis de datos personalizadas. Una nueva plataforma y dispositivo que utiliza EMT 3D junto con un ensayo de contractilidad sin etiquetas, altamente paralelo y fácil de automatizar evita muchos de estos obstáculos. La plataforma permite la fabricación fácil y reproducible de EMT 3D utilizando prácticamente cualquier fuente celular. La contractilidad tisular se mide a través de un instrumento que mide simultáneamente 24 tejidos sin la necesidad de complejas rutinas de análisis de software. El instrumento puede medir de manera confiable los cambios de fuerza de micronewton, lo que permite la detección de compuestos dependientes de la dosis para medir el efecto de un fármaco o terapéutico en la producción contráctil. Los tejidos diseñados con este dispositivo son completamente funcionales, generando contracciones y contracciones tetánicas tras la estimulación eléctrica, y se pueden analizar longitudinalmente en cultivo durante semanas o meses. Aquí, mostramos datos de EMT del músculo cardíaco bajo dosis aguda y crónica con tóxicos conocidos, incluido un medicamento (BMS-986094) que se retiró de ensayos clínicos después de muertes de pacientes debido a cardiotoxicidad imprevista. También se presenta una función del músculo esquelético alterada en tejidos diseñados en respuesta al tratamiento con un inhibidor de miosina. Esta plataforma permite al investigador integrar sistemas de modelos de bioingeniería complejos y ricos en información en su flujo de trabajo de descubrimiento de fármacos con una capacitación o habilidades adicionales mínimas requeridas.

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Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Este protocolo proporciona métodos para generar tejidos cardíacos y esqueléticos diseñados en 3D y describe su uso en modalidades preclínicas de detección de fármacos. Los métodos descritos utilizan un sistema de detección magnética para facilitar la evaluación simultánea de 24 tejidos en paralelo.

Pruebas preclínicas de fármacos en tejidos musculares escalables diseñados en 3D

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Nuestra plataforma utiliza tejidos musculares diseñados en 3D y hardware de detección magnética para medir la contractilidad en 24 pozos simultáneamente. Esto proporciona un método de mayor rendimiento para evaluar nuevas terapias in vitro utilizando tejidos musculares humanos. Nuestro método de fundición mejora la consistencia y la reproducibilidad en la fabricación de tejidos musculares diseñados en 3D.Hemos diseñado una placa de fundición consumible de 24 pocillos equipada con hardware de detección magnética para mediciones y análisis de contractilidad en nuestra plataforma. Este método puede proporcionar información valiosa sobre el modelado de enfermedades in vitro, el descubrimiento de fármacos y la terapia génica para cualquier enfermedad muscular que afecte la contractilidad. Actualmente estamos incorporando neuronas motoras en nuestras construcciones 3D para crear un modelo de unión neuromuscular también.Para comenzar, coloque un kit de fundición de tejido preenfriado en un bloque frío o hielo dentro de la campana de cultivo celular. Coloque la placa de fundición plana sobre hielo. Agregue trombina al medio base para hacer la solución de trombina y mueva la red posterior de la placa de fundición a una nueva placa estéril de 24 pocillos.Pipetear 50 microlitros de solución de trombina en cada pocillo preenfriado de la placa de fundición y volver a colocar la celosía en el kit. Coloque el kit de fundición a un lado en hielo. Luego, agregue 500 mililitros de RPMI medio, 10 mililitros de B27 y 2.5 gramos de ácido aminocaproico, o ACA, para preparar el medio EMT cardíaco.Saque el medio EMT que se utilizará para moldear los tejidos y agréguele 10 inhibidores micromolares de ROCK. Prepare el medio EMT esquelético agregando 50 mililitros de medio F10 y 0.25 gramos de ácido aminocaproico, o ACA, para mioblastos primarios. Use 0.1 gramos de ACA para los mioblastos derivados de IPSC.Luego, filtre estéril el medio de fundición que contiene ACA. Caliente el reactivo de disociación de grado de cultivo celular y un volumen igual de EMT medio a 37 grados centígrados. Este medio EMT calentado se utilizará para diluir el reactivo de disociación.Lave las células con PBS y agregue el reactivo de disociación calentado para levantar las células. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos o hasta que las células se hayan levantado y comprobar los cultivos cada dos o tres minutos golpeando el costado de la placa. Una vez que las células se hayan levantado, transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros.Triturar con una pipeta P-1000 para asegurar una suspensión de una sola celda. Lavar la placa y el matraz con un medio EMT adicional para recoger las células restantes y añadirlas al tubo cónico. Una vez más, triture las celdas para garantizar una suspensión de una sola celda.Agregue medio EMT para terminar el proceso de disociación y luego tome muestras de las suspensiones celulares para los recuentos celulares. Realice recuentos celulares utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro en azul de tripano. Gire las células a 200 G durante cuatro minutos, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en cinco mililitros del medio base EMT para eliminar el reactivo de disociación residual.Después de centrifugar nuevamente durante cuatro minutos, aspire el sobrenadante y prepare las suspensiones celulares a las densidades apropiadas. Calcule los volúmenes de cada solución celular necesarios para formar el número deseado de tejidos y pipete los volúmenes calculados de células en un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue 10 microlitros de fibrinógeno por EMT a la suspensión celular y colóquelo en hielo.Asegúrese de que cada EMT tenga 90 microlitros de suspensión celular, 10 microlitros de fibrinógeno y 50 microlitros de solución de trombina en la construcción final del tejido. En una campana de cultivo celular, retire la tapa del kit de fundición de tejido y coloque la placa de fundición con la celosía de postes sobre el hielo. Mezcle la mezcla de fibrinógeno celular y extraiga 100 microlitros con una pipeta P-200.Agregue 100 microlitros de la mezcla a los pocillos preparados con 50 microlitros de solución de trombina y triture cinco veces para mezclar bien. No empuje la pipeta más allá de la primera parada y retire la punta después de la trituración para evitar la creación de burbujas. Mezcle la suspensión celular en el tubo cónico antes de fundir cada tejido.Sostenga tanto la celosía como la placa de pozo de fundición simultáneamente usando el dedo índice y el pulgar de una mano para evitar cualquier movimiento de la celosía o deje la placa plana sobre hielo y balancee el cubo de hielo para ver dentro de la placa de fundición. Repita con una punta P-200 fresca para cada tejido hasta que todos los tejidos estén fundidos. Transfiera cuidadosamente el kit con semillas a la incubadora e incube a 37 grados centígrados durante 80 minutos.A continuación, prepare una placa fresca de 24 pocillos con dos mililitros por pocillo del medio EMT para tejidos cardíacos e incube la placa a 37 grados centígrados para calentar el medio. Después de la incubación de 80 minutos, agregue suavemente un mililitro del medio EMT al borde de los pocillos de fundición e incube durante otros 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de 10 minutos de incubación, levante con cuidado la celosía posterior y transfiera los tejidos de la placa de fundición a una placa preparada de 24 pocillos con el medio calentado.Finalmente, devuelva las placas con tejidos a la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados. La producción fallida de EMT puede variar desde fallas catastróficas como el desprendimiento de tejido de los postes, hasta defectos estructurales más sutiles, como burbujas de aire y deposición desigual de tejido alrededor de ambos postes. La construcción de EMT un día después de la fundición se muestra aquí.Los tejidos del músculo esquelético se transfirieron a un medio de diferenciación a partir del día cero de la fusión celular y la compactación del hidrogel. Desde el séptimo día hasta el día 28, el mismo EMT mostró una longitud total ligeramente más corta entre los dos postes y un ancho más pequeño cuando se midió a través de la sección central del EMT. Se rastrearon cuatro placas de tejidos durante 21 días comparando el diámetro de EMT durante toda la compactación.Los puntos de tiempo muestran un tamaño EMT consistente entre las placas. La compactación máxima se alcanza el día 21 a medida que se estabiliza la remodelación de la matriz. La inmunohistoquímica de los EMT se representa aquí.Los EMT se fijaron en el día 10 de cultivo y se incrustaron en parafina. Las secciones transversales delgadas se tiñeron con anticuerpos contra la cadena pesada de miosina y la distrofina antes de la obtención de imágenes. Estas imágenes gráficas representan la fuerza de contracción absoluta promedio medida a partir de los EMT cardíacos y los EMT esqueléticos a lo largo del tiempo.El tratamiento con doxorrubicina aguda y crónica en tejidos cardíacos diseñados se muestra aquí. Se administraron tres concentraciones de dosis diferentes de Dox en bolo o se administraron continuamente a tejidos cardíacos diseñados en el transcurso de 27 días. La respuesta a la dosis de BDM en tejidos musculares esqueléticos diseñados se presenta en esta figura.La frecuencia cardíaca o la frecuencia de contracción cesa de manera dependiente de la dosis junto con un cese de la fuerza contráctil, lo que indica cardiotoxicidad cuando los EMT están expuestos a este compuesto. Las cosas más importantes que debe recordar al fundir los pañuelos de papel son mantener todo frío en todo momento, incluida la suspensión celular y los reactivos, y mantener la celosía completamente estacionaria una vez que comience el yeso.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Investigación

Bioingeniería

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Un Tejido Combinada 3D Diseñado<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmón para la predicción de la eficacia de drogas en Fondos Específicos mutacional

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Aplicaciones de la<em&gt; En Vivo</em&gt; Pruebas funcionales de la rata tibial anterior para la evaluación de la ingeniería tisular de reparación del músculo esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Caracterización biomecánica de los tejidos blandos humanos utilizando sangría y Ensayo de tracción

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...