Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av finansiering från Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 tilldelad Health and Environmental Sciences Institute) och genom finansiering från National Institutes of Health (HL151094 till Dr. Geisse). Vi tackar Dr. Alec S. T. Smith för hans hjälp med utarbetandet av detta manuskript.

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 150 (2013).</li><li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+density+on+the+maturation+and+contractile+ability+of+muscle+derived+cells+in+a+3D+tissue-engineered+skeletal+muscle+model+and+determination+of+the+cellular+and+mechanical+stimuli+required+for+the+synthesis+of+a+postural+phenotype.">The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype.</a> Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+skeletal+muscle+capable+of+functional+regeneration.">Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration.</a> BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10, 6918 (2020).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics.">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li><li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle.">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle &amp; Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+force+and+frequency+analysis+of+engineered+human+heart+tissue+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+using+magnetic+sensing.">Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing.</a> Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).</li><li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+real-time+monitoring+of+engineered+skeletal+muscle+function+using+magnetic+sensing.">High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing.</a> bioRxiv. , 492879 (2022).</li><li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thrombin-fibrinogen+interaction.">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li><li>Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin:+the+good,+the+bad+and+the+ugly+effect.">Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect.</a> Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).</li><li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+dysfunction+associated+with+a+nucleotide+polymerase+inhibitor+for+treatment+of+hepatitis+C.">Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C.</a> Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).</li><li>Gill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+cover:+Investigative+nonclinical+cardiovascular+safety+and+toxicology+studies+with+BMS-986094,+an+NS5b+RNA-dependent+RNA+polymerase+inhibitor.">From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor.</a> Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).</li><li>Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3-Butanedione+monoxime+(BDM)+as+a+myosin+inhibitor.">2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).</li><li>Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralysis+of+skeletal+muscle+by+butanedione+monoxime,+a+chemical+phosphatase.">Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+tissue+engineered+skeletal+muscle+in+vitro+is+dependent+on+the+inclusion+of+basement+membrane+proteins.">Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins.</a> Cytoskeleton. 76 (6), 371-382 (2019).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Alla författare är anställda och aktieägare i Curi Bio Inc., företaget som kommersialiserar Mantarray-hårdvaran och tillhörande programvara.

Denna studie beskriver metoder för att generera 3D-konstruerade hjärt- och skelettmuskelvävnader i ett 24-brunns förbrukningsbart gjutningssats. Genom att följa dessa metoder är det möjligt att konsekvent uppnå en komplett uppsättning av 24 vävnader utan gjutningsfel för efterföljande läkemedelsscreening. Kritiska överväganden för att uppnå ett sådant resultat är att säkerställa att alla steg utförs på is under gjutning för att förhindra för tidig polymerisation av hydrogelerna, avlägsnande av celldissociationsreagens före vävnadsgjutning, grundlig blandning av cellen och hydrogelsuspensionen för varje vävnad, ersättning av pipettspetsar mellan vävnader och användning av värmeinaktiverad FBS (om den används alls). Det är också viktigt att se till att postgitteret inte flyttas när gjutningen börjar och överförs försiktigt när hydrogeler har bildats.
Stora modifieringar inkluderar användningen av olika celltyper för att uppnå hjärt- kontra skelett-EMT och dopning av hydrogeler med varierande koncentrationer av basalmembranproteiner för att främja cellulär mognad och vävnadsstabilitet. De gynnsamma effekterna av sådan dopning måste testas från fall till fall, men har visat sig förbättra funktionella resultat och vävnadslivslängd under vissa omständigheter14,16,22. Det är också anmärkningsvärt att de listade celldensiteterna är en guide och kan behöva optimeras för olika cellinjer. Alternativa hydrogelkompositioner kan också betraktas som ett sätt att modifiera de strukturella och funktionella egenskaperna hos de uppnådda EMT23,24,25. Den ursprungliga muskelmikromiljön innehåller också stödjande celltyper för att främja vaskularisering, innervation och matrisavsättning för att stödja myocyter i form och funktion26,27. Medan systemet som beskrivs här för närvarande innehåller fibroblaster i 3D-hjärtvävnader, kan ytterligare celltyper skapa en mer fysiologisk relevant modell för att studera säkerheten och effekten av terapeutiska föreningar in vitro. Tidigare har en rad stödjande celltyper framgångsrikt integrerats i 3D-konstruerade vävnader som presenterar en spännande mall för framtida studier med hjälp av magnetisk avkänningskontraktilitetsplattform28,29,30.
Felsökning för detta protokoll fokuserar på bildandet av opålitliga eller inkonsekventa vävnader under gjutningsprocessen. Försiktighet måste vidtas för att undvika bubbelbildning i hydrogelerna när de gjuts samtidigt som man underlättar jämn fördelning av cellerna under blandning. Optimeringsexperiment kommer sannolikt att behövas för varje ny celltyp för att identifiera ideala celldensiteter, cellförhållanden och matrissammansättning.
En stor begränsning för denna teknik är det betydande antalet celler som krävs för att etablera en hel platta med 24 EMT. För de data som presenteras här användes 15 miljoner kardiomyocyter och 18 miljoner skelettmyoblaster per platta. Vissa forskare kanske inte har tillgång till så stora pooler av cellulärt material, vilket kan hämma deras förmåga att använda denna plattform i sin fulla utsträckning. Om slutanvändarna inte har tillgång till hårdvara för magnetisk avkänning måste mätningar av efterböjningar utföras optiskt, vilket avsevärt minskar genomströmningen och förhindrar samtidig registrering av muskelsammandragningar över flera brunnar. Mantarray-hårdvaran övervinner dock dessa begränsningar för att erbjuda det första kommersiella systemet som kan kontinuerlig, icke-invasiv analys av EMT-kontraktion samtidigt över flera konstruktioner.
Magnetisk avkänning över 24 brunnar underlättar longitudinella studier av EMT-funktionell utveckling i realtid och möjliggör noggrann mätning av akuta svar på kemisk, miljömässig eller genetisk manipulation. Medan magnetisk avkänning har flera fördelar som samtidig mätning över flera vävnader och inte kräver komplicerad dataanalys, möjliggör optiska detektionsmetoder samtidig mätning av fysiologiska mätvärden som kalciumflöde eller spänningskartläggning. Datauppsättningar som de som illustreras i resultatavsnittet visar dock bredden av applikationer som denna teknik har inom läkemedelsutvecklingsområdet. Med tanke på att få analyser på marknaden erbjuder medel för att utföra en direkt bedömning av kontraktil produktion i konstruerad muskel, har dessa metoder potential att revolutionera den prekliniska utvecklingspipelinen.

Inducerade pluripotenta stamcellsmodeller (iPSC) blir alltmer nyckelaktörer i den prekliniska pipelinen för terapeutisk upptäckt och utveckling, liksom grundläggande biologisk forskning och sjukdomsmodellering 1,2,3,4,5. Kontraktila vävnader, såsom hjärt- och skelettmuskulatur härrörande från iPSCs, har stor potential att förbättra den prediktiva kraften hos humana in vitro-studier eftersom direkt bedömning av muskelkontraktil kraft och kinetik är kvantitativa mått för att studera övergripande vävnadsfunktion 4,6,7,8. Vanligtvis har mätningar av kontraktil kraft erhållits antingen indirekt genom optisk spårning av substratböjning 9,10 eller direkt genom bindning av celler/vävnader till en kraftgivare4,11,12. Dessa metoder, även om de är korrekta, är i sig låga genomströmningar och kräver vanligtvis högkvalificerade operatörer för att samla in och analysera data.
Tidigare arbete har visat att magnetfältsavkänning kringgår dessa hinder och ger en alternativ metod för att bedöma konstruerad muskelfunktion samtidigt över flera vävnadskonstruktioner13. Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bygger på denna teknik med hjälp av en enhet som kan mäta kontraktiliteten hos konstruerade muskelvävnader på ett mycket parallellt sätt som utnyttjar komplexiteten hos 3D-cellulära modeller med screening med högre genomströmning14. Plattformen möjliggör etikettfri, kvantitativ realtidsövervakning av kontraktil funktion i hjärt- och skelettmuskelvävnader i eller utanför en standardcellodlingsinkubator, vilket eliminerar behovet av optisk baserad kontraktil avbildning och analys. Denna teknik underlättar direkt jämförelse av friska och sjuka cellinjer och möjliggör mätning av ett läkemedels effekt på kontraktila vävnader, vilket fastställer kvantifierbara, in vitro-, säkerhets- och effektdata för nya och befintliga terapeutiska föreningar.
Konstruerade 3D-muskelvävnader kan tillverkas mellan två stolpar på ett mycket reproducerbart sätt med hjälp av Mantarrays förbrukningsplatta med 24 brunnar (figur 1). En stolpe är styv, medan den andra stolpen är flexibel och innehåller en liten magnet. När vävnadskonstruktionen kontraherar förskjuter den den flexibla stolpen och den inbäddade magneten. EMT-plattan är placerad i instrumentet, och postförskjutning mäts via en rad magnetiska sensorer på ett kretskort under platthållaren. De uppmätta förändringarna i magnetfältet omvandlas till absolut kontraktil kraft med hjälp av en matematisk algoritm. Instrumentet använder snabba dataprovtagningsfrekvenser för att möjliggöra insamling av detaljerad information om funktionell kapacitet och mognad hos celltyperna som analyseras, inklusive kontraktionsfrekvens, hastighet och sönderfallstid. Dessa funktionella mätningar kan erhållas över alla 24 brunnar samtidigt med den magnetiska avkänningsplattformen eller individuellt och sekventiellt med traditionella optiska metoder.
Denna studie beskriver en mycket reproducerbar metod för att konstruera 3D-skelettmuskulatur- och hjärtmikrovävnader i en fibrinbaserad hydrogel. Under en kort 80-minuters reaktion katalyserar trombin omvandlingen av fibrinogen till fibrin, vilket ger en ställning för muskelceller att utvecklas i suspenderad kultur15. Stromaceller hjälper till att omforma matrisen och vävnader blir kontraktila när muskelceller bildar ett syncytium i hydrogelen. Kontraktiliteten hos dessa vävnader analyserades med hjälp av magnetisk avkänningsmetod, både före och efter substansexponering, vilket validerade denna modalitet för användning i dos-responsläkemedelsstudier. Primära humana myoblaster från en frisk donatorbiopsi erhölls kommersiellt och odlades i 2D enligt leverantörens protokoll. Celler expanderades med hjälp av ett skelettmuskeltillväxtmedium genom tre passager för att generera tillräckligt med cellnummer för att tillverka 3D-vävnader. Stromaceller och hiPSC-härledda kardiomyocyter odlades enligt leverantörens protokoll i 3 dagar för att möjliggöra återhämtning från kryokonservering innan celler gjuts i vävnader. Representativa resultat tillhandahålls som illustrerar de typer av dataset som kan samlas in med hjälp av magnetavkänningsplattformen. Vanliga fallgropar i samband med generering av konstruerade vävnader med hjälp av dessa metoder behandlas också.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

Noggrann modellering av friska och sjukdomstillstånd in vitro är avgörande för utvecklingen av nya behandlingsstrategier och terapier. För hjärt- och skelettmuskelsjukdomar utgör kontraktil kraft och kinetik nyckeltal för att bedöma muskelfunktion. Nya och förbättrade metoder för att generera konstruerade muskelvävnader (EMT) från inducerade pluripotenta stamceller har gjort in vitro-sjukdomsmodellering mer tillförlitlig för kontraktila vävnader; Att reproducerbart tillverka vävnader från suspenderade cellkulturer och mäta deras kontraktilitet är dock utmanande. Sådana tekniker plågas ofta av höga felfrekvenser och kräver komplex instrumentering och anpassade dataanalysrutiner. En ny plattform och enhet som använder 3D EMT i kombination med en etikettfri, mycket parallell och automatiseringsvänlig kontraktilitetsanalys kringgår många av dessa hinder. Plattformen möjliggör enkel och reproducerbar tillverkning av 3D EMT med praktiskt taget vilken cellkälla som helst. Vävnadens kontraktilitet mäts sedan via ett instrument som samtidigt mäter 24 vävnader utan behov av komplexa mjukvaruanalysrutiner. Instrumentet kan på ett tillförlitligt sätt mäta mikronewtonförändringar i kraft, vilket möjliggör dosberoende screening av föreningar för att mäta effekten av ett läkemedel eller terapeutiskt på kontraktil utgång. Konstruerade vävnader tillverkade med denna enhet är fullt funktionella, genererar ryckningar och tetaniska sammandragningar vid elektrisk stimulering och kan analyseras i längdriktningen i odling under veckor eller månader. Här visar vi data från hjärtmuskel-EMT under akut och kronisk dosering med kända toxiska ämnen, inklusive ett läkemedel (BMS-986094) som drogs från kliniska prövningar efter patientdödsfall på grund av oförutsedd kardiotoxicitet. Förändrad skelettmuskelfunktion i konstruerade vävnader som svar på behandling med en myosinhämmare presenteras också. Denna plattform gör det möjligt för forskaren att integrera komplexa, informationsrika biotekniska modellsystem i sitt arbetsflöde för läkemedelsupptäckt med minimal ytterligare utbildning eller färdigheter som krävs.

Celler göts in i konstruerade muskelvävnader i 2-postförbrukningsplattan (figur 1). Framgångsrika EMT kommer att visas enhetliga, och matrisen kommer att fördelas jämnt mellan stolparna (figur 2A). Matrisen bör också lindas runt båda stolparna, vilket ger likvärdiga förankringspunkter för vävnaden. Fel i gjutning är sällsynta med denna metod och är vanligtvis uppenbara med en visuell inspektion. Misslyckad EMT-produktion kan sträcka sig från katastrofala fel, såsom vävnadsavlossning från stolparna (figur 2B) till mer subtila strukturella brister, såsom luftbubblor och lös fastsättning på stolparna (figur 2C, D). Vävnader med mindre brister kan fortfarande vara livskraftiga, men data från dessa vävnader bör undersökas noggrant för att säkerställa att de är jämförbara med kompromisslösa EMT. Till exempel kan luftbubblor i en EMT pressas ut när vävnaden komprimeras över tiden, vilket gör en fullt fungerande konstruktion utan kontraktila brister. Dessa vävnader måste dock utvärderas från fall till fall, eftersom luftbubblornas placering kan påverka funktionell återhämtning. Luftbubblor som genereras vid stolparna kan till exempel påverka vävnadsfästningen, vilket kan hindra långvarig vidhäftning till stolpen.
Vävnader börjar komprimera inom de första 24 timmarna när celler omformar matrisen i hydrogelen (figur 3). Komprimering är en gradvis process och fortsätter vanligtvis under de första 2-4 veckorna av kulturen. Sammantaget är vävnadskomprimeringen konsekvent mellan tekniska och biologiska replikat (figur 4). Det är normalt för vissa cellinjer att komprimera matrisen mer än andra eftersom vävnader mognar över tiden. Andelen myogena celler i en konstruktion påverkar hastigheten och den totala graden av EMT-komprimering. Totalt myogent innehåll för både hjärt- och skelettmuskelcellinjer bör vara över 80% för att minimera variationen mellan konstruerade vävnader. Detta är särskilt viktigt när man jämför kontraktila krafter och kinetik över cellinjer.
Inom de första dagarna efter gjutning börjar kardiomyocyter spontant slå i kultur och böjer rytmiskt den flexibla stolpen med varje muskelsammandragning. Skelettmuskelkonstruktioner kontraherar som svar på elektrisk stimulering vid dag 7 efter påbörjad differentiering. Fältstimulering applicerades på skelettmuskelvävnader via en extern stimulator fäst vid ett anpassat 24-brunns elektrodlock. Locket, tillverkat med ett par kolelektroder för varje brunn, sitter ovanpå vävnadsplattan med 24 brunnar och stimulerar samtidigt varje EMT för att inducera muskelsammandragningar. Vävnader stimulerades med hjälp av en 10 V-stimulans för 10 ms pulsvaraktigheter vid 1 Hz under funktionella mätningar. Kontraktila vävnader indikerar skelettmyoblaster som har smält samman och bildar myorör komplett med funktionella sarkomerer och kontraktila maskiner. Skelett EMT fläckar positivt för myosin tungkedja (MyHC) och dystrofin är lokaliserad till myotubemembranet och avslöjar en klassisk ringform i tvärsnittsimmunohistokemisk analys (figur 5). När EMT är funktionella kan kontraktilitet mätas dagligen i det magnetiska avkänningsinstrumentet, spårningskraft och kinetik när konstruktionerna utvecklas och mognar över tiden. Både hjärt- och skelettmuskelvävnader förblir kontraktila i veckor till månader i 3D-kultur (figur 6), och de kan användas för ett brett spektrum av kontraktilitetsstudier.
Den magnetiska detektionsmetoden kan användas för att samtidigt mäta akuta och kroniska effekter av strukturella kardiotoxiska medel, såsom doxorubicin (figur 7) och BMS-986094 (figur 8), liksom andra läkemedel som påverkar muskelkontraktiliteten. Optiska spårningsmetoder för kontraktionsdetektering kan också användas, men försiktighet måste iakttas när man studerar akuta läkemedelseffekter eftersom mätningar måste göras sekventiellt. Den förlängda livslängden för hjärt- och skelett-EMT i 3D-kultur möjliggör långsiktiga läkemedelsstudier i dessa vävnader. Detta gör det möjligt för användare att undersöka effekterna av upprepad dosering, samt fortsatt, långvarig exponering för föreningar som kan visa kardiotoxiska effekter över tid som förekommer med doxorubicin. Doxorubicin (dox) är ett läkemedel mot cancerkemoterapi17. Mängden läkemedel som administreras till patienter varierar beroende på typ av cancer, patientens ålder, patientens längd och vikt samt andra faktorer. Av denna anledning är det viktigt att testa effekten av dox över ett brett spektrum av koncentrationer och leveransscheman. Här behandlades hjärt-EMT under 27 dagar med tre separata koncentrationer (0,1 μM, 1 μM och 10 μM) dox (figur 7). Grupperna stratifierades ytterligare genom att behandla EMT vid varje koncentration med antingen en bolusbehandling eller kontinuerlig administrering med en medelförändring var 72: e timme. Brunnar som fick bolusbehandlingar av dox exponerades för läkemedlet vid tre separata tidpunkter, vilket möjliggjorde återhämtning mellan dosering. De två högsta doserna av bolus och kontinuerlig exponering visade ett omedelbart och långvarigt upphörande av kontraktil kraftgenerering under hela studien. De mellersta och lägsta koncentrationerna hade varierande effekter på vävnaderna, beroende på administreringsmetod. I den lägsta koncentrationen av läkemedlet visade bolusgruppen ingen skillnad från kontrollerna. Kontraktil kraft minskade dock efter 2 veckors kontinuerlig exponering. Mellanklasskoncentrationen av läkemedlet hade en intressant effekt. Medan kontinuerlig dosering minskade kraften under de första dagarna av behandlingen och varade under hela experimentet, visade bolusgruppen en återhämtning av kontraktil kraft tillbaka till kontrollnivåerna när läkemedlet tvättades ut efter 3 dagar. Den andra bolusen av läkemedlet orsakade emellertid ett fullständigt upphörande av kraften, följt av ingen återhämtning (figur 7), vilket indikerar att upprepad dosering vid denna koncentration kan ha en kardiotoxisk effekt hos patienter som behandlas med detta läkemedel. Den breda omfattningen av denna studie, både i tid och experimentella förhållanden, belyser användbarheten av 3D-konstruerade vävnader vid toxicitetsscreening, eftersom de förblir kontraktila och mottagliga för kemisk exponering under längre tidsperioder, vilket möjliggör långsiktiga läkemedelsstudier inom en enda uppsättning muskelvävnader. Detta underlättar inte bara identifiering av föreningar som kan ha en kardiotoxisk effekt med kronisk exponering utan också detektering av potentiell kardiotoxisk tidpunkt för administrering.
In vitro toxicitetstestning i konstruerade mänskliga muskelvävnader är ett sätt att hjälpa till att hålla mänskliga patienter säkra i kliniska prövningar. BMS-986094 är en nukleotidpolymerashämmare (NS5B) som används för att behandla hepatit C. Läkemedlet var i klinisk fas II-utveckling när Bristol-Myers Squibb avbröt utvecklingen på grund av flera fall av oväntad hjärtsvikt hos patienter18,19. Här applicerades BMS-986094 på hjärt-EMT för att testa om 3D-konstruerade muskelvävnader skulle utveckla en kardiotoxisk reaktion på läkemedlet (figur 8). Tre olika koncentrationer av läkemedlet applicerades och vävnader övervakades under 13 dagar. Kontraktil kraft sjönk med tillägg av läkemedlet på ett dosberoende sätt (figur 8A). Twitch-frekvensen påverkades också signifikant när taktfrekvensen avtog och slutligen stannade som förväntat med fortsatt exponering för den kardiotoxiska föreningen (p < 0,05, figur 8B). Dessa resultat visar hur 3D-konstruerade mänskliga muskelvävnader kan användas för att underlätta införandet av nya läkemedel på marknaden och flagga föreningar som så småningom misslyckas på grund av kardiotoxicitet. Dessutom kan denna teknik potentiellt rädda liv genom att exponera farliga läkemedel innan de sätts in i patienter i kliniska prövningar.
Förmågan att mäta effekten av akuta och kroniskt applicerade läkemedel på mänsklig kontraktil vävnad är ett viktigt första steg när man undersöker terapeutiska medel för säkerhet och effekt. Det är dock viktigt att veta att koncentrationen av läkemedel som appliceras är fysiologiskt relevant och lämplig för in vitro-testning . Skelettmuskelvävnader användes för att fastställa ett IC50-värde för 2,3-butandionmonoxim (BDM) i en full dos-responskurva. Detta läkemedel är en välkarakteriserad ATPas-hämmare av skelettmuskelmyosin-II20. BDM hämmar muskelsammandragningar genom att förhindra myosinkorsbrobildning med aktinfilamentet i sarkomerer21. Resultaten som visas här avslöjar en dosberoende minskning av absolut kraft när läkemedlet appliceras och fullständig återhämtning av kontraktil kraft när läkemedlet tvättas ut, vilket indikerar att den övergående effekten förhindrar muskelsammandragningar och inte bara dödar celler i vävnaden (figur 9A). Dessutom mättes en fullständig dos-responskurva över de sju undersökta koncentrationerna, vilket fastställde en IC50 på 3,2 mM i dessa mänskliga mikrovävnader (figur 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig01.jpg"> Figur 1: EMT-gjutning i Mantarrays förbrukningsplatta med 24 brunnar med 2 inlägg . (A) Myogena celler och stromaceller odlades på 2D-ytor före vävnadsgjutning. (B) Celler lyfts från 2D-ytor och blandas med extracellulära matrisproteiner för att bilda hydrogeler i de enskilda plattgjutningsbrunnarna som visas i insatsen. (C) 24-brunnsplatta som innehåller konstruerade vävnader i varje brunn. d) Representativa vävnader som visar avslappnade och sammandragna konstruerade muskler som jämför förskjutningen av magnetstolpen (gröna staplar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig02.jpg"> Figur 2: Framgångsrik och misslyckad EMT-gjutning . (A) Idealisk konstruerad muskelvävnad 24 timmar efter gjutning jämnt komprimerad runt stolparna med homogen cell/matrissammansättning i hela vävnaden. (B) Misslyckad EMT som visar att hydrogelen lossnar från den flexibla stolpen. (C) EMT innehållande luftbubblor i hela vävnaden. (D) Ojämn vävnadsavsättning runt båda stolparna. Vävnaden är löst förankrad i den flexibla stolpen på ena sidan. Skalstänger är 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig03.jpg"> Figur 3: Komprimering i konstruerad muskelvävnad över tid . (A) EMT-konstruktion visas 1 dag efter gjutning. Vävnader överförs till differentieringsmedium, med början dag 0 av cellfusion och hydrogelkomprimering. (B–E) Samma EMT vid dag 7 till dag 21 som visar en något kortare total längd mellan de två stolparna över tid och mindre bredd mätt genom EMT: s mittdel. Skalstänger är 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig04.jpg"> Figur 4: EMT-diameter över tid. Fyra plattor av vävnader spårades under 21 dagar och jämförde EMT-diameter under komprimering. Varje vävnad mättes genom mitten av sektionen varje vecka med optisk mikroskopi. Tidpunkter visar konsekvent EMT-storlek mellan plattorna. Maximal packning uppnås dag 21 när matrisombyggnaden stabiliseras. Tabellen visar standardavvikelsen (% av totalen) för komprimering inom varje vävnadsplatta och den genomsnittliga avvikelsen för alla plattor. Färgade staplar är enskilda plattor. Felstaplar är SD för EMT i plattor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig05.jpg"> Figur 5: Immunhistokemi av de konstruerade skelettmuskelvävnaderna. EMT fixades på dag 10 av kulturen och inbäddad i paraffin. Tunna tvärsnitt (7 μm) färgades med antikroppar mot myosin tungkedja och dystrofin före avbildning. Grön = MyHC, röd = Dystrofin, blå = DAPI. Objektivförstoring är 40X; Skalstången är 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig06.jpg"> Figur 6: Kontraktil kraft i konstruerade muskelvävnader över tid. (A) Genomsnittlig absolut ryckkraft mätt från hjärt-EMT från dag 7 till dag 63 i odling; n = 3 per grupp. (B) Genomsnittlig absolut ryckkraft i skelett-EMT härrörande från en primär cellinje dag 7 till dag 53 i odling; n = 3. Felstaplar är SD för båda diagrammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig07.jpg"> Figur 7: Akut och kronisk doxorubicinbehandling i den konstruerade muskelvävnaden. Tre separata doskoncentrationer av dox, 0,1 μM, 1 μM och 10 μM, administrerades antingen i bolus eller administrerades kontinuerligt till konstruerade muskelvävnader under 27 dagar. Bolusdoser av läkemedlet tillsattes vid medieförändringar på dag 0, 12 och 24, noterade av de gröna pilarna på X-axeln. Läkemedlet tillsattes till media vid varje mediebyte för kontinuerlig dosering, noterat av de svarta och gröna pilarna på X-axeln. Den procentuella förändringen i kraft från baslinjevärdena (pre-läkemedelsbehandling) är på Y-axeln, och tiden i behandlingsdagar är på X-axeln. Ljusorange = DMSO kontinuerlig kontroll, mörkorange = DMSO-boluskontroll, ljusgrön = 0,1 μM dox kontinuerlig, mörkgrön = 0,1 μM dox bolus, ljusblå = 1 μM dox kontinuerlig, mörkblå = 1 μM Dox bolus, ljusgul = 10 μM dox kontinuerlig, mörkgul = 10 μM dox bolus. Felstaplar är SD; n = 3 per villkor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig08.jpg"> Figur 8: Kronisk behandling med BMS-986094 i konstruerad muskelvävnad. EMT behandlades med 0.4 μM (grön), 2 μM (mörkblå) och 10 μM (ljusblå) BMS-986094 under 13 dagar. (A) Kontraktil ryckkraft (Y-axeln) minskar vid alla läkemedelskoncentrationer under de första 2 dagarna, medan kontrollvävnaderna i DMSO fortsätter att bli starkare med tiden (X-axeln). (B) Hjärtslagsfrekvensen, eller ryckfrekvensen, upphör på ett dosberoende liknande sätt i takt med att kontraktilkraften upphör som visas i diagram A. Kontrollvävnader i DMSO (grå) upprätthåller en regelbunden slagfrekvens under hela experimentet. Felstaplar är SD; n = 3 per villkor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig09.jpg"> Figur 9: Dosrespons på BDM i konstruerad skelettmuskelvävnad. (A) Absolut ryckkraft minskar på ett dosberoende sätt när primära cellhärledda EMT exponeras för 2,3-butandionmonoxim (BDM) på dag 16 i 3D-odling. Absolut ryckkraft återgår till nära baslinjevärden när läkemedlet tvättas ut. (B) Absolut ryckkraft normaliserad till baslinjevärden minskar på ett dosberoende sätt när den utsätts för BDM vilket ger en full dos-responskurva och IC50-värde; n = 4 per dos. Felstaplar är SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig09large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Detta protokoll tillhandahåller metoder för att generera 3D-konstruerade hjärt- och skelettmuskelvävnader och beskriver deras användning i prekliniska läkemedelsscreeningsmetoder. De beskrivna metoderna använder ett magnetiskt avkänningssystem för att underlätta samtidig bedömning av 24 vävnader parallellt.

Preklinisk läkemedelstestning i skalbar 3D-konstruerad muskelvävnad

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Vår plattform använder 3D-konstruerade muskelvävnader och magnetisk avkänningshårdvara för att mäta kontraktilitet över 24 brunnar samtidigt. Detta ger en högre genomströmningsmetod för att bedöma nya terapier in vitro med hjälp av humana muskelvävnader. Vår gjutningsmetod förbättrar konsistensen och reproducerbarheten vid tillverkning av 3D-konstruerade muskelvävnader.Vi har konstruerat en förbrukningsbar gjutplatta med 24 brunnar utrustad med magnetisk avkänningshårdvara för kontraktilitetsmätningar och analys på vår plattform. Denna metod kan ge värdefull insikt i in vitro-sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och genterapi för alla muskelsjukdomar som påverkar kontraktiliteten. Vi införlivar för närvarande motorneuroner i våra 3D-konstruktioner för att skapa en neuromuskulär korsningsmodell också.För att börja, placera ett förkylt vävnadsgjutningssats på ett kallt block eller is inuti cellodlingshuven. Lägg gjutplattan platt på is. Tillsätt trombin till basmediet för att göra trombinlösningen och flytta postgitteret från gjutplattan till en ny steril 24-brunnsplatta.Pipettera 50 mikroliter trombinlösning i varje förkyld brunn på gjutplattan och sätt tillbaka gitteret på satsen. Lägg gjutsatsen åt sidan på is. Tillsätt sedan 500 ml RPMI-medium, 10 ml B27 och 2,5 gram aminokapronsyra, eller ACA, för att förbereda hjärt-EMT-mediet.Ta ut EMT-mediet som kommer att användas för att gjuta vävnaderna och tillsätt 10 mikromolar ROCK-hämmare till det. Förbered skelett EMT-mediet genom att tillsätta 50 ml F10-medium och 0,25 gram aminokapronsyra, eller ACA, för primära myoblaster. Använd 0,1 gram ACA för IPSC-härledda myoblaster.Sterilfiltrera sedan gjutmediet som innehåller ACA. Värm dissociationsreagenset av cellodlingskvalitet och en lika stor volym EMT-medium till 37 grader Celsius. Detta uppvärmda EMT-medium kommer att användas för att späda dissociationsreagenset.Tvätta cellerna med PBS och tillsätt det uppvärmda dissociationsreagenset för att lyfta cellerna. Inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter eller tills cellerna har lyft och kontrollera kulturerna varannan till var tredje minut genom att knacka på sidan av plattan. När cellerna har lyft, överför dem till ett 50 ml koniskt rör.Triturera med en P-1000 pipett för att säkerställa en enda cellsuspension. Tvätta plattan och kolven med ett extra EMT-medium för att samla de återstående cellerna och tillsätt dem till det koniska röret. Återigen, triturera cellerna för att säkerställa en enda cellsuspension.Tillsätt EMT-medium för att avsluta dissociationsprocessen och ta sedan prover av cellsuspensionerna för cellantal. Utför celltal med hjälp av en automatiserad cellräknare eller en hemocytometer i trypanblått. Snurra cellerna vid 200 G i fyra minuter, aspirera supernatanten och suspendera cellerna igen i fem milliliter av EMT-basmediet för att avlägsna det återstående dissociationsreagenset.Efter centrifugering igen i fyra minuter, aspirera supernatanten och förbered cellsuspensionerna vid lämpliga densiteter. Beräkna volymerna av varje celllösning som krävs för att fylla på önskat antal vävnader och pipettera de beräknade volymerna av celler till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt 10 mikroliter fibrinogen per EMT till cellsuspensionen och lägg den på is.Se till att varje EMT har 90 mikroliter cellsuspension, 10 mikroliter fibrinogen och 50 mikroliter trombinlösning i den slutliga vävnadskonstruktionen. I en cellodlingshuv, ta bort locket på vävnadsgjutningssatsen och placera gjutplattan med stolpgitteret liggande platt på isen. Blanda cellfibrinogenblandningen och dra upp 100 mikroliter med en P-200-pipett.Tillsätt 100 mikroliter av blandningen till brunnar beredda med 50 mikroliter trombinlösning och triturera fem gånger för att blanda väl. Tryck inte pipetten förbi det första stoppet och ta bort spetsen efter trituration för att undvika att skapa bubblor. Blanda cellsuspensionen i det koniska röret innan du gjuter varje vävnad.Håll både gallret och gjutbrunnsplattan samtidigt med pekfingret och tummen på ena handen för att undvika gitterets rörelse eller lämna plattan platt på is och gunga ishinken för att se in i gjutplattan. Upprepa med en ny P-200-spets för varje vävnad tills alla vävnader är gjutna. Överför försiktigt det fröade kitet till inkubatorn och inkubera vid 37 grader Celsius i 80 minuter.Förbered sedan en ny 24-brunnsplatta med två milliliter per brunn av EMT-mediet för hjärtvävnader och inkubera plattan vid 37 grader Celsius för att värma mediet. Efter 80 minuters inkubation, tillsätt försiktigt en milliliter EMT-mediet till kanten av gjutbrunnarna och inkubera i ytterligare 10 minuter vid 37 grader Celsius. Efter 10 minuters inkubation, lyft försiktigt postgitteret och överför vävnaderna från gjutplattan till en beredd 24-brunnsplatta med det uppvärmda mediet.Slutligen återför plattorna med vävnader till cellodlingsinkubatorn vid 37 grader Celsius. Misslyckad EMT-produktion kan sträcka sig från katastrofala misslyckanden som vävnadsavskiljning från stolparna, till mer subtila strukturella brister som luftbubblor och ojämn vävnadsavsättning runt båda stolparna. EMT-konstruktion en dag efter gjutning visas här.Skelettmuskelvävnader överfördes till ett differentieringsmedium med början dag noll av cellfusion och hydrogelkomprimering. Från dag sju till dag 28 visade samma EMT en något kortare total längd mellan de två stolparna och en mindre bredd mätt genom EMT: s mittdel. Fyra plattor av vävnader spårades under 21 dagar och jämförde EMT-diameter under komprimering.Tidpunkter visar konsekvent EMT-storlek mellan plattorna. Maximal packning uppnås dag 21 när matrisombyggnaden stabiliseras. EMT: s immunhistokemi visas här.EMT fixades på dag 10 av kulturen och inbäddad i paraffin. Tunna tvärsnitt färgades med antikroppar mot myosin tung kedja och dystrofin före avbildning. Dessa grafiska bilder representerar den genomsnittliga absoluta ryckkraften mätt från hjärt-EMT och skelett-EMT över tiden.Akut och kronisk doxorubicinbehandling i konstruerade hjärtvävnader visas här. Tre olika doskoncentrationer av Dox administrerades antingen i bolus eller kontinuerligt till konstruerade hjärtvävnader under 27 dagar. Dosresponsen på BDM i konstruerad skelettmuskelvävnad presenteras i denna figur.Hjärtslagfrekvensen eller ryckfrekvensen upphör på ett dosberoende sätt i takt med att kontraktil kraft upphör, vilket indikerar kardiotoxicitet när EMT utsätts för denna förening. De viktigaste sakerna att komma ihåg när du gjuter vävnader är att hålla allt kallt hela tiden, inklusive din cellsuspension och reagens och att hålla postgitteret helt stationärt när gjutningen börjar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering och potentiella användningsområdena för en 3D vävnadstekniska Human Esophageal Mucosal Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Engineered 3D Silk-kollagenbaserad modell av polariserat Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered vaskulariserade Muskel Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En kombinerad 3D vävnadstekniska<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Lungtumör modell för att förutsäga läkemedelseffektivitet i specifika Mutations bakgrunder

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

tillämpningar av<em&gt; In Vivo</em&gt; Provning av Rat tibialis anterior för utvärdering vävnadstekniska skelettmuskulatur Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Biomekanisk karakterisering av mänskliga mjuka vävnader med hjälp av indrag och dragprovning

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiserad Contraction analys av Human Engineered hjärtvävnad för Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardiserad och skalbar analys för att studera Parfymiserad 3D angiogen Sprouting av iPSC-härledda endotelceller in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerade 3D-levermodeller för in vitro-genotoxicitytestning efter långvarig nanomaterialexponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...