Name: extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles
Uploaded: 2022-11-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

يقر المؤلفون بالدعم المقدم من جائزة كويني فيكتورينا نيري للباحثين (D.J.) وجائزة Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). يتم دعم NLG من خلال منحة تدريب ما بعد الدكتوراه للخلايا الجذعية والطب التجديدي في NYSTEM.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في طب وايل كورنيل. تم إجراء جميع تجارب زرع الأجانب باستخدام أنسجة المبيض وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. تم عزل كلا المبيضين من متبرع عضو ميت دماغيا يبلغ من العمر 14 عاما و?...

<ol>
	<li>Aghadavod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+granulosa+cells+from+follicular+fluid;+Applications+in+biomedical+and+molecular+biology+experiments.">Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments.</a> Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+antral+follicles+of+xenograft+versus+ovarian+origin+reveals+disparate+molecular+signatures.">Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures.</a> Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).</li><li>Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+primordial+follicles+following+prolonged+transportation+of+ovarian+tissue+prior+to+cryopreservation.">Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation.</a> Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).</li><li>Jensen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+transplantations+of+cryopreserved+ovarian+tissue+to+41+women+in+Denmark.">Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark.</a> Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).</li><li>Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+storage+and+grafting+of+human+ovarian+tissue.">Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.</a> Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+superphysiologic+AMH+promotes+premature+luteinization+of+antral+follicles+in+human+ovarian+xenografts.">Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts.</a> Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicular+theca+cell+recruitment,+differentiation,+and+impact+on+fertility:+2017+update.">Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update.</a> Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).</li><li>Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+theca+cells+from+ovarian+cells+isolated+from+postmenopausal+women.">In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women.</a> Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).</li><li>Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+human+theca+stem+cells+and+their+differentiation+into+theca+progenitor+cells.">Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).</li></ol>

يعد تحسين دقة التنوع الخلوي داخل بصيلات المبيض أمرا مهما سريريا لعدة أسباب. عند تطبيق البروتوكول أعلاه على عزل الأنواع الفرعية المظهرية الفريدة الموجودة داخل بصيلات المرحلة الغارية ، يجب مراعاة عدة عوامل. أولا ، تعد صحة وصلاحية أنسجة المبيض التي تستمد منها الجريب الغاري أمرا بالغ الأهمي?...

العناصر الوظيفية الأساسية للمبيض البشري هي البصيلات التي تحكم نمو وتطور البويضات. تم وضع بروتوكولات عزل الخلايا المسامية بشكل جيد في سياق الإخصاب في المختبر ، ولكنها مناسبة فقط لجمع الخلايا من بصيلات اللوتين عند نقطة استرجاع البويضة1. لقد طورنا بروتوكولا يتيح عزل مجموعات الخلايا المنفصلة من الجريبات الغارية في مراحل النمو المختلفة التي تنشأ من المبايض الأصلية أو أنسجة المبيض المزروعةبالأجانب 2. على الرغم من وجود إجماع على أن مساهمات الخلايا المقيمة في الجريب في زراعة البويضة مهمة للغاية ، إلا أن القليل من الدراسات قد حددت واستخرجت الأنواع الفرعية المظهرية الفريدة الموجودة في بصيلات المرحلة الغارية. إن الفهم الأعمق للتسلسل الهرمي للتمايز ونقل الإشارات بين الخلايا المتخصصة خلال مراحل النمو المختلفة يمكن أن يوسع فهمنا لفسيولوجيا المبيض في ظل الظروف الاستتبابية والمرضية. علاوة على ذلك ، فإن التمييز بين الأنواع الفرعية الخلوية المنفصلة ومساهماتها الجزيئية في نمو / نضج الجريب قد يوفر وسيلة لتوليد بدائل خارج الجسم الحي تعيد بناء وظيفة المبيض لتعزيز نضوج البويضة و / أو علاج ضعف الغدد الصماء. 
يساهم كل نوع فريد من الخلايا داخل المبيض في الوظيفة المعقدة للجريب ، والتي تعمل بشكل فعال كعضو صغير منفصل لتعزيز نمو ونضج البويضة التي تحتوي عليها. يتم تغليف البويضة ، وهي محور الجريب ، مباشرة بطبقة مستمرة من الخلايا الحبيبية (GCs) ، حيث تشكل خلايا الثيكا (TCs) طبقة ثانوية من الخلايا التي تتحد مع البويضة و GCs لتكوين الوحدة المسامية. على الرغم من تصنيفها إلى مجموعتين ، إلا أن GCs و TCs تحتوي على العديد من الأنواع الفرعية. يتم تصنيف GCs وفقا لموقعها داخل المسام ؛ يتم تعيين GCs التي تحيط بالبويضة مقابل تلك المجاورة للغشاء القاعدي على أنها GCs بيضوية وجدارية ، على التوالي ، وتعرض هذه الأنواع الفرعية توقيعات نسخية فريدة. تحتوي TCs على العديد من الأنواع الفرعية التي تعمل على توفير الدعم الستيرويدي والأيضي والهيكلي. تلعب الخلايا البطانية وحول الأوعية الدموية والخلايا المناعية دورا مركزيا في الحفاظ على فسيولوجيا المبيض الطبيعية. لا تعمل سدى المبيض كركيزة لنمو الجريب فحسب ، بل من المحتمل أيضا أن توفر مصدرا للأسلاف التي تؤدي إلى ظهور TCs. هذا المركب متعدد الطبقات من الأنواع الفرعية الخلوية داخل المبيض هو ما يمكن من وظيفته كعضو غدد صماء وعضو تناسلي.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتحديد وتنقية الخلايا الحبيبية ، الثيكا ، اللحمية ، البطانية ، والمكونة للدم من الجريبات الغارية. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لعزل خلايا المبيض هذه وتحليلها باستخدام تسلسل الخلية الواحدة ، متبوعا بتلطيخ محدد في بصيلات مراحل النمو المختلفة. يوفر البروتوكول منهجية مباشرة قابلة للتكرار وستمكن من التحليل عالي الدقة لكل من فسيولوجيا وأمراض المبيض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Anti-Anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mountant solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td>ProLong Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C 2674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D 2650</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cell Detachment Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat-inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td>no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S 1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 69.64 mL of Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 17.66 mL of fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 3.42 g of sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 10.65 mL of DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 1 mL of antibiotic-antimycotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Plasticware and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>CryoTube 1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430599</td>
			<td>60EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANPEP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB7227A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD55</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>311306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 99</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>371308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVRL</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long forceps (~150 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium forceps (~110 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 21 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>EF7281H</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 11 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>&#160;FH/CX7281A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp fine curved scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz Flourescence activated cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 META Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles

يعد تنشيط البويضات ونموها وتطورها ونضجها عملية معقدة يتم تنسيقها ليس فقط بين أنواع متعددة من خلايا المبيض ولكن أيضا عبر نقاط تحكم متعددة داخل دائرة المهاد / الغدة النخامية / المبيض. داخل المبيض ، تنمو أنواع متعددة من الخلايا المتخصصة في ارتباط وثيق مع البويضة داخل جريبات المبيض. تم وصف بيولوجيا هذه الخلايا بشكل جيد في المراحل اللاحقة ، عندما يتم استردادها بسهولة كمنتجات ثانوية للعلاجات الإنجابية المساعدة. ومع ذلك ، فإن التحليل المتعمق للجريبات الغارية الصغيرة المعزولة مباشرة من المبيض لا يتم إجراؤه بشكل شائع بسبب ندرة أنسجة المبيض البشري ومحدودية الوصول إلى المبيض في المرضى الذين يخضعون للعلاج الإنجابي المساعد. 
تتيح طرق معالجة المبايض الكاملة للحفظ بالتبريد للشرائط القشرية مع التحديد / العزل المتزامن للخلايا المقيمة في المبيض إجراء تحليل عالي الدقة للمراحل المبكرة من تطور الجريب الغاري. نوضح بروتوكولات لعزل أنواع الخلايا المنفصلة عن طريق معالجة الجريبات الغارية إنزيميا وفصل الخلايا الحبيبية والثيكا والبطانية والمكونة للدم واللحمية. يتيح عزل الخلايا عن الجريبات الغارية بأحجام ومراحل نمو مختلفة التحليل الشامل للآليات الخلوية والجزيئية التي تدفع نمو البصيلات وفسيولوجيا المبيض ويوفر مصدرا للخلايا القابلة للحياة التي يمكن زراعتها في المختبر لتلخيص البيئة المكروية للجريب.

قمنا بعزل البصيلات من سطح المبيض ومعالجتها إنزيميا لعزل GCs وكذلك خلايا theca و stroma المحيطة بالتجويف الغاري. تم جمع الخلايا ، وتم فرز كسور الخلايا من البصيلات الغارية (بأقطار تتراوح بين 0.5 مم و 4 مم) بواسطة FACS إلى نقاء >95٪ (الشكل 1).
لتسمية وتنقية الكسور الخلوية الفر...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

هنا ، نقدم بروتوكولات لتحديد وتنقية خلايا المبيض من بصيلات الغار. نوضح طرق معالجة المبايض الكاملة للحفظ بالتبريد للشرائط القشرية مع حصاد البصيلات الغارية السليمة التي يتم معالجتها إنزيميا لتحرير أنواع متعددة من الخلايا المقيمة في البصيلات ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، والثيكا ، والبطانة ، المكونة للدم ، والخلايا اللحمية.

استخراج وتوسيم وتنقية الخلايا الخاصة بالنسب من الجريبات الغارية البشرية

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

يتيح البروتوكول الموضح هنا وضع العلامات وعزل سلالات خلايا معينة موجودة في بصيلات المبيض بدءا من المراحل الغارية المبكرة ، مما يتيح التحليل عالي الدقة والثقافة. يستخدم هذا النهج الدقيق للغاية مجموعات من الأجسام المضادة المترافقة الفلورية لاستهداف علامات سطح الخلية التي يتم التعبير عنها بقوة وعلى وجه التحديد بين سلالات الحبيبية المنفصلة والسدى والثيكا. ابدأ بوضع المبيض في طبق بتري معقم ، واسكب وسطا مبردا معه لترطيب الأنسجة ، مع التأكد من أن المبيض نصف مغمور في الوسط.إزالة أي خيوط أو مواد أخرى، وتشريح الأنسجة المحيطة المتبقية بعيدا عن المبيض. لعزل البصيلات الغارية ، حدد البصيلات الفردية واختر بصيلات صحية. استبعد أي بصيلات مملوءة بالدم أو داكنة أو غير متماثلة.عزل الجريبات الغارية المختارة من المبيض باستخدام المشارط ، والحفاظ على الغار سليما واستئصال الأنسجة القشرية التي تشمل المسام. ضع كل جريب غاري سليم تم استئصاله في بئر واحد من صفيحة الآبار الستة. باستخدام مسطرة موضوعة أسفل الطبق ، حدد قطر الجريب لأغراض وصفية.باستخدام مشرط ، قم بتقسيم الجريب الغاري السليم لتقييم التجويف الغاري وإضافة ستة ملليلتر من وسط انفصال الخلايا الأنزيمية قبل احتضان اللوحة في حاضنة مرطبة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، أضف ستة ملليلتر من الوسط المتاح الذي يحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني ، أو FBS ، واغسله بالوسط عن طريق السحب القوي المتكرر فوق البصيلات المنقسمة باستخدام ماصة P-1000 الدقيقة. بعد ذلك ، اجمع الوسيط وقم بتمريره عبر مرشح 100 ملم.بعد الطرد المركزي للطافي المصفى عند 300 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق قبل ذلك ، قم باستنشاق المادة الطافية. ضع الأنسجة المتبقية في خليط من 100 وحدة لكل ملليلتر كولاجيناز ووحدة واحدة لكل ملليلتر ديباز مخفف في محلول ملحي متوازن قبل 30 دقيقة من الحضانة. تعطيل الأنسجة ميكانيكيا عن طريق الثقب والسحب القوي مرتين بعد 10 و 20 دقيقة.بمجرد الانتهاء من ذلك ، استرجع الأنسجة واغسلها عن طريق السحب ، من خلال طرف ماصة P-1000 ، وقم بتصفيتها من خلال مرشح 100 ملليلتر. قم بطرد الأنسجة المتوترة عند 300 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق قبل وضع حبيبات الخلية المخصبة بخلايا الثيكا وخلايا السدى على الجليد لوضع العلامات و FACS. لتحديد الخلايا الحبيبية وخلايا الثيكا ، أعد تعليق كريات الخلايا في محلول مانع يحتوي على أجسام مضادة مقترنة مباشرة واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.بعد غسل الخلايا وطردها مركزيا ، أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 4-6 دياميدينو -2 فينيليندول ، أو DAPI ، وقم بتشغيل تعليق الخلية من خلال أداة FACS لالتقاط عدد صغير من الخلايا ، باستخدام كثافة الفلورسنت للأجسام المضادة المترافقة الفلوروفور للبوابة. يقسم ما تبقى من المبيض. استئصال النخاع باستخدام مقص ناعم منحني ومشارط ، وتجنب تلف قشرة المبيض.استمر في معالجة وترقق قشرة المبيض عن طريق الكشط اللطيف حتى يبقى الحد الأدنى من النخاع. قسم الأنسجة القشرية إلى شرائط بعرض ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات على طول المبيض. لتجميد أنسجة المبيض ، ضع شريطا قشريا واحدا في كل قارورة مبردة مبردة تحتوي على محلول التجميد.هز القوارير المبردة التي تحتوي على الشرائط القشرية على لوحة دوارة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نواة تشكيل بلورات الجليد عن طريق لمس كل قارورة تبريد بطرف قطني مغمور لفترة وجيزة في النيتروجين السائل. تم جمع خلايا المبيض وفرز كسور الخلايا من الجريبات الغارية FACS إلى أكثر من 95٪ نقاء.تم تصنيف خلايا CD99 الحبيبية المسماة على وجه التحديد في PVRL1 ، أو النيكتين ، بشكل متزايد في حجرة خلايا البويضة الحبيبية مع زيادة حجم الجريبات الغريبة. وقد لوحظ أن الأجسام المضادة ضد endoglin أو CD55 حددت على وجه التحديد جميع خلايا السدى والثيكا وأن ألانين أمينوببتيداز تم التعبير عنه على وجه التحديد بواسطة خلايا الثيكا الأندروجينية. تم تمييز الخلايا بجسم مضاد موجه ضد CD99 لتحديد الخلايا الحبيبية وتم استخدام الأجسام المضادة ضد CD45 لاستبعاد الخلايا المكونة للدم.فصلت الأجسام المضادة ضد PVRL1 عدد الخلايا الحبيبية إلى مقصورات البويضة والجدارية. بعد الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز ديسباز ، مكنت مستحضرات الخلايا الموسومة بالأجسام المضادة ضد CD55 و CD34 وألانين أمينوببتيداز من التقاط جميع خلايا السدى أو الثيكا أو خلايا الثيكا الأندروجينية مع استبعاد الخلايا البطانية من مجموعات خلايا ثيكا. توخ الحذر بشكل خاص لتجنب تعطيل غار البصيلات أثناء عزل الجريب الأولي عن طريق القطع داخل هامش آمن حول حدود الجريب.في نهاية هذا الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا للتحليل الجزيئي أو التشخيصي أو بدلا من ذلك يتم استزراعها في المختبر لدراسات السموم أو التحليل التجريبي أو تلخيص البيئة المكروية للجريب. حتى الآن ، تم استخدام هذه الطرق لنمذجة اضطرابات الغدد الصماء التي تنطوي على المبيض وتحديد مجموعات فرعية جديدة من الخلايا المرتبطة بالجريب.

Research

JoVE Journal

Biology

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

ES خلايا الإنسان : ثقافة ابتداء من خلايا مجمدة

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

وصفها في المختبر من خلايا المنشأ الجنينية البشرية لتصوير بالرنين المغناطيسي

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

استخراج وتحليل الكورتيزول من الإنسان والقرد الشعر

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

والتصور والتقدير الكمي للخلايا الوسيطة أديبوجينيك التمايز المحتملة مع علامة نسب المحددة

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

جمع الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي من مفصل الركبة هشاشة العظام البشرية

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...