Name: extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles
Uploaded: 2022-11-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

Gli autori riconoscono il sostegno del Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) e dell'Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G è supportato dalla borsa di studio post-dottorato NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.

Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso Weill Cornell Medicine. Tutti gli esperimenti di xenotrapianto, utilizzando tessuto ovarico, sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Entrambe le ovaie sono state isolate da un donatore di organi cerebralmente morto di 14 anni senza storia di radio / chemioterapia e nessuna storia documentata di condizioni endocrine o riproduttive. Il comitato di revisione...

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	<li>Aghadavod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+granulosa+cells+from+follicular+fluid;+Applications+in+biomedical+and+molecular+biology+experiments.">Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments.</a> Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+antral+follicles+of+xenograft+versus+ovarian+origin+reveals+disparate+molecular+signatures.">Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures.</a> Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).</li><li>Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+primordial+follicles+following+prolonged+transportation+of+ovarian+tissue+prior+to+cryopreservation.">Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation.</a> Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).</li><li>Jensen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+transplantations+of+cryopreserved+ovarian+tissue+to+41+women+in+Denmark.">Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark.</a> Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).</li><li>Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+storage+and+grafting+of+human+ovarian+tissue.">Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.</a> Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+superphysiologic+AMH+promotes+premature+luteinization+of+antral+follicles+in+human+ovarian+xenografts.">Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts.</a> Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicular+theca+cell+recruitment,+differentiation,+and+impact+on+fertility:+2017+update.">Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update.</a> Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).</li><li>Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+theca+cells+from+ovarian+cells+isolated+from+postmenopausal+women.">In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women.</a> Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).</li><li>Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+human+theca+stem+cells+and+their+differentiation+into+theca+progenitor+cells.">Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).</li></ol>

Una migliore risoluzione della diversità cellulare all'interno dei follicoli ovarici è clinicamente importante per diversi motivi. Nell'applicare il protocollo di cui sopra all'isolamento dei sottotipi fenotipici unici che risiedono all'interno dei follicoli dello stadio antrale, devono essere considerati diversi fattori. In primo luogo, la salute e la vitalità del tessuto ovarico da cui deriva il follicolo antrale è fondamentale per determinare la qualità delle cellule e il successo delle applicazioni a valle. Ques...

Gli elementi funzionali primari dell'ovaio umano sono i follicoli, che governano la crescita e lo sviluppo degli ovociti. I protocolli per l'isolamento delle cellule follicolari sono stati ben stabiliti nel contesto della fecondazione in vitro , ma questi sono appropriati solo per la raccolta di cellule da follicoli luteinizzati nel punto di prelievo ovocitario1. Abbiamo sviluppato un protocollo che consente l'isolamento di popolazioni cellulari discrete da follicoli antrali in diversi stadi di sviluppo che derivano da ovaie native o tessuto ovarico xenotrapiantato2. Sebbene vi sia consenso sul fatto che i contributi delle cellule residenti nel follicolo alla coltivazione dell'ovocita siano molto importanti, pochi studi hanno identificato ed estratto prospetticamente i sottotipi fenotipici unici presenti nei follicoli dello stadio antrale. Una comprensione più profonda della gerarchia di differenziazione e della trasduzione del segnale tra cellule specializzate durante le diverse fasi di sviluppo potrebbe ampliare la nostra comprensione della fisiologia ovarica in condizioni omeostatiche e patologiche. Inoltre, la discriminazione dei sottotipi cellulari discreti e i loro contributi molecolari alla crescita/maturazione del follicolo possono fornire un mezzo per generare surrogati ex vivo che ricostruiscono la funzione ovarica per favorire la maturazione degli ovociti e/o trattare la disfunzione endocrina. 
Ogni tipo di cellula unica all'interno dell'ovaio contribuisce alla complessa funzione del follicolo, che funziona efficacemente come un mini-organo discreto per favorire la crescita e la maturazione dell'ovocita che contiene. L'ovocita, il fulcro del follicolo, è direttamente avvolto da uno strato continuo di cellule della granulosa (GC), con le cellule della teca (TC) che formano uno strato secondario di cellule che si combinano con l'ovocita e i GC per comporre l'unità follicolare. Sebbene classificati in due gruppi, GC e TC contengono numerosi sottotipi. I GC sono classificati in base alla loro posizione all'interno del follicolo; I GC che circondano l'ovocita rispetto a quelli adiacenti alla membrana basale sono designati rispettivamente come GC oophorous e murali e questi sottotipi mostrano firme trascrittomiche uniche. I TC hanno numerosi sottotipi che funzionano per fornire supporto steroidogenico, metabolico e strutturale. Le cellule endoteliali, perivascolari e immunitarie svolgono un ruolo centrale nel mantenimento della normale fisiologia ovarica. Lo stroma ovarico serve non solo come substrato per la crescita del follicolo, ma probabilmente fornisce anche una fonte di progenitori che danno origine ai TC. Questo complesso multistrato di sottotipi cellulari all'interno dell'ovaio è ciò che consente la sua funzione sia come organo endocrino che riproduttivo.
Questo articolo presenta un protocollo per l'identificazione e la purificazione di cellule granulosa, teca, stromale, endoteliali ed ematopoietiche dai follicoli antrali. Abbiamo utilizzato questo protocollo per isolare queste cellule ovariche e analizzarle utilizzando il sequenziamento a singola cellula, seguito da colorazioni specifiche nei follicoli di diversi stadi di sviluppo. Il protocollo fornisce una metodologia semplice che è replicabile e consentirà l'analisi ad alta risoluzione sia della fisiologia che della patologia dell'ovaio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Anti-Anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mountant solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td>ProLong Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C 2674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D 2650</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cell Detachment Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat-inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td>no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S 1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 69.64 mL of Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 17.66 mL of fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 3.42 g of sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 10.65 mL of DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 1 mL of antibiotic-antimycotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Plasticware and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>CryoTube 1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430599</td>
			<td>60EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANPEP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB7227A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD55</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>311306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 99</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>371308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVRL</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long forceps (~150 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium forceps (~110 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 21 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>EF7281H</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 11 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>&#160;FH/CX7281A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp fine curved scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz Flourescence activated cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 META Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles

L'attivazione, la crescita, lo sviluppo e la maturazione degli ovociti è un processo complesso che è coordinato non solo tra più tipi di cellule dell'ovaio, ma anche attraverso più punti di controllo all'interno del circuito ipotalamo / ipofisi / ovarico. All'interno dell'ovaio, più tipi di cellule specializzate crescono in stretta associazione con l'ovocita all'interno dei follicoli ovarici. La biologia di queste cellule è stata ben descritta nelle fasi successive, quando sono facilmente recuperate come sottoprodotti dei trattamenti di riproduzione assistita. Tuttavia, l'analisi approfondita di piccoli follicoli antrali isolati direttamente dall'ovaio non viene comunemente effettuata a causa della scarsità di tessuto ovarico umano e del limitato accesso all'ovaio nelle pazienti sottoposte a trattamenti di riproduzione assistita. 
Questi metodi per il trattamento di ovaie intere per la crioconservazione di strisce corticali con la concomitante identificazione/isolamento delle cellule residenti nell'ovaio consentono l'analisi ad alta risoluzione delle prime fasi dello sviluppo del follicolo antrale. Dimostriamo protocolli per isolare tipi di cellule discrete trattando enzimaticamente i follicoli antrali e separando le cellule granulosa, teca, endoteliale, ematopoietica e stromale. L'isolamento delle cellule dai follicoli antrali a varie dimensioni e fasi di sviluppo consente l'analisi completa dei meccanismi cellulari e molecolari che guidano la crescita del follicolo e la fisiologia ovarica e fornisce una fonte di cellule vitali che possono essere coltivate in vitro per ricapitolare il microambiente follicolare.

Abbiamo isolato i follicoli dalla superficie dell'ovaio e li abbiamo trattati enzimaticamente per isolare i GC e le cellule di teca e stroma che circondano la cavità antrale. Le cellule sono state raccolte e le frazioni cellulari sono state selezionate dai follicoli antrali (diametri compresi tra 0,5 mm e 4 mm) mediante FACS a purezza del >95% (Figura 1).
Per etichettare e purificare frazioni cellulari uniche all'interno dei follicoli antrali umani, abbiamo combi...

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Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Qui presentiamo protocolli per l'identificazione e la purificazione delle cellule ovariche dai follicoli antrali. Elaboriamo i metodi per l'elaborazione di ovaie intere per la crioconservazione di strisce corticali e allo stesso tempo raccogliamo follicoli antrali intatti che vengono trattati enzimaticamente per liberare più tipi di cellule residenti nel follicolo, tra cui granulosa, teca, endoteliale, ematopoietica e cellule stromali.

Estrazione, etichettatura e purificazione di cellule specifiche del lignaggio da follicoli antrali umani

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

Il protocollo qui dimostrato consente la marcatura e l'isolamento di specifiche linee cellulari presenti nei follicoli ovarici a partire dalle prime fasi antrali, consentendo così l'analisi e la coltura ad alta risoluzione. Questo approccio altamente preciso utilizza combinazioni di anticorpi coniugati fluorofori per colpire i marcatori di superficie cellulare che sono espressi in modo robusto e specifico tra le linee discrete di granulosa, stroma e teca. Inizia posizionando l'ovaia in una capsula di Petri sterile e versa un mezzo refrigerato con esso per idratare il tessuto, assicurandoti che l'ovaio sia semi-immerso nel mezzo.Rimuovere eventuali punti di sutura o altro materiale e sezionare il tessuto circostante residuo lontano dall'ovaio. Per isolare i follicoli antrali, identificare i singoli follicoli e scegliere follicoli sani. Escludere eventuali follicoli pieni di sangue, scuri o non simmetrici.Isolare i follicoli antrali scelti dall'ovaio usando bisturi, mantenendo intatto l'antro e asportando il tessuto corticale che comprende il follicolo. Posizionare ciascun follicolo antrale intatto asportato in un pozzetto della piastra a sei pozzetti. Utilizzando un righello posto sotto il piatto, determinare il diametro del follicolo a scopo descrittivo.Utilizzando un bisturi, tagliare in due il follicolo antrale intatto per valutare la cavità antrale e aggiungere sei millilitri di mezzo di distacco di cellule enzimatiche prima di incubare la piastra in un incubatore umidificato per 10 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere sei millilitri di terreno disponibile contenente il 20% di siero bovino fetale, o FBS, e lavare con il terreno mediante ripetuti pipettaggi vigorosi sui follicoli bisecati con una micropipetta P-1000. Quindi, raccogliere il mezzo e passarlo attraverso un filtro da 100 millimetri.Dopo aver centrifugato il surnatante filtrato a 300 G e quattro gradi Celsius per tre minuti prima, aspirare il surnatante. Mettere il tessuto rimanente in una miscela di 100 unità per millilitro di collagenasi e un'unità per millilitro di dispasi diluita in una soluzione salina bilanciata prima di 30 minuti di incubazione. Interrompere meccanicamente il tessuto triturando e pipettando vigorosamente due volte dopo 10 e 20 minuti.Una volta fatto, recuperare il tessuto e lavare tramite pipettaggio, attraverso una punta di micropipetta P-1000 e filtrare attraverso un filtro da 100 millilitri. Centrifugare il tessuto teso a 300 G e quattro gradi Celsius per tre minuti prima di mettere il pellet cellulare arricchito con le cellule theca e le cellule stroma su ghiaccio per l'etichettatura e FACS. Per identificare le cellule della granulosa e le cellule della teca, risospendere i pellet cellulari in una soluzione bloccante contenente anticorpi direttamente coniugati e incubare a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Dopo aver lavato e centrifugato le cellule, risospendere le cellule in tampone FACS contenente 4-6 diamidino-2-fenilindolo, o DAPI, ed eseguire la sospensione cellulare attraverso uno strumento FACS per catturare una piccola popolazione di cellule, utilizzando l'intensità fluorescente degli anticorpi coniugati fluorofori per il gating. Bisecare il resto dell'ovaio. Asportare il midollo usando forbici sottili e bisturi curvi, evitando danni alla corteccia ovarica.Continuare l'elaborazione e l'assottigliamento della corteccia ovarica raschiando delicatamente fino a quando rimane un midollo minimo. Dividere il tessuto corticale in strisce larghe da due a tre millimetri lungo la lunghezza dell'ovaio. Per il congelamento del tessuto ovarico, inserire una striscia corticale in ciascun flaconcino criogenico refrigerato contenente la soluzione congelante.Agitare i flaconcini criogenici contenenti le strisce corticali su una piastra rotante per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Nucleato formazione di cristalli di ghiaccio toccando ogni flaconcino di crio con una punta di cotone brevemente immersa in azoto liquido. Le cellule ovariche sono state raccolte e le frazioni cellulari sono state selezionate dai follicoli antrali FACS a oltre il 95% di purezza.CD99 specificamente marcato cellule granulosa in PVRL1, o nectina, era sempre più localizzato nel compartimento cellulare della granulosa dell'oophorus man mano che i follicoli antrali aumentavano di dimensioni. Si è visto che gli anticorpi contro l'endoglina o CD55 demarcavano specificamente tutte le cellule dello stroma e della teca e che l'alanina aminopeptidasi era specificamente espressa dalle cellule androgene della teca. Le cellule sono state marcate con un anticorpo diretto contro CD99 per identificare le cellule della granulosa e gli anticorpi contro CD45 sono stati utilizzati per escludere le cellule ematopoietiche.Gli anticorpi contro PVRL1 hanno separato la popolazione cellulare della granulosa in compartimenti oophorus e murali. Dopo la digestione enzimatica con collagenasi dispasi, i preparati cellulari marcati con anticorpi contro CD55, CD34 e alanina aminopeptidasi hanno permesso la cattura di tutte le cellule stroma o teca o cellule androgene di teca con l'esclusione delle cellule endoteliali dalle popolazioni di cellule teca. Prestare particolare attenzione per evitare di interrompere l'antro dei follicoli durante l'isolamento iniziale del follicolo tagliando entro un margine di sicurezza attorno ai bordi del follicolo.A valle di questa procedura, le cellule possono essere utilizzate per analisi molecolari o diagnostiche o in alternativa coltivate in vitro per studi tossicologici, analisi sperimentali o ricapitolazione del microambiente follicolare. Ad oggi, questi metodi sono stati utilizzati per modellare i disturbi endocrini che coinvolgono l'ovaio e per identificare nuove sottopopolazioni di cellule associate al follicolo.

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