Name: extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles
Uploaded: 2022-11-30T13:40:00
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Los autores reconocen el apoyo del Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) y el Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G cuenta con el apoyo de la beca de capacitación postdoctoral NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.

Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Weill Cornell Medicine. Todos los experimentos de xenotrasplante con tejido ovárico se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Ambos ovarios se aislaron de un donante de órganos con muerte cerebral de 14 años sin antecedentes de radio/quimioterapia y sin antecedentes documentados de afecciones endocrinas o reproductivas. El Comité de la Junta de Revisión Institucion...

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	<li>Aghadavod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+granulosa+cells+from+follicular+fluid;+Applications+in+biomedical+and+molecular+biology+experiments.">Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments.</a> Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+antral+follicles+of+xenograft+versus+ovarian+origin+reveals+disparate+molecular+signatures.">Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures.</a> Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).</li><li>Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+primordial+follicles+following+prolonged+transportation+of+ovarian+tissue+prior+to+cryopreservation.">Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation.</a> Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).</li><li>Jensen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+transplantations+of+cryopreserved+ovarian+tissue+to+41+women+in+Denmark.">Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark.</a> Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).</li><li>Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+storage+and+grafting+of+human+ovarian+tissue.">Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.</a> Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+superphysiologic+AMH+promotes+premature+luteinization+of+antral+follicles+in+human+ovarian+xenografts.">Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts.</a> Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicular+theca+cell+recruitment,+differentiation,+and+impact+on+fertility:+2017+update.">Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update.</a> Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).</li><li>Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+theca+cells+from+ovarian+cells+isolated+from+postmenopausal+women.">In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women.</a> Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).</li><li>Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+human+theca+stem+cells+and+their+differentiation+into+theca+progenitor+cells.">Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).</li></ol>

Una mejor resolución de la diversidad celular dentro de los folículos ováricos es clínicamente importante por varias razones. Al aplicar el protocolo anterior al aislamiento de los subtipos fenotípicos únicos que residen dentro de los folículos en etapa antral, se deben considerar varios factores. En primer lugar, la salud y la viabilidad del tejido ovárico del que se deriva el folículo antral es fundamental para determinar la calidad de las células y el éxito de las aplicaciones posteriores. Esto se puede opt...

Los elementos funcionales primarios del ovario humano son los folículos, que gobiernan el crecimiento y desarrollo de los ovocitos. Los protocolos para el aislamiento de células foliculares han sido bien establecidos en el contexto de la fertilización in vitro , pero estos son apropiados solo para la recolección de células de folículos luteinizados en el punto de recuperación de ovocitos1. Hemos desarrollado un protocolo que permite el aislamiento de poblaciones de células discretas de folículos antrales en diferentes etapas de desarrollo que surgen de ovarios nativos o tejido ovárico xenotrasplantado2. Aunque existe consenso en que las contribuciones de las células residentes del folículo al cultivo del ovocito son muy importantes, pocos estudios han identificado y extraído prospectivamente los subtipos fenotípicos únicos presentes en los folículos en etapa antral. Una comprensión más profunda de la jerarquía de diferenciación y la transducción de señales entre células especializadas durante las diferentes etapas de desarrollo podría ampliar nuestra comprensión de la fisiología ovárica en condiciones homeostáticas y patológicas. Además, la discriminación de subtipos celulares discretos y sus contribuciones moleculares al crecimiento/maduración del folículo puede proporcionar un medio para generar sustitutos ex vivo que reconstruyan la función ovárica para fomentar la maduración de los ovocitos y/o tratar la disfunción endocrina. 
Cada tipo de célula único dentro del ovario contribuye a la compleja función del folículo, que funciona eficazmente como un mini-órgano discreto para fomentar el crecimiento y la maduración del ovocito que contiene. El ovocito, la pieza central del folículo, está directamente envuelto por una capa continua de células de la granulosa (GC), con las células de la teca (TC) formando una capa secundaria de células que se combinan con el ovocito y los GC para componer la unidad folicular. Aunque se clasifican en dos grupos, los GC y los CT contienen numerosos subtipos. Los GC se clasifican según su posición dentro del folículo; Los GC que rodean el ovocito frente a los que están adyacentes a la membrana basal se designan como GC ooforosos y murales, respectivamente, y estos subtipos muestran firmas transcriptómicas únicas. Los CT tienen numerosos subtipos que funcionan para proporcionar soporte esteroidogénico, metabólico y estructural. Las células endoteliales, perivasculares e inmunes desempeñan un papel central en el mantenimiento de la fisiología ovárica normal. El estroma ovárico sirve no solo como sustrato para el crecimiento del folículo, sino que también proporciona una fuente de progenitores que dan lugar a CT. Este complejo multicapa de subtipos celulares dentro del ovario es lo que permite su función como órgano endocrino y reproductivo.
Este artículo presenta un protocolo para la identificación y purificación de células granulosa, teca, estromales, endoteliales y hematopoyéticas de folículos antrales. Hemos utilizado este protocolo para aislar estas células ováricas y analizarlas mediante secuenciación de células individuales, seguida de tinción específica en folículos de diferentes etapas de desarrollo. El protocolo proporciona una metodología sencilla que es replicable y permitirá el análisis de alta resolución tanto de la fisiología como de la patología del ovario.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Anti-Anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mountant solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td>ProLong Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C 2674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D 2650</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cell Detachment Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat-inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td>no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S 1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 69.64 mL of Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 17.66 mL of fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 3.42 g of sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 10.65 mL of DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 1 mL of antibiotic-antimycotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Plasticware and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>CryoTube 1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430599</td>
			<td>60EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANPEP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB7227A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD55</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>311306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 99</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>371308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVRL</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long forceps (~150 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium forceps (~110 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 21 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>EF7281H</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 11 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>&#160;FH/CX7281A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp fine curved scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz Flourescence activated cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 META Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles

La activación, el crecimiento, el desarrollo y la maduración de los ovocitos es un proceso complejo que se coordina no solo entre múltiples tipos de células del ovario, sino también a través de múltiples puntos de control dentro del circuito hipotalámico / pituitario / ovárico. Dentro del ovario, múltiples tipos de células especializadas crecen en estrecha asociación con el ovocito dentro de los folículos ováricos. La biología de estas células ha sido bien descrita en etapas posteriores, cuando se recuperan fácilmente como subproductos de los tratamientos de reproducción asistida. Sin embargo, el análisis en profundidad de pequeños folículos antrales aislados directamente del ovario no se lleva a cabo comúnmente debido a la escasez de tejido ovárico humano y el acceso limitado al ovario en pacientes sometidas a tratamientos de reproducción asistida. 
Estos métodos para procesar ovarios enteros para la criopreservación de tiras corticales con la identificación / aislamiento concurrente de células residentes del ovario permiten el análisis de alta resolución de las primeras etapas del desarrollo del folículo antral. Demostramos protocolos para aislar tipos de células discretas mediante el tratamiento enzimático de los folículos antrales y la separación de las células granulosa, teca, endotelial, hematopoyética y estromal. El aislamiento de células de los folículos antrales en varios tamaños y etapas de desarrollo permite el análisis exhaustivo de los mecanismos celulares y moleculares que impulsan el crecimiento del folículo y la fisiología ovárica y proporciona una fuente de células viables que pueden cultivarse in vitro para recapitular el microambiente del folículo.

Aislamos folículos de la superficie del ovario y los tratamos enzimáticamente para aislar los GC, así como las células de teca y estroma que rodean la cavidad antral. Las células fueron recolectadas, y las fracciones celulares fueron clasificadas de los folículos antrales (diámetros que oscilan entre 0,5 mm y 4 mm) por FACS a >95% de pureza (Figura 1).
Para etiquetar y purificar fracciones celulares únicas dentro de los folículos antrales humanos, combina...

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Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Aquí, presentamos protocolos para la identificación y purificación de células ováricas de folículos antrales. Elaboramos métodos para procesar ovarios enteros para la criopreservación de tiras corticales mientras también cosechamos folículos antrales intactos que se tratan enzimáticamente para liberar múltiples tipos de células residentes del folículo, incluidas las células granulosa, teca, endotelial, hematopoyética y estromales.

Extracción, etiquetado y purificación de células específicas del linaje de folículos antrales humanos

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

El protocolo aquí demostrado permite el etiquetado y aislamiento de linajes celulares específicos que están presentes en los folículos ováricos comenzando en etapas antrales tempranas, lo que permite el análisis y cultivo de alta resolución. Este enfoque altamente preciso utiliza combinaciones de anticuerpos conjugados fluoróforos para atacar marcadores de superficie celular que se expresan de manera robusta y específica entre los linajes discretos de granulosa, estroma y teca. Comience colocando el ovario en una placa de Petri estéril y vierta un medio frío con él para hidratar el tejido, asegurándose de que el ovario esté medio sumergido en el medio.Retire cualquier sutura u otro material, y diseccionar el tejido circundante residual lejos del ovario. Para aislar los folículos antrales, identifique los folículos individuales y elija folículos sanos. Excluya cualquier folículo lleno de sangre, oscuro o no simétrico.Aislar los folículos antrales elegidos del ovario usando bisturís, manteniendo el antro intacto y extirpando el tejido cortical que abarca el folículo. Coloque cada folículo antral intacto extirpado en un pocillo de la placa de seis pocillos. Usando una regla colocada debajo del plato, determine el diámetro del folículo con fines descriptivos.Usando un bisturí, divida el folículo antral intacto para evaluar la cavidad antral y agregue seis mililitros de medio de desprendimiento de células enzimáticas antes de incubar la placa en una incubadora humidificada durante 10 minutos. Después de la incubación, agregue seis mililitros de medio disponible que contenga 20% de suero bovino fetal, o FBS, y enjuague con el medio con un pipeteo vigoroso repetido sobre los folículos biseccionados con una micropipeta P-1000. A continuación, recoge el medio y pásalo por un filtro de 100 milímetros.Después de centrifugar el sobrenadante filtrado a 300 G y cuatro grados centígrados durante tres minutos antes, aspirar el sobrenadante. Coloque el tejido restante en una mezcla de 100 unidades por mililitro de colagenasa y una unidad por mililitro de dispasa diluida en una solución salina equilibrada antes de los 30 minutos de incubación. Interrumpir mecánicamente el tejido triturando y pipeteando vigorosamente dos veces después de 10 y 20 minutos.Una vez hecho esto, recupere el tejido y enjuague mediante pipeteo, a través de una punta de micropipeta P-1000, y cuele a través de un filtro de 100 mililitros. Centrifugar el tejido tensado a 300 g y cuatro grados centígrados durante tres minutos antes de poner el pellet de células enriquecido con las células de teca y células de estroma en hielo para su etiquetado y FACS. Para identificar las células de la granulosa y las células de la teca, resuspender los gránulos celulares en una solución de bloqueo que contenga anticuerpos directamente conjugados e incubar a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Después de lavar y centrifugar las células, resuspender las células en tampón FACS que contiene 4-6 diamidino-2-fenilindol, o DAPI, y ejecutar la suspensión celular a través de un instrumento FACS para capturar una pequeña población de células, utilizando la intensidad fluorescente de anticuerpos conjugados fluoróforos para gating. Dividir el resto del ovario. Extirpe la médula con tijeras finas curvas y bisturís, evitando daños en la corteza ovárica.Continúe el procesamiento y adelgazamiento de la corteza ovárica raspando suavemente hasta que quede una médula mínima. Divida el tejido cortical en tiras de dos a tres milímetros de ancho a lo largo de la longitud del ovario. Para la congelación del tejido ovárico, coloque una tira cortical en cada vial criogénico refrigerado que contenga la solución de congelación.Agite los viales criogénicos que contienen las tiras corticales en una placa giratoria durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Nuclee la formación de cristales de hielo tocando cada vial criogénico con una punta de algodón brevemente sumergida en nitrógeno líquido. Se recolectaron las células ováricas y las fracciones celulares se clasificaron de los folículos antrales FACS a más del 95% de pureza.Las células de la granulosa marcadas específicamente con CD99 en PVRL1, o nectina, se localizaron cada vez más en el compartimiento de células del oophorus granulosa a medida que los folículos antrales aumentaban de tamaño. Se observó que los anticuerpos contra la endoglina o CD55 demarcaban específicamente todas las células del estroma y la teca y que la alanina aminopeptidasa se expresaba específicamente por las células androgénicas de la teca. Las células se marcaron con un anticuerpo dirigido contra CD99 para identificar células de la granulosa y se utilizaron anticuerpos contra CD45 para excluir las células hematopoyéticas.Los anticuerpos contra PVRL1 separaron la población de células de la granulosa en compartimentos oophorus y murales. Después de la digestión enzimática con colagenasa dispasa, las preparaciones celulares marcadas con anticuerpos contra CD55, CD34 y alanina aminopeptidasa permitieron la captura de todas las células del estroma o teca o células teca androgénicas con la exclusión de las células endoteliales de las poblaciones de células teca. Tenga especial cuidado para evitar interrumpir el antro de los folículos durante el aislamiento inicial del folículo cortando dentro de un margen seguro alrededor de los bordes del folículo.Aguas abajo de este procedimiento, las células pueden utilizarse para análisis moleculares o de diagnóstico o, alternativamente, cultivarse in vitro para estudios de toxicología, análisis experimental o recapitulación del microambiente del folículo. Hasta la fecha, estos métodos se utilizaron para modelar trastornos endocrinos que involucran el ovario e identificar nuevas subpoblaciones de células asociadas al folículo.

Research

JoVE Journal

Biology

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