Name: extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles
Uploaded: 2022-11-30T13:40:00
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Die Autoren danken für die Unterstützung durch den Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) und den Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G wird durch das NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine Postdoctoral Training Grant unterstützt.

Alle Verfahren mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bei Weill Cornell Medicine genehmigt. Alle Xenotransplantationsexperimente mit Eierstockgewebe wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Beide Eierstöcke wurden von einer 14-jährigen hirntoten Organspenderin isoliert, die keine Radio-/Chemotherapie in der Vorgeschichte und keine dokumentierte Vorgeschichte von endokrinen oder reproduktiven Erkrankungen hatte. Das Komitee des Inst...

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	<li>Aghadavod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+granulosa+cells+from+follicular+fluid;+Applications+in+biomedical+and+molecular+biology+experiments.">Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments.</a> Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+antral+follicles+of+xenograft+versus+ovarian+origin+reveals+disparate+molecular+signatures.">Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures.</a> Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).</li><li>Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+primordial+follicles+following+prolonged+transportation+of+ovarian+tissue+prior+to+cryopreservation.">Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation.</a> Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).</li><li>Jensen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+transplantations+of+cryopreserved+ovarian+tissue+to+41+women+in+Denmark.">Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark.</a> Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).</li><li>Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+storage+and+grafting+of+human+ovarian+tissue.">Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.</a> Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+superphysiologic+AMH+promotes+premature+luteinization+of+antral+follicles+in+human+ovarian+xenografts.">Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts.</a> Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicular+theca+cell+recruitment,+differentiation,+and+impact+on+fertility:+2017+update.">Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update.</a> Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).</li><li>Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+theca+cells+from+ovarian+cells+isolated+from+postmenopausal+women.">In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women.</a> Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).</li><li>Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+human+theca+stem+cells+and+their+differentiation+into+theca+progenitor+cells.">Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).</li></ol>

Eine bessere Auflösung der zellulären Vielfalt innerhalb der Eierstockfollikel ist aus mehreren Gründen klinisch wichtig. Bei der Anwendung des obigen Protokolls auf die Isolierung der einzigartigen phänotypischen Subtypen, die sich in den Follikeln des Antralstadiums befinden, sollten mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Erstens ist die Gesundheit und Lebensfähigkeit des Eierstockgewebes, aus dem der Antralfollikel gewonnen wird, entscheidend für die Qualität der Zellen und den Erfolg nachgelagerter Anwendung...

Die wichtigsten funktionellen Elemente des menschlichen Eierstocks sind die Follikel, die das Wachstum und die Entwicklung der Eizellen steuern. Protokolle für die Isolierung von Follikelzellen sind im Zusammenhang mit der In-vitro-Fertilisation gut etabliert, aber diese sind nur für die Entnahme von Zellen aus luteinisierten Follikeln zum Zeitpunkt der Eizellentnahme geeignet1. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das die Isolierung diskreter Zellpopulationen aus Antralfollikeln in verschiedenen Entwicklungsstadien ermöglicht, die aus nativen Eierstöcken oder xenotransplantiertem Ovarialgewebe entstehen2. Obwohl Konsens darüber besteht, dass der Beitrag follikelresidenter Zellen zur Kultivierung der Eizelle von großer Bedeutung ist, haben nur wenige Studien prospektiv die einzigartigen phänotypischen Subtypen identifiziert und extrahiert, die in Follikeln im Antralstadium vorhanden sind. Ein tieferes Verständnis der Differenzierungshierarchie und der Signaltransduktion zwischen spezialisierten Zellen während der verschiedenen Entwicklungsstadien könnte unser Verständnis der Physiologie der Eierstöcke unter homöostatischen und pathologischen Bedingungen erweitern. Darüber hinaus kann die Unterscheidung diskreter zellulärer Subtypen und ihrer molekularen Beiträge zum Follikelwachstum/zur Follikelreifung eine Möglichkeit bieten, ex vivo Surrogate zu erzeugen, die die Ovarialfunktion rekonstruieren, um die Eizellreifung zu fördern und/oder endokrine Dysfunktionen zu behandeln. 
Jeder einzelne Zelltyp innerhalb des Eierstocks trägt zur komplexen Funktion des Follikels bei, der effektiv als eigenständiges Miniorgan fungiert, um das Wachstum und die Reifung der darin enthaltenen Eizelle zu fördern. Die Eizelle, das Herzstück des Follikels, ist direkt von einer kontinuierlichen Schicht von Granulosazellen (GCs) umgeben, wobei die Thekazellen (TCs) eine sekundäre Zellschicht bilden, die sich mit der Eizelle und den GCs verbinden, um die follikuläre Einheit zu bilden. Obwohl sie in zwei Gruppen eingeteilt werden, enthalten GCs und TCs zahlreiche Subtypen. GCs werden nach ihrer Position innerhalb des Follikels klassifiziert. GCs, die die Eizelle umgeben, im Gegensatz zu denen, die an die Basalmembran angrenzen, werden als oophore bzw. murale GCs bezeichnet, und diese Subtypen weisen einzigartige transkriptomische Signaturen auf. TCs haben zahlreiche Subtypen, die steroidogene, metabolische und strukturelle Unterstützung bieten. Endothel-, Perivaskulär- und Immunzellen spielen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung einer normalen Physiologie der Eierstöcke. Das Ovarialstroma dient nicht nur als Substrat für das Follikelwachstum, sondern stellt wahrscheinlich auch eine Quelle für Vorläuferzellen dar, aus denen TCs entstehen. Dieser vielschichtige Komplex von zellulären Subtypen im Eierstock ermöglicht seine Funktion sowohl als endokrines als auch als Fortpflanzungsorgan.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Identifizierung und Reinigung von Granulosa-, Theka-, Stroma-, Endothel- und hämatopoetischen Zellen aus Antralfollikeln vorgestellt. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um diese Eierstockzellen zu isolieren und sie mittels Einzelzellsequenzierung zu analysieren, gefolgt von einer spezifischen Färbung in Follikeln verschiedener Entwicklungsstadien. Das Protokoll bietet eine unkomplizierte Methodik, die replizierbar ist und die hochauflösende Analyse sowohl der Physiologie als auch der Pathologie des Eierstocks ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Anti-Anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mountant solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td>ProLong Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C 2674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D 2650</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cell Detachment Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat-inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td>no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S 1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 69.64 mL of Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 17.66 mL of fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 3.42 g of sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 10.65 mL of DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 1 mL of antibiotic-antimycotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Plasticware and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>CryoTube 1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430599</td>
			<td>60EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANPEP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB7227A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD55</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>311306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 99</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>371308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVRL</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long forceps (~150 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium forceps (~110 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 21 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>EF7281H</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 11 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>&#160;FH/CX7281A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp fine curved scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz Flourescence activated cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 META Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles

Die Aktivierung, das Wachstum, die Entwicklung und die Reifung von Eizellen ist ein komplexer Prozess, der nicht nur zwischen mehreren Zelltypen des Eierstocks, sondern auch über mehrere Kontrollpunkte innerhalb des Hypothalamus-/Hypophysen-/Eierstockkreislaufs koordiniert wird. Innerhalb des Eierstocks wachsen mehrere spezialisierte Zelltypen in enger Verbindung mit der Eizelle innerhalb der Eierstockfollikel. Die Biologie dieser Zellen ist in den späteren Stadien gut beschrieben, wenn sie leicht als Nebenprodukte von assistierten Reproduktionsbehandlungen wiederhergestellt werden können. Die eingehende Analyse kleiner Antralfollikel, die direkt aus dem Eierstock isoliert wurden, wird jedoch aufgrund des Mangels an menschlichem Eierstockgewebe und des eingeschränkten Zugangs zum Eierstock bei Patientinnen, die sich einer assistierten Reproduktionsbehandlung unterziehen, in der Regel nicht durchgeführt. 
Diese Methoden zur Aufbereitung ganzer Eierstöcke für die Kryokonservierung kortikaler Streifen bei gleichzeitiger Identifizierung/Isolierung von Ovarialzellen ermöglichen die hochauflösende Analyse der frühen Stadien der Antralfollikelentwicklung. Wir demonstrieren Protokolle zur Isolierung diskreter Zelltypen durch enzymatische Behandlung von Antralfollikeln und Trennung der Granulosa-, Theka-, Endothel-, hämatopoetischen und Stromazellen. Die Isolierung von Zellen aus den Antralfollikeln in verschiedenen Größen und Entwicklungsstadien ermöglicht die umfassende Analyse der zellulären und molekularen Mechanismen, die das Follikelwachstum und die Physiologie der Eierstöcke antreiben, und bietet eine Quelle lebensfähiger Zellen, die in vitro kultiviert werden können, um die Mikroumgebung der Follikel zu rekapitulieren.

Wir isolierten Follikel von der Oberfläche des Eierstocks und behandelten sie enzymatisch, um die GCs sowie die Theka- und Stromazellen, die die Antralhöhle umgeben, zu isolieren. Die Zellen wurden entnommen und die Zellfraktionen aus den Antralfollikeln (Durchmesser zwischen 0,5 mm und 4 mm) mittels FACS auf eine Reinheit von >95 % sortiert (Abbildung 1).
Um einzigartige Zellfraktionen in den humanen Antralfollikeln zu markieren und zu reinigen, kombinierten wi...

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Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Hier stellen wir Protokolle für die Identifizierung und Reinigung von Ovarialzellen aus Antralfollikeln vor. Wir erarbeiten Methoden zur Verarbeitung ganzer Eierstöcke für die Kryokonservierung von kortikalen Streifen bei gleichzeitiger Entnahme intakter Antralfollikel, die enzymatisch behandelt werden, um mehrere follikelresidente Zelltypen freizusetzen, darunter Granulosa-, Theka-, Endothel-, hämatopoetische und Stromazellen.

Extraktion, Markierung und Reinigung von linienspezifischen Zellen aus humanen Antralfollikeln

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

Das hier demonstrierte Protokoll ermöglicht die Markierung und Isolierung spezifischer Zelllinien, die in Ovarialfollikeln vorhanden sind, beginnend in frühen Antralstadien, wodurch die hochauflösende Analyse und Kultur ermöglicht wird. Dieser hochpräzise Ansatz nutzt Kombinationen von Fluorophor-konjugierten Antikörpern, um Zelloberflächenmarker zu erreichen, die robust und spezifisch in diskreten Granulosa-, Stroma- und Theka-Linien exprimiert werden. Legen Sie zunächst den Eierstock in eine sterile Petrischale und gießen Sie ein gekühltes Medium dazu, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen, wobei Sie sicherstellen, dass der Eierstock halb in das Medium eingetaucht ist.Entfernen Sie alle Nähte oder anderes Material und präparieren Sie das restliche umgebende Gewebe vom Eierstock weg. Um die Antralfollikel zu isolieren, identifizieren Sie einzelne Follikel und wählen Sie gesunde Follikel aus. Schließen Sie blutgefüllte, dunkle oder unsymmetrische Follikel aus.Isolieren Sie die ausgewählten Antralfollikel mit Skalpellen aus dem Eierstock, wobei das Antrum intakt bleibt und das kortikale Gewebe, das den Follikel umfasst, herausgeschnitten wird. Platzieren Sie jeden herausgeschnittenen intakten Antralfollikel in einer Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Bestimmen Sie mit einem Lineal, das unter der Schale platziert wird, den Follikeldurchmesser zu beschreibenden Zwecken.Halbieren Sie mit einem Skalpell den intakten Antralfollikel, um die Antralhöhle zu beurteilen, und fügen Sie sechs Milliliter enzymatisches Zellablösungsmedium hinzu, bevor Sie die Platte 10 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator inkubieren. Nach der Inkubation werden sechs Milliliter des verfügbaren Mediums mit 20 % fötalem Kälberserum (FBS) hinzugefügt und durch wiederholtes kräftiges Pipettieren über die halbierten Follikel mit einer P-1000-Mikropipette mit dem Medium gespült. Als nächstes wird das Medium aufgefangen und durch einen 100-Millimeter-Filter geleitet.Nachdem Sie den filtrierten Überstand drei Minuten lang bei 300 G und vier Grad Celsius zentrifugiert haben, saugen Sie den Überstand ab. Geben Sie das verbleibende Gewebe vor 30 Minuten Inkubationszeit in eine Mischung aus 100 Einheiten pro Milliliter Kollagenase und einer Einheit pro Milliliter, die in einer ausgewogenen Kochsalzlösung verdünnt wird. Mechanisches Aufbrechen des Gewebes durch Verreiben und kräftiges Pipettieren zweimal nach 10 und 20 Minuten.Wenn Sie fertig sind, gewinnen Sie das Gewebe und spülen Sie es durch Pipettieren, durch eine P-1000-Mikropipettenspitze und seihen Sie es durch einen 100-Milliliter-Filter. Zentrifugieren Sie das belastete Gewebe bei 300 G und vier Grad Celsius für drei Minuten, bevor Sie das mit den Thekazellen und Stromazellen angereicherte Zellpellet zur Markierung und FACS auf Eis legen. Um Granulosazellen und Thekazellen zu identifizieren, resuspendieren Sie die Zellpellets in einer Blockierungslösung mit direkt konjugierten Antikörpern und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius.Nach dem Waschen und Zentrifugieren der Zellen resuspendieren Sie die Zellen in FACS-Puffer, der 4-6 Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält, und lassen Sie die Zellsuspension durch ein FACS-Instrument laufen, um eine kleine Population der Zellen zu erfassen, wobei die Fluoreszenzintensität von Fluorophor-konjugierten Antikörpern für das Gating verwendet wird. Den Rest des Eierstocks halbieren. Entfernen Sie das Mark mit einer gebogenen feinen Schere und einem Skalpell, um eine Schädigung der Eierstockrinde zu vermeiden.Setzen Sie die Verarbeitung und Ausdünnung der Eierstockrinde durch sanftes Schaben fort, bis ein minimales Mark übrig bleibt. Teilen Sie das kortikale Gewebe in zwei bis drei Millimeter breite Streifen entlang der Eierstocklänge. Zum Einfrieren von Eierstockgewebe legen Sie einen kortikalen Streifen in jede gekühlte kryogene Durchstechflasche, die die Gefrierlösung enthält.Schütteln Sie die kryogenen Fläschchen mit den kortikalen Streifen auf einer rotierenden Platte 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Initiieren Sie die Bildung von Eiskristallen, indem Sie jedes Kryofläschchen mit einer Wattestäbchen berühren, die kurz in flüssigen Stickstoff getaucht ist. Die Ovarialzellen wurden entnommen und die Zellfraktionen aus den Antralfollikeln FACS auf einen Reinheitsgrad von mehr als 95% sortiert.CD99-spezifisch markierte Granulosazellen in PVRL1 oder Nektin wurden mit zunehmender Größe der Antralfollikel zunehmend im Zellkompartiment von Oophorus granulosa lokalisiert. Es zeigte sich, dass die Antikörper gegen Endoglin oder CD55 spezifisch alle Stroma- und Thekazellen abgrenzten und dass Alaninaminopeptidase spezifisch von androgenen Thekazellen exprimiert wurde. Die Zellen wurden mit einem Antikörper gegen CD99 markiert, um Granulosazellen zu identifizieren, und Antikörper gegen CD45 wurden verwendet, um hämatopoetische Zellen auszuschließen.Antikörper gegen PVRL1 trennten die Granulosazellpopulation in Oophorus- und Wandkompartimente. Nach enzymatischer Verdauung mit Kollagenase-Dispase ermöglichten die mit Antikörpern gegen CD55, CD34 und Alanin-Aminopeptidase markierten Zellpräparate die Erfassung aller Stroma- oder Thekazellen oder androgenen Thekazellen unter Ausschluss der Endothelzellen aus den Populationen der Thekazellen. Achten Sie besonders darauf, dass das Antrum der Follikel während der anfänglichen Follikelisolierung nicht unterbrochen wird, indem Sie innerhalb eines sicheren Randes um die Follikelränder schneiden.Nach diesem Verfahren können die Zellen für molekulare oder diagnostische Analysen verwendet oder alternativ in vitro für toxikologische Studien, experimentelle Analysen oder die Rekapitulation der Follikelmikroumgebung kultiviert werden. Bisher wurden diese Methoden verwendet, um endokrine Erkrankungen des Eierstocks zu modellieren und neue Subpopulationen follikelassoziierter Zellen zu identifizieren.

Research

JoVE Journal

Biology

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Humane ES-Zellen: Starting Kultur aus eingefrorenen Zellen

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Forschung

Biologie

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

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Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extraktion und Analyse von Cortisol aus Menschen-und Affen-Haar

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Visualisierung und Quantifizierung von mesenchymalen Zellen adipogenen Differenzierung Potenzial mit einer Linie spezifische Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

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Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Gewebeentnahme und RNA-Extraktion aus dem humanen osteoarthritischen Kniegelenk

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...