Name: extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles
Uploaded: 2022-11-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

Os autores agradecem o apoio do Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) e do Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). O N.L.G é apoiado pela bolsa de treinamento de pós-doutorado em Células-Tronco e Medicina Regenerativa da NYSTEM.

Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Weill Cornell Medicine. Todos os experimentos de xenotransplante utilizando tecido ovariano foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Ambos os ovários foram isolados de um doador de órgãos com morte encefálica de 14 anos, sem história de radio/quimioterapia e sem história documentada de condições endócrinas ou reprodutivas. O Comitê de Ética em Pesquisa (...

<ol>
	<li>Aghadavod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+granulosa+cells+from+follicular+fluid;+Applications+in+biomedical+and+molecular+biology+experiments.">Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments.</a> Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+antral+follicles+of+xenograft+versus+ovarian+origin+reveals+disparate+molecular+signatures.">Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures.</a> Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).</li><li>Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+primordial+follicles+following+prolonged+transportation+of+ovarian+tissue+prior+to+cryopreservation.">Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation.</a> Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).</li><li>Jensen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+transplantations+of+cryopreserved+ovarian+tissue+to+41+women+in+Denmark.">Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark.</a> Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).</li><li>Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+storage+and+grafting+of+human+ovarian+tissue.">Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.</a> Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+superphysiologic+AMH+promotes+premature+luteinization+of+antral+follicles+in+human+ovarian+xenografts.">Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts.</a> Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicular+theca+cell+recruitment,+differentiation,+and+impact+on+fertility:+2017+update.">Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update.</a> Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).</li><li>Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+theca+cells+from+ovarian+cells+isolated+from+postmenopausal+women.">In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women.</a> Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).</li><li>Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+human+theca+stem+cells+and+their+differentiation+into+theca+progenitor+cells.">Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).</li></ol>

A melhor resolução da diversidade celular dentro dos folículos ovarianos é clinicamente importante por várias razões. Na aplicação do protocolo acima para o isolamento dos subtipos fenotípicos únicos que residem nos folículos em estágio antral, vários fatores devem ser considerados. Em primeiro lugar, a saúde e a viabilidade do tecido ovariano do qual o folículo antral é derivado é fundamental para determinar a qualidade das células e o sucesso das aplicações a jusante. Isso pode ser otimizado minimiz...

Os principais elementos funcionais do ovário humano são os folículos, que governam o crescimento e desenvolvimento dos ovócitos. Protocolos para o isolamento de células foliculares estão bem estabelecidos no contexto da fertilização in vitro , mas são apropriados apenas para a coleta de células de folículos luteinizados no ponto de recuperação oocitária1. Desenvolvemos um protocolo que permite o isolamento de populações celulares discretas de folículos antrais em diferentes estágios de desenvolvimento que surgem de ovários nativos ou tecido ovariano xenotransplantado2. Embora haja consenso de que as contribuições das células residentes nos folículos para o cultivo do ovócito são de grande importância, poucos estudos identificaram e extraíram prospectivamente os subtipos fenotípicos únicos presentes nos folículos em estágio antral. Uma compreensão mais profunda da hierarquia de diferenciação e transdução de sinal entre células especializadas durante os diferentes estágios de desenvolvimento poderia ampliar nossa compreensão da fisiologia ovariana sob condições homeostáticas e patológicas. Além disso, a discriminação de subtipos celulares discretos e suas contribuições moleculares para o crescimento/maturação dos folículos podem fornecer um meio de gerar substitutos ex vivo que reconstroem a função ovariana para promover a maturação oocitária e/ou tratar a disfunção endócrina. 
Cada tipo de célula única dentro do ovário contribui para a função complexa do folículo, que funciona efetivamente como um mini-órgão discreto para promover o crescimento e a maturação do ovócito que contém. O ovócito, peça central do folículo, é diretamente envolvido por uma camada contínua de células da granulosa (GCs), com as células da teca (CTs) formando uma camada secundária de células que se combinam com o ovócito e os GCs para compor a unidade folicular. Embora classificados em dois grupos, os GCs e CTs contêm vários subtipos. Os GCs são classificados de acordo com sua posição dentro do folículo; Os GCs que circundam o ovócito versus aqueles adjacentes à membrana basal são designados como GCs oóforos e murais, respectivamente, e esses subtipos exibem assinaturas transcriptômicas únicas. Os CTs têm vários subtipos que funcionam para fornecer suporte esteroidogênico, metabólico e estrutural. Células endoteliais, perivasculares e imunes desempenham um papel central na manutenção da fisiologia ovariana normal. O estroma ovariano serve não apenas como substrato para o crescimento dos folículos, mas também provavelmente fornece uma fonte de progenitores que dão origem aos CTs. Este complexo multicamadas de subtipos celulares dentro do ovário é o que permite sua função como um órgão endócrino e reprodutivo.
Este trabalho apresenta um protocolo para identificação e purificação de células granulosas, tecais, estromais, endoteliais e hematopoéticas de folículos antrais. Utilizamos este protocolo para isolar essas células ovarianas e analisá-las usando sequenciamento unicelular, seguido de coloração específica em folículos de diferentes estágios de desenvolvimento. O protocolo fornece uma metodologia simples que é replicável e permitirá a análise de alta resolução da fisiologia e patologia do ovário.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Anti-Anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mountant solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td>ProLong Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C 2674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D 2650</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cell Detachment Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat-inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td>no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S 1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 69.64 mL of Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 17.66 mL of fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 3.42 g of sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 10.65 mL of DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 1 mL of antibiotic-antimycotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Plasticware and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>CryoTube 1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430599</td>
			<td>60EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANPEP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB7227A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD55</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>311306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 99</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>371308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVRL</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long forceps (~150 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium forceps (~110 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 21 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>EF7281H</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 11 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>&#160;FH/CX7281A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp fine curved scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz Flourescence activated cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 META Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles

A ativação, crescimento, desenvolvimento e maturação dos ovócitos é um processo complexo que é coordenado não apenas entre vários tipos celulares do ovário, mas também através de múltiplos pontos de controle dentro do circuito hipotálamo/hipófise/ovariano. Dentro do ovário, vários tipos de células especializadas crescem em estreita associação com o ovócito dentro dos folículos ovarianos. A biologia dessas células tem sido bem descrita nos estágios mais avançados, quando são facilmente recuperadas como subprodutos de tratamentos de reprodução assistida. No entanto, a análise aprofundada de pequenos folículos antrais isolados diretamente do ovário não é comumente realizada devido à escassez de tecido ovariano humano e ao acesso limitado ao ovário em pacientes submetidas a tratamentos de reprodução assistida. 
Estes métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais com a identificação/isolamento concomitante de células residentes nos ovários permitem a análise de alta resolução dos estágios iniciais do desenvolvimento dos folículos antrais. Demonstramos protocolos para isolar tipos celulares discretos através do tratamento enzimaticamente dos folículos antrais e separação das células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoéticas e estromais. O isolamento de células dos folículos antrais em vários tamanhos e estágios de desenvolvimento permite a análise abrangente dos mecanismos celulares e moleculares que conduzem o crescimento dos folículos e a fisiologia ovariana e fornece uma fonte de células viáveis que podem ser cultivadas in vitro para recapitular o microambiente folicular.

Isolamos os folículos da superfície do ovário e os tratamos enzimaticamente para isolar os GCs, bem como as células do teca e do estroma ao redor da cavidade antral. As células foram coletadas, e as frações celulares foram separadas dos folículos antrais (diâmetros variando entre 0,5 mm e 4 mm) por FACS para >95% de pureza (Figura 1).
Para marcar e purificar frações celulares únicas dentro dos folículos antrais humanos, combinamos digestão enzimátic...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Aqui, apresentamos protocolos para a identificação e purificação de células ovarianas de folículos antrais. Elaboramos métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais e também colhemos de folículos antrais intactos que são tratados enzimaticamente para liberar vários tipos de células residentes de folículos, incluindo células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoiéticas e estromais.

Extração, marcação e purificação de células específicas de linhagem de folículos antrais humanos

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

O protocolo aqui demonstrado possibilita a marcação e o isolamento de linhagens celulares específicas presentes nos folículos ovarianos a partir dos estágios iniciais do antral, possibilitando a análise e cultura em alta resolução. Esta abordagem altamente precisa utiliza combinações de anticorpos conjugados fluoróforos para marcadores de superfície celular alvo que são robusta e especificamente expressos entre linhagens discretas de granulosa, estroma e teca. Comece colocando o ovário em uma placa de Petri estéril e despeje um meio resfriado com ele para hidratar o tecido, garantindo que o ovário fique semi-submerso no meio.Remova quaisquer suturas ou outro material e disseque o tecido residual circundante longe do ovário. Para isolar os folículos antrais, identifique folículos individuais e escolha folículos saudáveis. Excluir folículos cheios de sangue, escuros ou não simétricos.Isolar os folículos antrais escolhidos do ovário com bisturi, mantendo o antro intacto e excisando o tecido cortical que engloba o folículo. Coloque cada folículo antral intacto excisado em um poço da placa de seis poços. Usando uma régua colocada abaixo da placa, determine o diâmetro do folículo para fins descritivos.Com bisturi, bissetriz o folículo antral intacto para avaliar a cavidade antral e adicionar seis mililitros de meio de descolamento enzimático de células antes de incubar a placa em estufa umidificada por 10 minutos. Após a incubação, adicionar seis mililitros de meio disponível contendo 20% de soro fetal bovino, ou FBS, e lavar com o meio por pipetagem vigorosa repetida sobre os folículos bissectados com uma micropipeta P-1000. Em seguida, colete o meio e passe por um filtro de 100 milímetros.Depois de centrifugar o sobrenadante filtrado a 300 G e quatro graus Celsius por três minutos antes, aspirar o sobrenadante. Colocar o tecido remanescente em uma mistura de 100 unidades por mililitro de colagenase e uma unidade por mililitro de dispase diluída em solução salina balanceada antes de 30 minutos de incubação. Romper mecanicamente o tecido triturando e pipetando vigorosamente duas vezes após 10 e 20 minutos.Uma vez feito, recupere o tecido e lave por pipetagem, através de uma ponteira de micropipeta P-1000, e coe através de um filtro de 100 mililitros. Centrifugar o tecido coado a 300 G e quatro graus Celsius por três minutos antes de colocar o pellet de células enriquecido com as células da teca e células do estroma no gelo para marcação e FACS. Para identificar as células da granulosa e as células da teca, ressuspender os pellets celulares em uma solução de bloqueio contendo anticorpos diretamente conjugados e incubar a quatro graus Celsius por 10 minutos.Depois de lavar e centrifugar as células, ressuspendê-las em tampão FACS contendo 4-6 diamidino-2-fenilindol, ou DAPI, e executar a suspensão celular através de um instrumento FACS para capturar uma pequena população de células, usando a intensidade fluorescente de anticorpos conjugados fluoróforos para gating. Bissetriz o restante do ovário. Excise a medula usando tesouras finas curvas e bisturis, evitando danos ao córtex ovariano.Continue o processamento e o afinamento do córtex ovariano raspando suavemente até que a medula mínima permaneça. Divida o tecido cortical em tiras de dois a três milímetros de largura ao longo do comprimento do ovário. Para congelamento do tecido ovariano, colocar uma tira cortical em cada frasco para injetáveis criogénicos refrigerado contendo a solução de congelação.Agitar os frascos para injetáveis criogénicos que contêm as tiras corticais numa placa giratória durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Nuclear a formação de cristais de gelo tocando cada frasco de crio com uma ponta de algodão brevemente imersa em nitrogênio líquido. As células ovarianas foram coletadas e as frações celulares foram separadas dos folículos antrais FACS com mais de 95% de pureza.CD99 especificamente marcadas com células granulosas em PVRL1, ou nectina, foi cada vez mais localizada no compartimento celular do oóforo granuloso à medida que os folículos antrais aumentavam de tamanho. Observou-se que os anticorpos contra endoglina ou CD55 demarcavam especificamente todas as células do estroma e da teca e que a alanina aminopeptidase era expressa especificamente pelas células tecais androgênicas. As células foram marcadas com um anticorpo direcionado contra CD99 para identificar células da granulosa e anticorpos contra CD45 foram usados para excluir células hematopoéticas.Os anticorpos contra PVRL1 separaram a população de células da granulosa em oóforo e compartimentos murais. Após digestão enzimática com colagenase dispase, as preparações celulares marcadas com anticorpos contra CD55, CD34 e alanina aminopeptidase permitiram a captura de todas as células do estroma ou teca ou células tecais androgênicas com a exclusão das células endoteliais das populações das células da teca. Tome especial cuidado para evitar interromper o antro dos folículos durante o isolamento inicial do folículo, cortando dentro de uma margem segura ao redor das bordas do folículo.A jusante desse procedimento, as células podem ser utilizadas para análise molecular ou diagnóstica ou, alternativamente, cultivadas in vitro para estudos toxicológicos, análises experimentais ou recapitulação do microambiente folicular. Até o momento, esses métodos foram usados para modelar distúrbios endócrinos envolvendo o ovário e para identificar novas subpopulações de células associadas aos folículos.

Research

JoVE Journal

Biology

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Células ES: Cultura A partir de células congeladas

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Biologia

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extração e Análise de Cortisol de cabelo humano e do macaco

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Visualização e quantificação de células mesenquimais Adipogenic diferenciação potencial com um marcador específico da linhagem

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Coleta de tecidos e extração de RNA da articulação do joelho osteoartrítica humana

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...