Name: extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles
Uploaded: 2022-11-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

המחברים מודים על תמיכתם של Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) ופרס Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M). N.L.G נתמכת על ידי מענק ההשתלמות לפוסט-דוקטורט של NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.

כל ההליכים המערבים עכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית החולים וייל קורנל. כל ניסויי השתלת הקסנו באמצעות רקמת שחלה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. שתי השחלות בודדו מתורם איברים בן 14 שמת מוות מוחי, ללא היסטוריה של רדיו/כימותרפיה וללא היסטוריה מתועד?...

<ol>
	<li>Aghadavod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+granulosa+cells+from+follicular+fluid;+Applications+in+biomedical+and+molecular+biology+experiments.">Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments.</a> Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+antral+follicles+of+xenograft+versus+ovarian+origin+reveals+disparate+molecular+signatures.">Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures.</a> Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).</li><li>Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+primordial+follicles+following+prolonged+transportation+of+ovarian+tissue+prior+to+cryopreservation.">Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation.</a> Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).</li><li>Jensen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+transplantations+of+cryopreserved+ovarian+tissue+to+41+women+in+Denmark.">Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark.</a> Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).</li><li>Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+storage+and+grafting+of+human+ovarian+tissue.">Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.</a> Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+superphysiologic+AMH+promotes+premature+luteinization+of+antral+follicles+in+human+ovarian+xenografts.">Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts.</a> Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicular+theca+cell+recruitment,+differentiation,+and+impact+on+fertility:+2017+update.">Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update.</a> Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).</li><li>Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+theca+cells+from+ovarian+cells+isolated+from+postmenopausal+women.">In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women.</a> Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).</li><li>Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+human+theca+stem+cells+and+their+differentiation+into+theca+progenitor+cells.">Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).</li></ol>

פתרון טוב יותר של המגוון התאי בתוך זקיקי השחלות חשוב מבחינה קלינית מכמה סיבות. ביישום הפרוטוקול הנ"ל על בידוד תת-הסוגים הפנוטיפיים הייחודיים השוכנים בתוך זקיקי השלב האנטראלי יש לקחת בחשבון מספר גורמים. ראשית, בריאותה וכדאיותה של רקמת השחלה שממנה נגזר הזקיק האנטרלי היא קריטית לקביעת איכות...

המרכיבים הפונקציונליים העיקריים של השחלה האנושית הם הזקיקים, השולטים בצמיחה ופיתוח של ביציות. פרוטוקולים לבידוד תאים פוליקולריים נקבעו היטב בהקשר של הפריה חוץ גופית , אך אלה מתאימים רק לאיסוף תאים מזקיקים לוטאין בנקודת שאיבת הביציות1. פיתחנו פרוטוקול המאפשר בידוד אוכלוסיות תאים בדידות מזקיקים אנטראליים בשלבי התפתחות שונים הנובעים משחלות טבעיות או מרקמת שחלה מושתלת2. למרות שקיים קונצנזוס כי תרומתם של תאים שושבי זקיקים לטיפוח הביצית חשובה ביותר, מחקרים מעטים זיהו וחילצו באופן פרוספקטיבי את תת-הסוגים הפנוטיפיים הייחודיים הקיימים בזקיקים בשלב האנטראלי. הבנה מעמיקה יותר של היררכיית ההתמיינות והעברת האותות בין תאים מתמחים בשלבי ההתפתחות השונים עשויה להרחיב את הבנתנו את הפיזיולוגיה של השחלות בתנאים הומיאוסטטיים ופתולוגיים. יתר על כן, ההבחנה בין תת-סוגים תאיים בדידים ותרומתם המולקולרית לגדילה/הבשלה של זקיקים עשויה לספק אמצעי ליצירת פונדקאיות ex vivo המשחזרות את תפקוד השחלות כדי לעודד הבשלת ביציות ו / או לטפל בתפקוד אנדוקריני. 
כל סוג תא ייחודי בתוך השחלה תורם לתפקוד המורכב של הזקיק, המתפקד למעשה כמיני-איבר נפרד לטיפוח הצמיחה וההבשלה של הביצית שהוא מכיל. הביצית, החלק המרכזי של הזקיק, עטופה ישירות בשכבה רציפה של תאי גרנולוזה (GCs), כאשר תאי התקה (TC) יוצרים שכבה משנית של תאים המשתלבים עם הביצית וה-GCs כדי להרכיב את היחידה הפוליקולרית. למרות שהם מסווגים לשתי קבוצות, GCs ו- TCs מכילים תת-סוגים רבים. GCs מסווגים לפי מיקומם בתוך הזקיק; GCs המקיפים את הביצית לעומת אלה הסמוכים לקרום המרתף מוגדרים כ- GCs oophorous ו- mural בהתאמה, ותתי סוגים אלה מציגים חתימות שעתוק ייחודיות. ל-TCs יש תת-סוגים רבים שתפקידם לספק תמיכה סטרואידוגנית, מטבולית ומבנית. תאי אנדותל, כלי דם ומערכת החיסון ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על פיזיולוגיה תקינה של השחלות. סטרומה השחלתית משמשת לא רק כמצע לצמיחת זקיקים, אלא גם ככל הנראה מספקת מקור לאבות המולידים TC. קומפלקס רב-שכבתי זה של תת-סוגים תאיים בתוך השחלה הוא המאפשר את תפקודה הן כאיבר אנדוקריני והן כאיבר רבייה.
מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי וטיהור של גרנולוסה, תיקה, סטרומה, אנדותל ותאים המטופויטיים מזקיקים אנטראליים. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבודד את תאי השחלות הללו ולנתח אותם באמצעות ריצוף של תא בודד, ולאחר מכן צביעה ספציפית בזקיקים בשלבי התפתחות שונים. הפרוטוקול מספק מתודולוגיה פשוטה הניתנת לשכפול ותאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה הן של הפיזיולוגיה והן של הפתולוגיה של השחלה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Anti-Anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mountant solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td>ProLong Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C 2674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D 2650</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cell Detachment Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat-inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td>no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S 1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 69.64 mL of Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 17.66 mL of fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 3.42 g of sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 10.65 mL of DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 1 mL of antibiotic-antimycotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Plasticware and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>CryoTube 1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430599</td>
			<td>60EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANPEP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB7227A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD55</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>311306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 99</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>371308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVRL</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long forceps (~150 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium forceps (~110 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 21 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>EF7281H</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 11 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>&#160;FH/CX7281A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp fine curved scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz Flourescence activated cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 META Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles

ההפעלה, הצמיחה, ההתפתחות וההבשלה של הביציות הוא תהליך מורכב המתואם לא רק בין סוגי תאים מרובים של השחלה, אלא גם על פני נקודות בקרה מרובות בתוך מעגל ההיפותלמוס/יותרת המוח/השחלות. בתוך השחלה, מספר סוגי תאים מיוחדים גדלים בקשר הדוק עם הביצית בתוך זקיקי השחלות. הביולוגיה של תאים אלה תוארה היטב בשלבים מאוחרים יותר, כאשר הם מתאוששים בקלות כתוצרי לוואי של טיפולי פוריות בסיוע. עם זאת, ניתוח מעמיק של זקיקים אנטראליים קטנים שבודדו ישירות מהשחלה אינו מתבצע בדרך כלל בשל המחסור ברקמת שחלה אנושית והגישה המוגבלת לשחלה בחולות העוברות טיפולי פוריות בסיוע. 
שיטות אלה לעיבוד שחלות שלמות להקפאה של רצועות קליפת המוח עם זיהוי/בידוד מקביל של תאים שוכנים בשחלות מאפשרות ניתוח ברזולוציה גבוהה של השלבים המוקדמים של התפתחות זקיק אנטראלי. אנו מדגימים פרוטוקולים לבידוד סוגי תאים בדידים על ידי טיפול בזקיקים אנטראליים באופן אנזימטי והפרדת תאי גרנולוסה, תקה, אנדותל, המטופויטים וסטרומה. בידוד התאים מהזקיקים האנטרליים בגדלים שונים ובשלבי התפתחות שונים מאפשר ניתוח מקיף של המנגנונים התאיים והמולקולריים המניעים את צמיחת הזקיקים ואת הפיזיולוגיה השחלתית ומספק מקור לתאים בני קיימא שניתן לגדל בתרבית במבחנה כדי לשחזר את מיקרו-סביבת הזקיק.

בודדנו זקיקים מפני השטח של השחלה וטיפלנו בהם באופן אנזימטי כדי לבודד את תאי GCs כמו גם תאי תקה וסטרומה המקיפים את החלל האנטרלי. התאים נאספו, ושברי התאים מוינו מהזקיקים האנטראליים (קטרים הנעים בין 0.5 מ"מ ל-4 מ"מ) לפי FACS לטוהר של >95% (איור 1).
כדי לתייג ולטהר שברים תאי?...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לזיהוי וטיהור תאי שחלה מזקיקים אנטראליים. אנו מרחיבים שיטות לעיבוד שחלות שלמות לשימור בהקפאה של רצועות קליפת המוח תוך קצירת זקיקים אנטראליים שלמים המטופלים באופן אנזימטי כדי לשחרר סוגים רבים של תאים שוכנים זקיקים, כולל גרנולוסה, תיקה, אנדותל, המטופויטים ותאי סטרומה.

חילוץ, תיוג וטיהור של תאים ספציפיים לשושלת מזקיקים אנטראליים אנושיים

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

הפרוטוקול שהודגם כאן מאפשר תיוג ובידוד של שושלות תאים ספציפיות הקיימות בזקיקי השחלות החל משלבים אנטראליים מוקדמים, ובכך מאפשר ניתוח ותרבית ברזולוציה גבוהה. גישה מדויקת זו משתמשת בשילובים של נוגדנים מצומדים פלואורופורים כדי להתמקד בסמנים של פני השטח של התא המתבטאים באופן חזק וספציפי בין שושלות גרנולוזה בדידות, סטרומה ותקה. התחל על ידי הנחת השחלה בצלחת פטרי סטרילי, ויוצקים מדיום צונן עם זה כדי לחות את הרקמה, להבטיח כי השחלה היא חצי שקוע בתווך.הסר את התפרים או חומר אחר, ונתח את שאריות הרקמה שמסביב הרחק מהשחלה. כדי לבודד את הזקיקים האנטרליים, זהה זקיקים בודדים ובחר זקיקים בריאים. אין לכלול זקיקים מלאי דם, כהים או לא סימטריים.בודד את הזקיקים האנטראליים שנבחרו מהשחלה באמצעות אזמלים, תוך שמירה על שלמות האנטרום וכריתת רקמת קליפת המוח המקיפה את הזקיק. מניחים כל זקיק אנטראלי שלם שנכרת בבאר אחת מתוך שש פלטות הבאר. באמצעות סרגל הממוקם מתחת לצלחת, לקבוע את קוטר הזקיק למטרות תיאוריות.באמצעות אזמל, לחתוך את הזקיק האנטלי שלם כדי להעריך את החלל האנטראלי ולהוסיף שישה מיליליטר של תווך ניתוק תאים אנזימטי לפני הדגירה על הצלחת באינקובטור לח במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, יש להוסיף שישה מיליליטר של מדיום זמין המכיל 20% נסיוב בקר עוברי, או FBS, ולשטוף עם המדיום על ידי פיפטינג נמרץ חוזר ונשנה על הזקיקים המפוצלים עם מיקרופיפטה P-1000. לאחר מכן, לאסוף את המדיום ולהעביר אותו דרך מסנן 100 מ"מ.לאחר צנטריפוגה של הסופרנאטנט המסונן ב-300 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות לפני, שאפו את הסופרנאטנט. מניחים את הרקמה הנותרת בתערובת של 100 יחידות למיליליטר קולגנאז ויחידה אחת למיליליטר דיספאס מדולל בתמיסת מלח מאוזנת לפני 30 דקות של דגירה. משבשים מכנית את הרקמה על ידי פיפטינג נמרץ ונמרץ פעמיים לאחר 10 ו -20 דקות.לאחר שתסיים, לשחזר את הרקמה ולשטוף באמצעות pipetting, דרך קצה micropipette P-1000, ומסננים דרך מסנן 100 מיליליטר. צנטריפוגה את הרקמה המתוחה ב 300 G וארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות לפני הנחת גלולת התא מועשר בתאי theca ותאי stroma על קרח עבור תיוג FACS. כדי לזהות תאי גרנולוזה ותאי תיקה, יש להשהות מחדש את כדורי התא בתמיסת חסימה המכילה נוגדנים מצומדים ישירות ולדגור בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר שטיפה וצנטריפוגה של התאים, יש להשהות מחדש את התאים במאגר FACS המכיל 4-6 דיאמידינו-2-פנילינדול, או DAPI, ולהריץ את תרחיף התא באמצעות מכשיר FACS כדי ללכוד אוכלוסייה קטנה של התאים, תוך שימוש בעוצמה הפלואורסצנטית של נוגדנים מצומדים פלואורופורים לגטינג. חותכים את שארית השחלה. הבלו את medulla באמצעות מספריים עדינים מעוקלים אזמלים, הימנעות נזק קליפת השחלות.המשך עיבוד ודילול קליפת המוח השחלתית על ידי גירוד עדין עד שתישאר מדולה מינימלית. מחלקים את רקמת קליפת המוח לרצועות ברוחב שניים עד שלושה מילימטרים לאורך השחלה. להקפאת רקמת השחלה, יש להניח רצועה אחת בקליפת המוח בכל בקבוקון קריוגני צונן המכיל את תמיסת ההקפאה.נערו את הבקבוקונים הקריוגניים המכילים את רצועות קליפת המוח על צלחת מסתובבת במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. יצירת גבישי קרח גרעיניים על ידי נגיעה בכל בקבוקון קריו עם קצה כותנה שקוע לזמן קצר בחנקן נוזלי. תאי השחלה נאספו ושברי התאים מוינו מזקיקי האנטראלים לטוהר של יותר מ-95%.CD99 שסומן באופן ספציפי כתאי גרנולוזה ב-PVRL1, או נטין, עבר יותר ויותר לוקליזציה לתא תאי הגרנולוזה של האופורוס ככל שהזקיקים האנטרליים גדלו. נראה כי נוגדנים נגד אנדוגלין או CD55 תיחם באופן ספציפי את כל תאי סטרומה ותקה וכי אלנין אמינופפטידאז התבטא באופן ספציפי על ידי תאי תקה אנדרוגניים. התאים סומנו בנוגדן המכוון נגד CD99 לזיהוי תאי גרנולוזה ונוגדנים נגד CD45 שימשו להרחקת תאים המטופויטיים.נוגדנים נגד PVRL1 הפרידו את אוכלוסיית תאי הגרנולוזה לתאי אופורוס וציורי קיר. לאחר עיכול אנזימטי עם collagenase dispase, תכשירי התאים המסומנים עם נוגדנים נגד CD55, CD34, ואלנין aminopeptidase אפשרה ללכוד את כל תאי סטרומה או theca או תאי theca אנדרוגניים עם הרחקת תאי אנדותל מאוכלוסיות תאי theca. יש להקפיד במיוחד להימנע משיבוש האנטרום של הזקיקים במהלך בידוד הזקיקים הראשוני על ידי חיתוך בשוליים בטוחים סביב גבולות הזקיק.במורד הזרם של הליך זה, התאים יכולים לשמש לניתוח מולקולרי או אבחוני או לחילופין בתרבית במבחנה למחקרי טוקסיקולוגיה, ניתוח ניסיוני, או שחזור של מיקרו-סביבה של זקיקים. עד כה, שיטות אלה שימשו כדי למדל הפרעות אנדוקריניות המערבות את השחלה ולזהות תת-אוכלוסיות חדשות של תאים הקשורים לזקיק.

Research

JoVE Journal

Biology

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

ES תאים אנושיים: תרבות החל מ תאים קפואים

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

הפקה וניתוח של קורטיזול מאדם וקוף השיער

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

ויזואליזציה, כימות פוטנציאל בידול Adipogenic תא Mesenchymal עם סמן ספציפי שושלת היוחסין

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...