Name: extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles
Uploaded: 2022-11-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

De auteurs erkennen de steun van de Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) en de Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G wordt ondersteund door de NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine postdoctorale opleidingsbeurs.

Alle procedures met muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bij Weill Cornell Medicine. Alle xenotransplantatie-experimenten met eierstokweefsel werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Beide eierstokken werden geïsoleerd van een 14-jarige hersendode orgaandonor zonder voorgeschiedenis van radio/chemotherapie en geen gedocumenteerde voorgeschiedenis van endocriene of reproductieve aandoeningen. De institutionele beoordelingscommissi...

<ol>
	<li>Aghadavod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+granulosa+cells+from+follicular+fluid;+Applications+in+biomedical+and+molecular+biology+experiments.">Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments.</a> Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+antral+follicles+of+xenograft+versus+ovarian+origin+reveals+disparate+molecular+signatures.">Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures.</a> Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).</li><li>Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+primordial+follicles+following+prolonged+transportation+of+ovarian+tissue+prior+to+cryopreservation.">Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation.</a> Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).</li><li>Jensen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+transplantations+of+cryopreserved+ovarian+tissue+to+41+women+in+Denmark.">Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark.</a> Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).</li><li>Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+storage+and+grafting+of+human+ovarian+tissue.">Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.</a> Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+superphysiologic+AMH+promotes+premature+luteinization+of+antral+follicles+in+human+ovarian+xenografts.">Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts.</a> Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicular+theca+cell+recruitment,+differentiation,+and+impact+on+fertility:+2017+update.">Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update.</a> Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).</li><li>Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+theca+cells+from+ovarian+cells+isolated+from+postmenopausal+women.">In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women.</a> Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).</li><li>Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+human+theca+stem+cells+and+their+differentiation+into+theca+progenitor+cells.">Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).</li></ol>

Een betere resolutie van de cellulaire diversiteit in de ovariële follikels is om verschillende redenen klinisch belangrijk. Bij het toepassen van het bovenstaande protocol op de isolatie van de unieke fenotypische subtypen die zich in de follikels van het antrale stadium bevinden, moeten verschillende factoren worden overwogen. Ten eerste is de gezondheid en levensvatbaarheid van het eierstokweefsel waaruit de antrale follikel is afgeleid van cruciaal belang bij het bepalen van de kwaliteit van de cellen en het succes ...

De primaire functionele elementen van de menselijke eierstok zijn de follikels, die de groei en ontwikkeling van eicellen regelen. Protocollen voor de isolatie van folliculaire cellen zijn goed vastgesteld in de context van in-vitrofertilisatie , maar deze zijn alleen geschikt voor het verzamelen van cellen uit geluteïniseerde follikels op het punt van het ophalen van eicellen1. We hebben een protocol ontwikkeld dat de isolatie van discrete celpopulaties mogelijk maakt van antrale follikels in verschillende ontwikkelingsstadia die voortkomen uit inheemse eierstokken of xenogetransplanteerd eierstokweefsel2. Hoewel er consensus is dat de bijdragen van follikel-residente cellen aan de teelt van de eicel zeer belangrijk zijn, hebben weinig studies prospectief de unieke fenotypische subtypen geïdentificeerd en geëxtraheerd die aanwezig zijn in de follikels in het antrale stadium. Een dieper begrip van de differentiatiehiërarchie en signaaltransductie tussen gespecialiseerde cellen tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia zou ons begrip van ovariële fysiologie onder homeostatische en pathologische omstandigheden kunnen verbreden. Bovendien kan de discriminatie van discrete cellulaire subtypen en hun moleculaire bijdragen aan follikelgroei / rijping een middel zijn om ex vivo surrogaten te genereren die de ovariële functie reconstrueren om de rijping van eicellen te bevorderen en / of endocriene disfunctie te behandelen. 
Elk uniek celtype in de eierstok draagt bij aan de complexe functie van de follikel, die effectief functioneert als een discreet mini-orgaan om de groei en rijping van de eicel die het bevat te bevorderen. De eicel, het middelpunt van de follikel, wordt direct omhuld door een continue laag granulosacellen (GC's), waarbij de thecacellen (TC's) een secundaire laag cellen vormen die samen met de eicel en GC's de folliculaire eenheid vormen. Hoewel ingedeeld in twee groepen, bevatten GC's en TC's tal van subtypen. GC's worden geclassificeerd op basis van hun positie binnen de follikel; GC's die de eicel omringen versus die welke grenzen aan het keldermembraan worden respectievelijk aangeduid als oophoreuze en muurschildering-GC's, en deze subtypen vertonen unieke transcriptomische handtekeningen. TC's hebben tal van subtypen die functioneren om steroïdegene, metabole en structurele ondersteuning te bieden. Endotheel-, perivasculaire en immuuncellen spelen een centrale rol bij het handhaven van een normale ovariële fysiologie. Het ovariële stroma dient niet alleen als een substraat voor follikelgroei, maar biedt waarschijnlijk ook een bron van voorlopers die aanleiding geven tot TC's. Dit meerlagige complex van cellulaire subtypen in de eierstok is wat zijn functie als zowel een endocriene als een voortplantingsorgaan mogelijk maakt.
Dit artikel presenteert een protocol voor de identificatie en zuivering van granulosa, theca, stromale, endotheel- en hematopoietische cellen uit antrale follikels. We hebben dit protocol gebruikt om deze eierstokcellen te isoleren en te analyseren met behulp van single-cell sequencing, gevolgd door specifieke kleuring in follikels van verschillende ontwikkelingsstadia. Het protocol biedt een eenvoudige methodologie die repliceerbaar is en de analyse met hoge resolutie van zowel de fysiologie als de pathologie van de eierstok mogelijk maakt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Anti-Anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mountant solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td>ProLong Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C 2674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D 2650</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cell Detachment Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat-inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td>no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S 1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 69.64 mL of Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 17.66 mL of fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 3.42 g of sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 10.65 mL of DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 1 mL of antibiotic-antimycotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Plasticware and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>CryoTube 1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430599</td>
			<td>60EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANPEP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB7227A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD55</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>311306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 99</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>371308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVRL</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long forceps (~150 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium forceps (~110 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 21 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>EF7281H</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 11 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>&#160;FH/CX7281A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp fine curved scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz Flourescence activated cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 META Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles

De activering, groei, ontwikkeling en rijping van eicellen is een complex proces dat niet alleen wordt gecoördineerd tussen meerdere celtypen van de eierstok, maar ook over meerdere controlepunten binnen het hypothalamus / hypofyse / ovariumcircuit. Binnen de eierstok groeien meerdere gespecialiseerde celtypen in nauwe associatie met de eicel in de ovariële follikels. De biologie van deze cellen is goed beschreven in de latere stadia, wanneer ze gemakkelijk worden hersteld als bijproducten van geassisteerde reproductieve behandelingen. De diepgaande analyse van kleine antrale follikels die rechtstreeks uit de eierstok zijn geïsoleerd, wordt echter niet vaak uitgevoerd vanwege de schaarste aan menselijk eierstokweefsel en de beperkte toegang tot de eierstok bij patiënten die geassisteerde reproductieve behandelingen ondergaan. 
Deze methoden voor het verwerken van hele eierstokken voor de cryopreservatie van corticale strips met de gelijktijdige identificatie / isolatie van eierstokcellen maken de analyse met hoge resolutie van de vroege stadia van antrale follikelontwikkeling mogelijk. We demonstreren protocollen voor het isoleren van discrete celtypen door antrale follikels enzymatisch te behandelen en de granulosa, theca, endotheel, hematopoietische en stromale cellen te scheiden. De isolatie van cellen uit de antrale follikels in verschillende groottes en ontwikkelingsstadia maakt de uitgebreide analyse mogelijk van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de follikelgroei en ovariële fysiologie stimuleren en biedt een bron van levensvatbare cellen die in vitro kunnen worden gekweekt om de follikelmicro-omgeving samen te vatten.

We isoleerden follikels van het oppervlak van de eierstok en behandelden ze enzymatisch om de GC's te isoleren, evenals theca- en stromacellen rond de antrale holte. De cellen werden verzameld en de celfracties werden gesorteerd van de antrale follikels (diameters variërend tussen 0,5 mm en 4 mm) door FACS tot >95% zuiverheid (figuur 1).
Om unieke cellulaire fracties in de menselijke antrale follikels te labelen en te zuiveren, combineerden we enzymatische spijsv...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Hier presenteren we protocollen voor de identificatie en zuivering van eierstokcellen uit antrale follikels. We werken uit over methoden voor het verwerken van hele eierstokken voor de cryopreservatie van corticale strips, terwijl we ook intacte antrale follikels oogsten die enzymatisch worden behandeld om meerdere follikel-residente celtypen vrij te maken, waaronder granulosa, theca, endotheel, hematopoietische en stromale cellen.

Extractie, etikettering en zuivering van afstammingsspecifieke cellen uit menselijke antrale follikels

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

Het hier gedemonstreerde protocol maakt het labelen en isoleren mogelijk van specifieke cellijnen die aanwezig zijn in ovariële follikels vanaf vroege antrale stadia, waardoor de analyse en cultuur met hoge resolutie mogelijk wordt. Deze zeer nauwkeurige benadering maakt gebruik van combinaties van fluorofoor geconjugeerde antilichamen om celoppervlakmarkers te targeten die robuust en specifiek tot expressie komen tussen discrete granulosa-, stroma- en theca-afstammingslijnen. Begin met het plaatsen van de eierstok in een steriele petrischaal en giet er een gekoeld medium bij om het weefsel te hydrateren, zodat de eierstok half ondergedompeld is in het medium.Verwijder eventuele hechtingen of ander materiaal en ontleed het resterende omliggende weefsel weg van de eierstok. Om de antrale follikels te isoleren, identificeert u individuele follikels en kiest u gezonde follikels. Sluit met bloed gevulde, donkere of niet-symmetrische follikels uit.Isoleer de gekozen antrale follikels uit de eierstok met behulp van scalpels, houd het antrum intact en exciseer het corticale weefsel dat de follikel omvat. Plaats elke weggesneden intacte antrale follikel in een put van de zes putplaat. Gebruik een liniaal die onder de schaal is geplaatst om de follikeldiameter te bepalen voor beschrijvende doeleinden.Gebruik een scalpel om de intacte antrale follikel te bisecteren om de antrale holte te beoordelen en voeg zes milliliter enzymatisch celloslatingsmedium toe voordat u de plaat gedurende 10 minuten in een bevochtigde incubator incubeert. Voeg na incubatie zes milliliter beschikbaar medium toe dat 20% foetaal runderserum of FBS bevat en spoel met het medium door herhaaldelijk krachtig pipetteren over de doorsneden follikels met een P-1000 micropipette. Verzamel vervolgens het medium en laat het door een filter van 100 millimeter lopen.Na het centrifugeren van het gefilterde supernatant op 300 G en vier graden Celsius gedurende drie minuten eerder, zuigt u het supernatant op. Plaats het resterende weefsel in een mengsel van 100 eenheden per milliliter collagenase en één eenheid per milliliter dispase verdund in een uitgebalanceerde zoutoplossing vóór 30 minuten incubatie. het weefsel mechanisch verstoren door twee keer na 10 en 20 minuten tritureren en krachtig pipetteren.Als u klaar bent, herstelt u het weefsel en spoelt u door pipetteren, door een P-1000 micropipette-tip en zeeft u door een filter van 100 milliliter. Centrifugeer het gespannen weefsel op 300 G en vier graden Celsius gedurende drie minuten voordat u de celpellet verrijkt met de thecacellen en stromacellen op ijs zet voor etikettering en FACS. Om granulosacellen en thecacellen te identificeren, resuspendeert u de celpellets in een blokkerende oplossing met direct geconjugeerde antilichamen en incubeert u gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Na het wassen en centrifugeren van de cellen, resuspensie de cellen in FACS-buffer met 4-6 diamidino-2-fenylindool, of DAPI, en voer de celsuspensie door een FACS-instrument om een kleine populatie van de cellen te vangen, met behulp van de fluorescerende intensiteit van fluorofoor geconjugeerde antilichamen voor gating. Bisect de rest van de eierstok. Snijd de medulla weg met een gebogen fijne schaar en scalpels en vermijd schade aan de ovariële cortex.Ga door met het verwerken en dunner worden van de ovariële cortex door zachtjes te schrapen totdat er minimale medulla overblijft. Verdeel het corticale weefsel in twee tot drie millimeter brede stroken langs de eierstoklengte. Voor het bevriezen van eierstokweefsel plaatst u één corticale strip in elke gekoelde cryogene injectieflacon met de vriesoplossing.Schud de cryogene injectieflacons met de corticale strips op een roterende plaat gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Nucleate ijskristalvorming door elke cryoflacon aan te raken met een katoenen tip kort ondergedompeld in vloeibare stikstof. De eierstokcellen werden verzameld en de celfracties werden gesorteerd van de antrale follikels FACS tot meer dan 95% zuiverheid.CD99 specifiek gelabelde granulosacellen in PVRL1, of nectine, werd steeds meer gelokaliseerd in het oophorus granulosa-celcompartiment naarmate de antrale follikels in omvang toenamen. Er werd gezien dat de antilichamen tegen endoglin of CD55 specifiek alle stroma- en thecacellen afbakenden en dat alanineaminopeptidase specifiek tot expressie werd gebracht door androgene thecacellen. De cellen werden gelabeld met een antilichaam gericht tegen CD99 om granulosacellen te identificeren en antilichamen tegen CD45 werden gebruikt om hematopoëtische cellen uit te sluiten.Antilichamen tegen PVRL1 scheidden de granulosacelpopulatie in oophorus- en muurschilderingscompartimenten. Na enzymatische vertering met collagenase dispase, maakten de celpreparaten gelabeld met antilichamen tegen CD55, CD34 en alanine aminopeptidase de vangst van alle stroma- of thecacellen of androgene thecacellen mogelijk met uitsluiting van endotheelcellen uit de populaties van de thecacellen. Let er vooral op dat u het antrum van follikels niet verstoort tijdens de eerste follikelisolatie door binnen een veilige marge rond de follikelranden te snijden.Stroomafwaarts van deze procedure kunnen de cellen worden gebruikt voor moleculaire of diagnostische analyse of als alternatief in vitro worden gekweekt voor toxicologische studies, experimentele analyse of recapitulatie van de follikelmicro-omgeving. Tot op heden werden deze methoden gebruikt om endocriene stoornissen waarbij de eierstok betrokken is te modelleren en om nieuwe subpopulaties van follikelgerelateerde cellen te identificeren.

Research

JoVE Journal

Biology

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Menselijke ES-cellen: Vanaf Cultuur van bevroren cellen

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

In vitro Labeling van menselijke embryonale stamcellen voor Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Zuivering van Mitochondriën uit gistcellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extractie en analyse van Cortisol van de mens en de Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Visualisatie en kwantificering van mesenchymale cel Adipogenic differentiatie mogelijkheden met een Lineage specifieke Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Weefselverzameling en RNA-extractie uit het menselijke artrosekniegewricht

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...