Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Gıda ve İlaç İdaresi'nden (Sağlık ve Çevre Bilimleri Enstitüsü'ne verilen U01 FD006676-01) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (HL151094'ten Dr. Geisse'e) fon sağlanarak desteklenmiştir. Dr. Alec S. T. Smith'e bu yazının hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 150 (2013).</li><li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+density+on+the+maturation+and+contractile+ability+of+muscle+derived+cells+in+a+3D+tissue-engineered+skeletal+muscle+model+and+determination+of+the+cellular+and+mechanical+stimuli+required+for+the+synthesis+of+a+postural+phenotype.">The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype.</a> Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+skeletal+muscle+capable+of+functional+regeneration.">Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration.</a> BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10, 6918 (2020).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics.">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li><li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle.">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle &amp; Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+force+and+frequency+analysis+of+engineered+human+heart+tissue+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+using+magnetic+sensing.">Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing.</a> Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).</li><li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+real-time+monitoring+of+engineered+skeletal+muscle+function+using+magnetic+sensing.">High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing.</a> bioRxiv. , 492879 (2022).</li><li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thrombin-fibrinogen+interaction.">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li><li>Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin:+the+good,+the+bad+and+the+ugly+effect.">Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect.</a> Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).</li><li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+dysfunction+associated+with+a+nucleotide+polymerase+inhibitor+for+treatment+of+hepatitis+C.">Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C.</a> Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).</li><li>Gill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+cover:+Investigative+nonclinical+cardiovascular+safety+and+toxicology+studies+with+BMS-986094,+an+NS5b+RNA-dependent+RNA+polymerase+inhibitor.">From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor.</a> Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).</li><li>Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3-Butanedione+monoxime+(BDM)+as+a+myosin+inhibitor.">2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).</li><li>Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralysis+of+skeletal+muscle+by+butanedione+monoxime,+a+chemical+phosphatase.">Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+tissue+engineered+skeletal+muscle+in+vitro+is+dependent+on+the+inclusion+of+basement+membrane+proteins.">Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins.</a> Cytoskeleton. 76 (6), 371-382 (2019).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Tüm yazarlar, Mantarray donanımını ve ilgili yazılımı ticarileştiren Curi Bio Inc. şirketinde çalışanlar ve hisse senedi sahipleridir.

Bu çalışmada, 24 kuyucuklu bir sarf malzemesi döküm kiti içinde 3D mühendislik ürünü kalp ve iskelet kası dokuları oluşturma yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntemleri izleyerek, sonraki ilaç taraması için döküm hatası olmadan 24 dokudan oluşan eksiksiz bir dizi tutarlı bir şekilde elde etmek mümkündür. Böyle bir sonuca ulaşmak için kritik hususlar, döküm sırasında hidrojellerin erken polimerizasyonunu önlemek için tüm adımların buz üzerinde gerçekleştirilmesini sağlamak, doku dökümünden önce hücre ayrışma reaktifinin uzaklaştırılması, hücrenin iyice karıştırılması ve her doku için hidrojel süspansiyonu, dokular arasında pipet uçlarının değiştirilmesi ve ısıyla inaktive edilmiş FBS'nin (eğer kullanılıyorsa) kullanılmasıdır. Ayrıca, döküm başladıktan sonra post kafesin hareket ettirilmemesini ve hidrojeller oluştuktan sonra yavaşça aktarılmasını sağlamak önemlidir.
Başlıca modifikasyonlar, kardiyak ve iskeletsel EMT'lere ulaşmak için farklı hücre tiplerinin kullanılmasını ve hücresel olgunlaşmayı ve doku stabilitesini teşvik etmek için değişken konsantrasyonlarda bazal membran proteinlerine sahip hidrojellerin dopingini içerir. Bu tür dopingin yararlı etkileri duruma göre test edilmelidir, ancak belirli koşullar altında fonksiyonel sonuçları ve doku ömrünü uzattığı gösterilmiştir14,16,22. Listelenen hücre yoğunluklarının bir rehber olması ve farklı hücre hatları için optimize edilmesi gerekebileceği de dikkat çekicidir. Alternatif hidrojel bileşimleri, elde edilen EMT'lerin yapısal ve fonksiyonel özelliklerini değiştirmek için bir araç olarak da düşünülebilir23,24,25. Doğal kas mikroçevresi ayrıca vaskülarizasyonu, innervasyonu ve miyositleri form ve fonksiyonda desteklemek için matriks birikimini teşvik etmek için destekleyici hücre tiplerini içerir26,27. Burada tarif edilen sistem şu anda fibroblastları 3D kalp dokularına dahil ederken, ek hücre tipleri in vitro terapötik bileşiklerin güvenliğini ve etkinliğini incelemek için daha fizyolojik bir model oluşturabilir. Daha önce, bir dizi destekleyici hücre tipi, manyetik algılama kontraktilitesi platformu 28,29,30 kullanılarak gelecekteki çalışmalar için heyecan verici bir şablon sunan 3D mühendislik dokularına başarıyla entegre edilmiştir.
Bu protokol için sorun giderme, döküm işlemi sırasında güvenilmez veya tutarsız dokuların oluşumuna odaklanır. Hidrojellerde dökülürken kabarcık oluşumunu önlemek için özen gösterilmeli ve karıştırma sırasında hücrelerin eşit dağılımını kolaylaştırmaya devam edilmelidir. İdeal hücre yoğunluklarını, hücre oranlarını ve matris kompozisyonunu tanımlamak için her yeni hücre tipi için optimizasyon deneylerine ihtiyaç duyulacaktır.
Bu teknik için önemli bir sınırlama, 24 EMT'den oluşan tam bir plaka oluşturmak için gereken önemli sayıda hücredir. Burada sunulan veriler için plaka başına 15 milyon kardiyomiyosit ve 18 milyon iskelet miyoblastı kullanılmıştır. Bazı araştırmacılar, bu platformu en iyi şekilde kullanma yeteneklerini engelleyebilecek kadar büyük hücresel malzeme havuzlarına erişemeyebilir. Son kullanıcıların manyetik algılama donanımına erişimi yoksa, post sapmaların ölçümlerinin optik olarak yapılması gerekir, bu da verimi önemli ölçüde azaltır ve birden fazla kuyucukta kas kasılmalarının eşzamanlı olarak kaydedilmesini önler. Bununla birlikte, Mantarray donanımı, EMT büzülmesinin sürekli, invaziv olmayan analizini aynı anda birden fazla yapıda yapabilen ilk ticari sistemi sunmak için bu sınırlamaların üstesinden gelir.
24 kuyucukta manyetik algılama, EMT fonksiyonel gelişiminin gerçek zamanlı olarak uzunlamasına incelenmesini kolaylaştırır ve kimyasal, çevresel veya genetik manipülasyona karşı akut tepkilerin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar. Manyetik algılama, birden fazla doku arasında eşzamanlı ölçüm gibi çeşitli avantajlara sahipken ve karmaşık veri analizi gerektirmezken, optik algılama yöntemleri, kalsiyum akısı veya voltaj haritalaması gibi fizyolojik metriklerin eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlar. Bununla birlikte, sonuçlar bölümünde gösterilenler gibi veri kümeleri, bu teknolojinin ilaç geliştirme alanında sahip olduğu uygulamaların genişliğini göstermektedir. Piyasadaki az sayıda tahlilin, mühendislik kasındaki kontraktil çıktının doğrudan bir değerlendirmesini yapmak için araçlar sunduğu göz önüne alındığında, bu yöntemler klinik öncesi gelişim boru hattında devrim yaratma potansiyeline sahiptir.

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) modelleri, terapötik keşif ve geliştirme için klinik öncesi boru hattında ve ayrıca temel biyolojik araştırma ve hastalık modellemesindegiderek daha önemli oyuncular haline gelmektedir 1,2,3,4,5. iPSC'lerden türetilen kalp ve iskelet kası gibi kontraktil dokular, in vitro çalışmaların öngörücü gücünü geliştirmek için büyük bir potansiyele sahiptir, çünkü kas kontraktil kuvvetinin ve kinetiğin doğrudan değerlendirilmesi, genel doku fonksiyonunu incelemek için nicel metriklerdir 4,6,7,8. Tipik olarak, kontraktil kuvvet ölçümleri ya substrat saptırma 9,10'un optik izlenmesiyle dolaylı olarak ya da doğrudan hücrelerin / dokuların bir kuvvet dönüştürücü 4,11,12'ye bağlanmasıyla elde edilmiştir. Bu yöntemler, doğru olmakla birlikte, doğası gereği düşük verimlidir ve genellikle yüksek vasıflı operatörlerin veri toplamasını ve analiz etmesini gerektirir.
Önceki çalışmalar, manyetik alan algılamanın bu engelleri aştığını ve birden fazla doku yapısında aynı anda mühendislik kas fonksiyonunu değerlendirmek için alternatif bir yöntem sağladığını göstermiştir13. Mantarray (eNgineered Tissue ARRAY için Manyetometrik Analizör) 3D Kasılma Platformu, mühendislik kas dokularının kontraktilitesini yüksek oranda paralel bir şekilde ölçebilen ve daha yüksek verimli tarama14 ile 3D hücresel modellerin karmaşıklığından yararlanan bir cihaz kullanarak bu teknolojiye dayanmaktadır. Platform, standart bir hücre kültürü inkübatörünün içindeki veya dışındaki kalp ve iskelet kası dokularındaki kontraktil fonksiyonun etiketsiz, kantitatif, gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayarak optik tabanlı kasılma görüntüleme ve analiz ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu teknoloji, sağlıklı ve hastalıklı hücre hatlarının doğrudan karşılaştırılmasını kolaylaştırır ve bir ilacın kontraktil dokular üzerindeki etkisinin ölçülmesini sağlayarak yeni ve mevcut terapötik bileşikler için ölçülebilir, in vitro, güvenlik ve etkinlik verileri oluşturur.
Tasarlanmış 3D kas dokuları, Mantarray sarf malzemesi, 24 kuyucuklu döküm plakası kullanılarak iki direk arasında yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde üretilebilir (Şekil 1). Bir direk sert, diğer direk esnek ve küçük bir mıknatıs içeriyor. Doku yapısı büzüldüğünde, esnek direğin ve gömülü mıknatısın yerini alır. EMT plakası cihazın içine yerleştirilir ve yer değiştirme sonrası, plaka tutucunun altındaki bir devre kartı üzerindeki bir dizi manyetik sensör aracılığıyla ölçülür. Manyetik alanda ölçülen değişiklikler, matematiksel bir algoritma kullanılarak mutlak kontraktil kuvvete dönüştürülür. Cihaz, büzülme frekansı, hız ve bozunma süresi de dahil olmak üzere test edilen hücre tiplerinin fonksiyonel kapasitesi ve olgunluğu hakkında ayrıntılı bilgi toplanmasını sağlamak için hızlı veri örnekleme hızları kullanır. Bu fonksiyonel ölçümler, manyetik algılama platformu ile aynı anda veya geleneksel optik yöntemler kullanılarak ayrı ayrı ve sıralı olarak 24 kuyunun tamamında elde edilebilir.
Bu çalışma, fibrin bazlı bir hidrojelde 3D iskelet kası ve kalp mikrodokularının mühendisliği için oldukça tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamaktadır. Kısa, 80 dakikalık bir reaksiyon sırasında, trombin fibrinojen in dönüşümünü katalize eder ve kas hücrelerinin askıya alınmış kültür15'te gelişmesi için bir iskele sağlar. Stromal hücreler matrisin yeniden şekillendirilmesine yardımcı olur ve kas hücreleri hidrojel içinde bir sinsityum oluşturduğundan dokular kasılmaya başlar. Bu dokuların kontraktilitesi, bileşik maruziyetinden önce ve sonra manyetik algılama yaklaşımı kullanılarak analiz edildi ve doz-yanıt ilaç çalışmalarında kullanılmak üzere bu modaliteyi doğruladı. Sağlıklı bir donör biyopsisinden elde edilen birincil insan miyoblastları ticari olarak elde edildi ve satıcının protokollerine göre 2D olarak kültürlendi. Hücreler, 3D dokuları üretmek için yeterli hücre sayıları üretmek için üç pasaj boyunca bir iskelet kası büyüme ortamı kullanılarak genişletildi. Stromal hücreler ve hiPSC türevi kardiyomiyositler, hücreleri dokulara dökmeden önce kriyoprezervasyondan iyileşmeye izin vermek için 3 gün boyunca satıcının protokolüne göre kültürlendi. Manyetik algılama platformu kullanılarak toplanabilecek veri setlerinin türlerini gösteren temsili sonuçlar verilmiştir. Bu yöntemleri kullanarak mühendislik dokularının üretilmesiyle ilgili yaygın tuzaklar da ele alınmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

Sağlıklı ve hastalık durumlarının in vitro olarak doğru bir şekilde modellenmesi, yeni tedavi stratejilerinin ve terapötiklerin geliştirilmesi için hayati öneme sahiptir. Kardiyak ve iskelet kası hastalıkları için, kontraktil kuvvet ve kinetik, kas fonksiyonunu değerlendirmek için anahtar metrikleri oluşturur. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden mühendislik kas dokuları (EMT'ler) üretmek için yeni ve geliştirilmiş yöntemler, in vitro hastalık modellemesini kasılma dokuları için daha güvenilir hale getirmiştir; Bununla birlikte, askıya alınmış hücre kültürlerinden dokuları çoğaltmak ve kontraktilitelerini ölçmek zordur. Bu tür teknikler genellikle yüksek arıza oranlarıyla boğuşur ve karmaşık enstrümantasyon ve özelleştirilmiş veri analizi rutinleri gerektirir. 3D EMT'leri etiketsiz, son derece paralel ve otomasyon dostu bir sözleşmelilik testi ile birlikte kullanan yeni bir platform ve cihaz, bu engellerin çoğunu aşıyor. Platform, neredeyse tüm hücre kaynaklarını kullanarak 3D EMT'lerin kolay ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesini sağlar. Doku kontraktilitesi daha sonra karmaşık yazılım analiz rutinlerine ihtiyaç duymadan 24 dokuyu aynı anda ölçen bir cihazla ölçülür. Cihaz, kuvvetteki mikronewton değişikliklerini güvenilir bir şekilde ölçebilir ve bir ilacın veya terapinin kontraktil çıktı üzerindeki etkisini ölçmek için doza bağımlı bileşik taramasına izin verir. Bu cihazla yapılan mühendislik dokuları tamamen işlevseldir, elektriksel stimülasyon üzerine seğirme ve tetanik kasılmalar üretir ve haftalar veya aylar boyunca kültürde uzunlamasına analiz edilebilir. Burada, beklenmedik kardiyotoksisiteye bağlı hasta ölümlerinden sonra klinik çalışmalardan alınan bir ilaç (BMS-986094) da dahil olmak üzere, bilinen toksik maddelerle akut ve kronik dozlama altındaki kalp kası EMT'lerinden elde edilen verileri gösteriyoruz. Bir miyozin inhibitörü ile tedaviye yanıt olarak mühendislik dokularında değişmiş iskelet kası fonksiyonu da sunulmaktadır. Bu platform, araştırmacının karmaşık, bilgi açısından zengin biyomühendislik model sistemlerini, gereken minimum ek eğitim veya beceri ile ilaç keşif iş akışına entegre etmesini sağlar.

Hücreler, 2 postlu sarf malzemesi plakasındaki mühendislik kas dokularına döküldü (Şekil 1). Başarılı EMT'ler tek tip görünecek ve matris direkler arasında eşit olarak dağıtılacaktır (Şekil 2A). Matris ayrıca her iki direğin etrafını sarmalı ve doku için eşdeğer bağlantı noktaları üretmelidir. Dökümdeki başarısızlıklar bu yöntemle nadirdir ve genellikle görsel bir inceleme ile belirgindir. Başarısız EMT üretimi, direklerden doku ayrılması gibi yıkıcı başarısızlıklardan (Şekil 2B), hava kabarcıkları ve direklere gevşek bağlanma gibi daha ince yapısal kusurlara (Şekil 2C, D) kadar değişebilir. Küçük kusurları olan dokular hala uygulanabilir olabilir, ancak bu dokulardan elde edilen veriler, ödün vermeyen EMT'lerle karşılaştırılabilir olduğundan emin olmak için dikkatlice incelenmelidir. Örneğin, bir EMT içindeki hava kabarcıkları, doku zamanla sıkıştıkça sıkılabilir ve bu da kontraktil eksiklikler olmadan tamamen işlevsel bir yapı oluşturur. Bununla birlikte, hava kabarcıklarının yeri fonksiyonel iyileşmeyi etkileyebileceğinden, bu dokular duruma göre değerlendirilmelidir. Örneğin, direklerde oluşan hava kabarcıkları, doku bağlanmasını etkileyebilir ve bu da direğe uzun süreli yapışmayı engelleyebilir.
Dokular ilk 24 saat içinde sıkışmaya başlar, çünkü hücreler hidrojel içindeki matrisi yeniden şekillendirir (Şekil 3). Sıkıştırma kademeli bir süreçtir ve genellikle kültürün ilk 2-4 haftasında ilerler. Genel olarak, doku sıkıştırması teknik ve biyolojik replikasyonlar arasında tutarlıdır (Şekil 4). Bazı hücre hatlarının, dokular zamanla olgunlaştıkça matrisi diğerlerinden daha fazla sıkıştırması normaldir. Bir yapı içindeki miyojenik hücrelerin yüzdesi, EMT sıkıştırma oranını ve genel derecesini etkiler. Hem kardiyak hem de iskelet kası hücre hatları için toplam miyojenik içerik, mühendislik dokuları arasındaki varyasyonu en aza indirmek için% 80'in üzerinde olmalıdır. Bu, hücre hatları boyunca kasılma kuvvetlerini ve kinetiği karşılaştırırken özellikle önemlidir.
Dökümden sonraki ilk birkaç gün içinde, kardiyomiyositler kültürde kendiliğinden atmaya başlar ve her kas kasılmasında esnek direği ritmik olarak büker. İskelet kası yapıları, farklılaşmaya başladıktan sonra 7. günde elektriksel stimülasyona yanıt olarak büzülür. Alan stimülasyonu, iskelet kası dokularına, özel bir 24 delikli elektrot kapağına tutturulmuş harici bir stimülatör aracılığıyla uygulandı. Her kuyucuk için bir çift karbon elektrot ile imal edilen kapak, 24 kuyucuklu doku plakasının üzerine oturur ve aynı anda her EMT'yi kas kasılmalarını tetiklemek için uyarır. Dokular, fonksiyonel ölçümler sırasında 1 Hz'de 10 ms darbe süreleri için 10 V'luk bir uyaran kullanılarak hızlandırıldı. Kasılma dokuları, fonksiyonel sarkomerler ve kontraktil makinelerle tamamlanmış miyotüpler oluşturan, kaynaşmış iskelet miyoblastlarını gösterir. İskelet EMT'leri miyozin ağır zinciri (MyHC) için pozitif boyanır ve distrofin miyotüp membranına lokalize olarak kesitsel immünohistokimyasal analizde klasik bir halka şekli ortaya çıkar (Şekil 5). EMT'ler işlevsel hale geldiğinde, kontraktilite, manyetik algılama cihazında günlük olarak ölçülebilir, yapılar zamanla geliştikçe ve olgunlaştıkça kuvvet ve kinetiği izleyebilir. Hem kalp hem de iskelet kası dokuları 3D kültürde haftalarca veya aylarca kasılmaya devam eder (Şekil 6) ve çok çeşitli kontraktilite çalışmaları için kullanılabilirler.
Manyetik algılama yaklaşımı, doksorubisin (Şekil 7) ve BMS-986094 (Şekil 8) gibi yapısal kardiyotoksikanların akut ve kronik etkilerini ve kas kontraktilitesini etkileyen diğer ilaçları aynı anda ölçmek için kullanılabilir. Kasılma tespitinin optik izleme yöntemleri de kullanılabilir, ancak ölçümler sırayla alınmalıdır, çünkü akut ilaç etkilerini incelerken dikkatli olunmalıdır. 3D kültürde kardiyak ve iskelet EMT'lerinin uzun ömürlü olması, bu dokularda uzun süreli ilaç çalışmalarına olanak sağlamaktadır. Bu, kullanıcıların tekrarlanan dozlamanın etkilerini keşfetmelerine ve ayrıca doksorubisin ile meydana geldiği gibi zamanla kardiyotoksik etkiler gösterebilecek bileşiklere uzun süreli maruz kalmalarına izin verir. Doksorubisin (dox) bir anti-kanser kemoterapi ilacıdır17. Hastalara uygulanan ilaç miktarı, kanser türüne, hastanın yaşına, hastanın boyuna ve kilosuna ve diğer faktörlere bağlı olarak değişir. Bu nedenle, dox'un etkisini çok çeşitli konsantrasyonlarda ve teslimat programlarında test etmek önemlidir. Burada, kardiyak EMT'ler 27 gün boyunca üç ayrı doks konsantrasyonu (0.1 μM, 1 μM ve 10 μM) ile tedavi edildi (Şekil 7). Gruplar, EMT'leri her konsantrasyonda bir bolus tedavisi veya her 72 saatte bir orta bir değişiklikle sürekli uygulama ile tedavi ederek daha da tabakalaştırıldı. Doks'un bolus tedavileri verilen kuyular, ilaca üç ayrı zaman noktasında maruz bırakıldı ve dozlama arasında iyileşmeye izin verildi. En yüksek iki bolus dozu ve sürekli maruziyet, çalışma boyunca kontraktil kuvvet üretiminin derhal ve uzun süreli bir şekilde durduğunu göstermiştir. Orta ve en düşük konsantrasyonların, uygulama yöntemine bağlı olarak dokular üzerinde değişen etkileri vardı. İlacın en düşük konsantrasyonunda, bolus grubu kontrollerden hiçbir fark göstermedi. Bununla birlikte, kasılma kuvveti 2 haftalık sürekli maruziyetten sonra azalmıştır. İlacın orta aralıklı konsantrasyonu ilginç bir etkiye sahipti. Sürekli dozlama, tedavinin ilk birkaç günü boyunca kuvveti azaltırken ve deney boyunca sürerken, bolus grubu, ilaç 3 gün sonra yıkandığında kontraktil kuvvetin kontrol seviyelerine geri kazanıldığını gösterdi. Bununla birlikte, ilacın ikinci bolusu kuvvetin tamamen durmasına neden oldu, ardından iyileşme olmadı (Şekil 7), bu konsantrasyonda tekrar tekrar dozlamanın bu ilaçla tedavi edilen hastalarda kardiyotoksik bir etkiye sahip olabileceğini gösteriyor. Bu çalışmanın geniş kapsamı, hem zaman hem de deneysel koşullarda, 3D mühendislik dokularının toksisite taramasındaki faydasını vurgulamaktadır, çünkü uzun süre boyunca kasılmaya ve kimyasal maruziyete duyarlı kaldıklarından, tek bir kas dokusu seti içinde uzun süreli ilaç çalışmalarına izin vermektedir. Bu sadece kronik maruziyet ile kardiyotoksik etkiye sahip olabilecek bileşiklerin tanımlanmasını değil, aynı zamanda potansiyel kardiyotoksik uygulama zamanlamasının tespit edilmesini de kolaylaştırır.
Mühendislik ürünü insan kas dokularında in vitro toksisite testi, klinik çalışmalarda insan hastalarını güvende tutmaya yardımcı olmanın bir yoludur. BMS-986094, hepatit C tedavisinde kullanılan bir nükleotid polimeraz (NS5B) inhibitörüdür. İlaç, Bristol-Myers Squibb'in18,19 hastalarında beklenmedik kalp yetmezliği vakaları nedeniyle gelişimini durdurduğunda Faz II klinik gelişimindeydi. Burada, BMS-986094, 3D mühendislik kas dokularının ilaca karşı kardiyotoksik bir reaksiyon geliştirip geliştirmeyeceğini test etmek için kardiyak EMT'lere uygulandı (Şekil 8). İlacın üç farklı konsantrasyonu uygulandı ve dokular 13 gün boyunca izlendi. Kasılma kuvveti, ilacın doza bağımlı bir şekilde eklenmesiyle düştü (Şekil 8A). Vuruş hızı yavaşladığı için Twitch sıklığı da önemli ölçüde etkilendi ve sonunda kardiyotoksik bileşiğe sürekli maruz kalma ile beklendiği gibi durdu (p < 0.05, Şekil 8B). Bu sonuçlar, 3D mühendislik ürünü insan kas dokularının piyasaya yeni ilaçlar getirmeyi kolaylaştırmak ve sonunda kardiyotoksisite nedeniyle başarısız olan bileşikleri işaretlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Dahası, bu teknoloji, tehlikeli ilaçları klinik çalışmalarda hastalara sunulmadan önce açığa çıkararak potansiyel olarak hayat kurtarabilir.
Akut ve kronik olarak uygulanan ilaçların insan kontraktil dokusu üzerindeki etkisini ölçme yeteneği, güvenlik ve etkinlik için terapötikleri araştırırken hayati bir ilk adımdır. Bununla birlikte, uygulanan ilaçların konsantrasyonunun fizyolojik olarak alakalı ve in vitro testler için uygun olduğunu bilmek önemlidir. İskelet kası dokuları, tam doz-yanıt eğrisinde 2,3-Bütandion monoksim (BDM) için bir IC50 değeri oluşturmak için kullanıldı. Bu ilaç, iskelet kası miyosin-II20'nin iyi karakterize edilmiş bir ATPaz inhibitörüdür. BDM, sarkomer21'de aktin filament ile miyozin çapraz köprü oluşumunu önleyerek kas kasılmalarını inhibe eder. Burada gösterilen sonuçlar, ilaç uygulandığında mutlak kuvvette doza bağlı bir azalma ve ilaç yıkandığında kontraktil kuvvetin tamamen geri kazanıldığını ortaya koymaktadır, bu da geçici etkinin sadece doku içindeki hücreleri öldürmek değil, kas kasılmalarını önlediğini göstermektedir (Şekil 9A). Ayrıca, incelenen yedi konsantrasyon boyunca tam bir doz-yanıt eğrisi ölçüldü ve bu insan mikrodokularında 3.2 mM'lik bir IC50 oluşturuldu (Şekil 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig01.jpg"> Şekil 1: 2 postlu Mantarray sarf malzemesi 24 delikli plakada EMT dökümü . (A) Miyojenik ve stromal hücreler, doku dökümünden önce 2D yüzeylerde kültürlendi. (B) Hücreler 2B yüzeylerden kaldırılır ve girişte gösterilen bireysel plaka döküm kuyularında hidrojeller oluşturmak için hücre dışı matris proteinleri ile karıştırılır. (C) Her kuyuda mühendislik dokuları içeren 24 kuyucuklu plaka. (D) Manyetik direğin (yeşil çubuklar) yer değiştirmesini karşılaştıran, gevşemiş ve kasılmış mühendislik kası gösteren temsili dokular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig02.jpg"> Şekil 2: Başarılı ve başarısız EMT dökümü . (A) İdeal mühendislik kas dokusu 24 saat döküm sonrası, doku boyunca homojen hücre / matris bileşimi ile direklerin etrafına düzgün bir şekilde sıkıştırılmıştır. (B) Hidrojelin esnek direkten ayrılmasını gösteren başarısız EMT. (C) Doku boyunca hava kabarcıkları içeren EMT. (D) Her iki direğin etrafında eşit olmayan doku birikimi. Doku, bir taraftaki esnek direğe gevşek bir şekilde sabitlenir. Ölçek çubukları 1 mm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig03.jpg"> Şekil 3: Zamanla mühendislik kas dokusunda sıkıştırma. (A) EMT yapısı dökümden 1 gün sonra gösterilmiştir. Dokular, hücre füzyonu ve hidrojel sıkıştırmasının 0. gününden başlayarak farklılaşma ortamına aktarılır. (B-E) 7. günden 21. güne kadar aynı EMT, zaman içinde iki gönderi arasında biraz daha kısa bir toplam uzunluk ve EMT'nin orta bölümünden ölçüldüğünde daha küçük bir genişlik göstermektedir. Ölçek çubukları 1 mm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig04.jpg"> Şekil 4: Zaman içinde EMT çapı. Dört doku plakası 21 gün boyunca izlendi ve sıkıştırma boyunca EMT çapı karşılaştırıldı. Her doku, optik mikroskopi kullanılarak her hafta orta bölümden ölçüldü. Zaman noktaları, plakalar arasında tutarlı EMT boyutu gösterir. Matris yeniden şekillendirme stabilize edildiğinden maksimum sıkıştırmaya 21. günde ulaşılır. Tablo, her bir doku plakası içindeki sıkıştırmanın standart sapmasını (toplamın % 'si) ve tüm plakalar için ortalama sapmayı göstermektedir. Renkli çubuklar ayrı ayrı plakalardır. Hata çubukları, plakalar içindeki EMT'lerin SD'sidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig05.jpg"> Şekil 5: Tasarlanmış iskelet kası dokularının immünohistokimyası. EMT'ler kültürün 10. gününde sabitlendi ve parafine gömüldü. İnce kesitler (7 μm) görüntüleme öncesinde miyozin ağır zincir ve distrofine karşı antikorlarla boyandı. Yeşil = MyHC, kırmızı = Distrofin, mavi = DAPI. Objektif büyütme 40X'tir; ölçek çubuğu 50 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig06.jpg"> Şekil 6: Zamanla mühendislik kas dokularında kasılma kuvveti. (A) Kültürde 7. günden 63. güne kadar kardiyak EMT'lerden ölçülen ortalama mutlak seğirme kuvveti; n = grup başına 3. (B) Kültürde 7. günden 53. güne kadar birincil hücre hattından türetilen iskelet EMT'lerinde ortalama mutlak seğirme kuvveti; n = 3. Hata çubukları her iki grafik için de SD'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig07.jpg"> Şekil 7: Mühendislik kas dokusunda akut ve kronik doksorubisin tedavisi. Üç ayrı doz doks konsantrasyonu, 0.1 μM, 1 μM ve 10 μM, bolus içinde verildi veya 27 gün boyunca mühendislik kas dokularına sürekli olarak uygulandı. İlacın Bolus dozları, X eksenindeki yeşil oklarla belirtilen 0, 12 ve 24. günlerdeki medya değişikliklerinde eklendi. İlaç, X eksenindeki siyah ve yeşil oklarla belirtilen sürekli dozlama için her medya değişikliğinde medyaya eklendi. Temel değerlerden (ilaç öncesi tedavi) kuvvetteki yüzde değişim Y eksenindedir ve tedavi günlerindeki süre X eksenindedir. Açık turuncu = DMSO sürekli kontrol, koyu turuncu = DMSO bolus kontrolü, açık yeşil = 0,1 μM dox sürekli, koyu yeşil = 0,1 μM dox bolus, açık mavi = 1 μM dox sürekli, koyu mavi = 1 μM Dox bolus, açık sarı = 10 μM dox sürekli, koyu sarı = 10 μM dox bolus. Hata çubukları SD'dir; n = koşul başına 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig08.jpg"> Şekil 8: Mühendislik kas dokusunda BMS-986094 ile kronik tedavi. EMT'ler 13 gün boyunca 0.4 μM (yeşil), 2 μM (koyu mavi) ve 10 μM (açık mavi) BMS-986094 ile tedavi edildi. (A) Kasılma seğirme kuvveti (Y ekseni) ilk 2 günde tüm ilaç konsantrasyonlarında azalırken, DMSO'daki kontrol dokuları zamanla güçlenmeye devam eder (X ekseni). (B) Kardiyak atış hızı veya seğirme frekansı, grafik A'da gösterilen kasılma kuvvetinin durmasıyla birlikte doza bağımlı bir şekilde durur. Hata çubukları SD'dir; n = koşul başına 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig08large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig09.jpg"> Şekil 9: Mühendislik iskelet kası dokularında BDM'ye doz-yanıt . (A) Mutlak seğirme kuvveti, birincil hücre kaynaklı EMT'ler 3D kültürde 16. günde 2,3-Bütandion monoksimine (BDM) maruz kaldığında doza bağımlı bir şekilde azalır. Mutlak seğirme kuvveti, ilaç yıkandığında taban çizgisine yakın değerlere geri döner. (B) Temel değerlere normalleştirilmiş mutlak seğirme kuvveti, BDM'ye maruz kaldığında doza bağımlı bir şekilde azalır ve tam doz-yanıt eğrisi ve IC50 değeri verir; n = doz başına 4. Hata çubukları SD'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig09large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Bu protokol, 3D mühendislik ürünü kalp ve iskelet kası dokularının oluşturulması için yöntemler sağlar ve klinik öncesi ilaç tarama modalitelerinde kullanımlarını açıklar. Açıklanan yöntemler, 24 dokunun paralel olarak eşzamanlı olarak değerlendirilmesini kolaylaştırmak için manyetik bir algılama sistemi kullanır.

Ölçeklenebilir 3D Mühendislik Kas Dokularında Preklinik İlaç Testi

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Platformumuz, aynı anda 24 kuyucukta kontraktiliteyi ölçmek için 3D mühendislik kas dokuları ve manyetik algılama donanımı kullanır. Bu, insan kas dokularını kullanarak in vitro olarak yeni terapötikleri değerlendirmek için daha yüksek bir verim yöntemi sağlar. Döküm yöntemimiz, 3D mühendislik kas dokularının imalatında tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği artırır.Platformumuzda kontraktilite ölçümleri ve analizleri için manyetik algılama donanımı ile donatılmış 24 delikli bir sarf malzemesi döküm plakası tasarladık. Bu yöntem, kontraktiliteyi etkileyen herhangi bir kas hastalığı için in vitro hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve gen terapisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Şu anda nöromüsküler bir bağlantı modeli oluşturmak için motor nöronları 3D yapılarımıza dahil ediyoruz.Başlamak için, önceden soğutulmuş bir doku döküm kitini, hücre kültürü başlığının içindeki soğuk bir bloğa veya buza yerleştirin. Döküm plakasını buz üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Trombin çözeltisini yapmak için taban ortamına trombin ekleyin ve post kafesi döküm plakasından yeni bir steril 24 delikli plakaya taşıyın.Pipet, döküm plakasının önceden soğutulmuş her bir kuyucuğuna 50 mikrolitre trombin çözeltisi yerleştirin ve kafesi tekrar kit üzerine yerleştirin. Döküm kitini buz üzerinde bir kenara koyun. Daha sonra, kardiyak EMT ortamını hazırlamak için 500 mililitre RPMI ortamı, 10 mililitre B27 ve 2.5 gram aminokaproik asit veya ACA ekleyin.Dokuları dökmek için kullanılacak EMT ortamını çıkarın ve üzerine 10 mikromolar ROCK inhibitörü ekleyin. Primer miyoblastlar için 50 mililitre F10 ortamı ve 0.25 gram aminokaproik asit veya ACA ekleyerek iskelet EMT ortamını hazırlayın. IPSC kaynaklı miyoblastlar için 0.1 gram ACA kullanın.Ardından, ACA içeren döküm ortamını steril olarak filtreleyin. Hücre kültürü sınıfı ayrışma reaktifini ve eşit hacimli EMT ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın. Bu ısıtılmış EMT ortamı, ayrışma reaktifini seyreltmek için kullanılacaktır.Hücreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri kaldırmak için ısıtılmış ayrışma reaktifini ekleyin. Beş dakika boyunca veya hücreler kalkıncaya kadar 37 santigrat derecede inkübe edin ve plakanın yan tarafına dokunarak kültürleri her iki ila üç dakikada bir kontrol edin. Hücreler kalktıktan sonra, onları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için P-1000 pipetle tritüre edin. Kalan hücreleri toplamak ve konik tüpe eklemek için plakayı ve şişeyi ek bir EMT ortamı ile yıkayın. Yine, tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücreleri tritüre edin.Ayrışma işlemini sonlandırmak için EMT ortamı ekleyin ve ardından hücre sayımları için hücre süspansiyonlarının örneklerini alın. Otomatik bir hücre sayacı veya tripan mavisi renkte bir hemositometre kullanarak hücre sayımları gerçekleştirin. Hücreleri dört dakika boyunca 200 G'de döndürün, süpernatanı aspire edin ve artık ayrışma reaktifini çıkarmak için hücreleri EMT baz ortamının beş mililitresinde yeniden askıya alın.Dört dakika boyunca tekrar santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı aspire edin ve hücre süspansiyonlarını uygun yoğunluklarda hazırlayın. İstenilen doku sayısını oluşturmak için gereken her hücre çözeltisinin hacimlerini hesaplayın ve hesaplanan hücre hacimlerini 15 mililitrelik bir konik tüpe pipetleyin. EMT başına hücre süspansiyonuna 10 mikrolitre fibrinojen ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.Her EMT'nin son doku yapısında 90 mikrolitre hücre süspansiyonu, 10 mikrolitre fibrinojen ve 50 mikrolitre trombin çözeltisi olduğundan emin olun. Bir hücre kültürü başlığında, doku döküm kitinin kapağını çıkarın ve döküm plakasını, buzun üzerinde düz duran post kafesi ile yerleştirin. Hücre fibrinojen karışımını karıştırın ve bir P-200 pipet ile 100 mikrolitre çekin.50 mikrolitre trombin çözeltisi ile hazırlanan kuyucuklara 100 mikrolitre karışım ekleyin ve iyice karıştırmak için beş kez tritüre edin. Pipetin ilk durağın ötesine itilmemesi ve herhangi bir kabarcık oluşmasını önlemek için tritürasyondan sonra ucu çıkarmayın. Her dokuyu dökmeden önce hücre süspansiyonunu konik tüpte karıştırın.Kafesin herhangi bir hareketini önlemek için hem kafesi hem de döküm kuyusu plakasını aynı anda bir elinizin işaretçi parmağını ve başparmağını kullanarak tutun veya plakayı buz üzerinde düz bırakın ve döküm plakasını görmek için buz kovasını sallayın. Tüm dokular dökülene kadar her doku için taze bir P-200 ucu ile tekrarlayın. Tohumlanmış kiti dikkatlice inkübatöre aktarın ve 80 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Daha sonra, kalp dokuları için EMT ortamının kuyucuğu başına iki mililitre içeren taze bir 24 delikli plaka hazırlayın ve ortamı ısıtmak için plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. 80 dakikalık inkübasyondan sonra, döküm kuyularının kenarına yavaşça bir mililitre EMT ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, post kafesi dikkatlice kaldırın ve dokuları döküm plakasından ısıtılmış ortamla hazırlanmış 24 delikli bir plakaya aktarın.Son olarak, dokulu plakaları hücre kültürü inkübatörüne 37 santigrat derecede geri getirin. Başarısız EMT üretimi, direklerden doku ayrılması gibi yıkıcı başarısızlıklardan, hava kabarcıkları ve her iki direğin etrafında eşit olmayan doku birikimi gibi daha ince yapısal kusurlara kadar değişebilir. Dökümden bir gün sonra EMT yapısı burada gösterilmektedir.İskelet kası dokuları, hücre füzyonu ve hidrojel sıkıştırmasının sıfır gününden itibaren bir farklılaşma ortamına transfer edildi. Yedinci günden 28. güne kadar, aynı EMT, iki direk arasında biraz daha kısa bir toplam uzunluk ve EMT'nin orta bölümünden ölçüldüğünde daha küçük bir genişlik gösterdi. Sıkıştırma boyunca EMT çapı karşılaştırılarak 21 gün boyunca dört doku plakası izlendi.Zaman noktaları, plakalar arasında tutarlı EMT boyutu gösterir. Matris yeniden şekillenmesi stabilize edildiğinden maksimum sıkıştırmaya 21. günde ulaşılır. EMT'lerin immünohistokimyası burada tasvir edilmiştir.EMT'ler kültürün 10. gününde sabitlendi ve parafine gömüldü. İnce kesitler görüntüleme öncesinde miyozin ağır zincir ve distrofine karşı antikorlarla boyandı. Bu grafik görüntüler, zaman içinde kardiyak EMT'lerden ve iskelet EMT'lerinden ölçülen ortalama mutlak seğirme kuvvetini temsil eder.Mühendislik kalp dokularında akut ve kronik doksorubisin tedavisi burada gösterilmiştir. Dox'un üç farklı doz konsantrasyonu bolus içinde verildi veya 27 gün boyunca mühendislik kalp dokularına sürekli olarak uygulandı. Mühendislik iskelet kası dokularında BDM'ye doz yanıtı bu şekilde sunulmuştur.Kardiyak atış hızı veya seğirme sıklığı, EMT'ler bu bileşiğe maruz kaldığında kardiyotoksisiteyi gösteren kontraktil kuvvetin kesilmesiyle birlikte doza bağımlı bir şekilde durur. Doku dökümü sırasında hatırlanması gereken en önemli şey, hücre süspansiyonunuz ve reaktifleriniz de dahil olmak üzere her zaman her şeyi soğuk tutmak ve döküm başladıktan sonra post kafesi tamamen sabit tutmaktır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered Vaskülarize Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Uygulamaları<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Girinti ve Çekme Test Kullanarak İnsan Yumuşak Doku biyomekanik Karakterizasyonu

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...