Name: extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles
Uploaded: 2022-11-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

Yazarlar, Queenie Victorina Neri Araştırma Bursu Ödülü (DJ) ve Hung-Ching Liu Araştırma Bursu Ödülü'nün (LM) desteğini kabul etmektedir. N.L.G, NYSTEM Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp doktora sonrası eğitim hibesi ile desteklenmektedir.

Fareleri içeren tüm prosedürler, Weill Cornell Medicine'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Yumurtalık dokusu kullanılarak yapılan tüm ksenotransplantasyon deneyleri, ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirildi. Her iki yumurtalık da radyo/kemoterapi öyküsü olmayan ve belgelenmiş endokrin veya üreme koşulları öyküsü olmayan 14 yaşındaki beyin ölümü gerçekleşmiş organ bağışçısından izole edildi. Weill Cornell Med...

<ol>
	<li>Aghadavod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+granulosa+cells+from+follicular+fluid;+Applications+in+biomedical+and+molecular+biology+experiments.">Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments.</a> Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+antral+follicles+of+xenograft+versus+ovarian+origin+reveals+disparate+molecular+signatures.">Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures.</a> Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).</li><li>Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+primordial+follicles+following+prolonged+transportation+of+ovarian+tissue+prior+to+cryopreservation.">Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation.</a> Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).</li><li>Jensen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+transplantations+of+cryopreserved+ovarian+tissue+to+41+women+in+Denmark.">Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark.</a> Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).</li><li>Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+storage+and+grafting+of+human+ovarian+tissue.">Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.</a> Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).</li><li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+superphysiologic+AMH+promotes+premature+luteinization+of+antral+follicles+in+human+ovarian+xenografts.">Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts.</a> Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicular+theca+cell+recruitment,+differentiation,+and+impact+on+fertility:+2017+update.">Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update.</a> Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).</li><li>Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+theca+cells+from+ovarian+cells+isolated+from+postmenopausal+women.">In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women.</a> Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).</li><li>Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+human+theca+stem+cells+and+their+differentiation+into+theca+progenitor+cells.">Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).</li></ol>

Yumurtalık foliküllerindeki hücresel çeşitliliğin daha iyi çözülmesi çeşitli nedenlerden dolayı klinik olarak önemlidir. Yukarıdaki protokolün antral evre foliküllerinde bulunan benzersiz fenotipik alt tiplerin izolasyonuna uygulanmasında, çeşitli faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, antral folikülün türetildiği yumurtalık dokusunun sağlığı ve canlılığı, hücrelerin kalitesini ve aşağı akış uygulamalarının başarısını belirlemede kritik öneme sahiptir. Bu, ...

İnsan yumurtalıklarının birincil fonksiyonel elemanları, oositlerin büyümesini ve gelişimini yöneten foliküllerdir. Foliküler hücrelerin izolasyonu için protokoller in vitro fertilizasyon bağlamında iyi bir şekilde oluşturulmuştur, ancak bunlar sadece oosit elde etme noktasında luteinize foliküllerden hücrelerin toplanması için uygundur1. Doğal yumurtalıklardan veya ksenotransplante edilmiş yumurtalık dokusundan kaynaklanan farklı gelişim aşamalarında ayrı hücre popülasyonlarının antral foliküllerden izole edilmesini sağlayan bir protokol geliştirdik2. Folikül yerleşik hücrelerinin oosit yetiştiriciliğine katkılarının son derece önemli olduğu konusunda fikir birliği olmasına rağmen, az sayıda çalışma antral evre foliküllerinde bulunan benzersiz fenotipik alt tipleri prospektif olarak tanımlamış ve çıkarmıştır. Farklı gelişim aşamalarında uzmanlaşmış hücreler arasındaki farklılaşma hiyerarşisinin ve sinyal iletiminin daha derin bir şekilde anlaşılması, homeostatik ve patolojik koşullar altında yumurtalık fizyolojisi anlayışımızı genişletebilir. Ayrıca, ayrık hücresel alt tiplerin ayırt edilmesi ve folikül büyümesine / olgunlaşmasına moleküler katkıları, oosit olgunlaşmasını teşvik etmek ve / veya endokrin disfonksiyonu tedavi etmek için yumurtalık fonksiyonunu yeniden yapılandıran ex vivo vekiller üretmenin bir yolunu sağlayabilir. 
Yumurtalık içindeki her benzersiz hücre tipi, içerdiği oositin büyümesini ve olgunlaşmasını teşvik etmek için ayrı bir mini organ olarak etkili bir şekilde işlev gören folikülün karmaşık işlevine katkıda bulunur. Folikülün merkezi olan oosit, doğrudan sürekli bir granüloza hücresi tabakası (GC'ler) ile sarılır, teka hücreleri (TC'ler), foliküler üniteyi oluşturmak için oosit ve GC'lerle birleşen ikincil bir hücre tabakası oluşturur. İki gruba ayrılmasına rağmen, GC'ler ve TC'ler çok sayıda alt tip içerir. GC'ler folikül içindeki konumlarına göre sınıflandırılır; Bazal membrana bitişik olanlara karşı oositi çevreleyen GC'ler sırasıyla ooforlu ve duvar GC'leri olarak tanımlanır ve bu alt tipler benzersiz transkriptomik imzalar gösterir. TC'lerin steroidojenik, metabolik ve yapısal destek sağlamak için işlev gören çok sayıda alt tipi vardır. Endotelyal, perivasküler ve immün hücreler normal over fizyolojisinin korunmasında merkezi bir rol oynar. Yumurtalık stroması sadece folikül büyümesi için bir substrat olarak hizmet etmekle kalmaz, aynı zamanda TC'lere yol açan bir progenitör kaynağı sağlar. Yumurtalık içindeki bu çok katmanlı hücresel alt tip kompleksi, hem endokrin hem de üreme organı olarak işlev görmesini sağlayan şeydir.
Bu yazıda antral foliküllerden granüloza, teka, stromal, endotel ve hematopoetik hücrelerin tanımlanması ve saflaştırılması için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokolü, bu yumurtalık hücrelerini izole etmek ve bunları tek hücreli dizileme kullanarak analiz etmek, ardından farklı gelişim aşamalarındaki foliküllerde spesifik boyama yapmak için kullandık. Protokol, tekrarlanabilir ve yumurtalık fizyolojisinin ve patolojisinin yüksek çözünürlüklü analizini sağlayacak basit bir metodoloji sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Anti-Anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mountant solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td>ProLong Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C 2674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D 2650</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cell Detachment Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat-inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td>no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S 1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 69.64 mL of Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 17.66 mL of fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 3.42 g of sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 10.65 mL of DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 1 mL of antibiotic-antimycotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Plasticware and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>CryoTube 1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430599</td>
			<td>60EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANPEP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB7227A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD55</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>311306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 99</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>371308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVRL</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long forceps (~150 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium forceps (~110 mm length)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 21 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>EF7281H</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>number 11 scalpel</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>&#160;FH/CX7281A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp fine curved scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz Flourescence activated cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 META Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction, labeling, and purification of lineage-specific cells from human antral follicles

Yumurtaların aktivasyonu, büyümesi, gelişmesi ve olgunlaşması, sadece yumurtalığın çoklu hücre tipleri arasında değil, aynı zamanda hipotalamik / hipofiz / yumurtalık devresindeki çoklu kontrol noktaları arasında koordine edilen karmaşık bir süreçtir. Yumurtalık içinde, yumurtalık folikülleri içindeki oosit ile yakın ilişki içinde çok sayıda özelleşmiş hücre tipi büyür. Bu hücrelerin biyolojisi, yardımcı üreme tedavilerinin yan ürünleri olarak kolayca geri kazanıldıkları sonraki aşamalarda iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, doğrudan yumurtalıktan izole edilen küçük antral foliküllerin derinlemesine analizi, insan yumurtalık dokusunun azlığı ve yardımcı üreme tedavisi gören hastalarda yumurtalıklara sınırlı erişim nedeniyle yaygın olarak yapılmamaktadır. 
Kortikal şeritlerin kriyoprezervasyonu için tüm yumurtalıkların işlenmesi için kullanılan bu yöntemler, yumurtalık yerleşik hücrelerinin eşzamanlı tanımlanması / izolasyonu ile antral folikül gelişiminin erken aşamalarının yüksek çözünürlüklü analizini sağlar. Antral folikülleri enzimatik olarak tedavi ederek ve granüloza, teka, endotelyal, hematopoetik ve stromal hücreleri ayırarak ayrık hücre tiplerini izole etmek için protokoller gösteriyoruz. Hücrelerin antral foliküllerden çeşitli boyutlarda ve gelişim aşamalarında izolasyonu, folikül büyümesini ve yumurtalık fizyolojisini yönlendiren hücresel ve moleküler mekanizmaların kapsamlı analizini sağlar ve folikül mikroortamını özetlemek için in vitro olarak kültürlenebilen canlı hücrelerin bir kaynağını sağlar.

Folikülleri yumurtalık yüzeyinden izole ettik ve GC'lerin yanı sıra antral boşluğu çevreleyen theca ve stroma hücrelerini izole etmek için enzimatik olarak tedavi ettik. Hücreler toplandı ve hücre fraksiyonları antral foliküllerden (0.5 mm ile 4 mm arasında değişen çaplar) FACS tarafından% >95 saflığa kadar sıralandı (Şekil 1).
İnsan antral foliküllerindeki benzersiz hücresel fraksiyonları etiketlemek ve saflaştırmak için, enzimatik...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles at JoVE.com

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Burada, yumurtalık hücrelerinin antral foliküllerden tanımlanması ve saflaştırılması için protokoller sunuyoruz. Kortikal şeritlerin kriyoprezervasyonu için tüm yumurtalıkların işlenmesi için yöntemler üzerinde dururken, aynı zamanda granüloza, teka, endotelyal, hematopoetik ve stromal hücreler de dahil olmak üzere çoklu folikül yerleşik hücre tiplerini serbest bırakmak için enzimatik olarak muamele edilen bozulmamış antral folikülleri hasat ediyoruz.

İnsan Antral Foliküllerinden Soya Özgü Hücrelerin Ekstraksiyonu, Etiketlenmesi ve Saflaştırılması

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

Burada gösterilen protokol, erken antral aşamalardan başlayarak yumurtalık foliküllerinde bulunan spesifik hücre soylarının etiketlenmesini ve izole edilmesini sağlar, böylece yüksek çözünürlüklü analiz ve kültürü mümkün kılar. Bu son derece hassas yaklaşım, ayrık granülosa, stroma ve teka soyları arasında sağlam ve spesifik olarak eksprese edilen hücre yüzey belirteçlerini hedeflemek için florofor konjuge antikorlarının kombinasyonlarını kullanır. Yumurtalıkları steril bir petri kabına yerleştirerek başlayın ve dokuyu nemlendirmek için soğutulmuş bir ortam dökün, yumurtalığın ortama yarı batırılmış olmasını sağlayın.Herhangi bir dikişi veya başka bir materyali çıkarın ve kalan çevre dokuyu yumurtalıktan uzaklaştırın. Antral folikülleri izole etmek için, tek tek folikülleri tanımlayın ve sağlıklı folikülleri seçin. Kan dolu, koyu veya simetrik olmayan folikülleri hariç tutun.Seçilen antral folikülleri neşter kullanarak yumurtalıktan izole edin, antrumu sağlam tutun ve folikülü çevreleyen kortikal dokuyu eksize edin. Eksize edilmiş her sağlam antral folikülü altı kuyucuk plakasının bir kuyucuğuna yerleştirin. Çanağın altına yerleştirilmiş bir cetvel kullanarak, tanımlayıcı amaçlar için folikül çapını belirleyin.Bir neşter kullanarak, antral boşluğu değerlendirmek için sağlam antral folikülü ikiye bölün ve plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 10 dakika boyunca inkübe etmeden önce altı mililitre enzimatik hücre ayrılma ortamı ekleyin. İnkübasyondan sonra,% 20 fetal sığır serumu veya FBS içeren altı mililitre mevcut ortam ekleyin ve bir P-1000 mikropipet ile iki parçalı foliküller üzerinde tekrarlanan kuvvetli pipetleme ile ortamla yıkayın. Ardından, ortamı toplayın ve 100 milimetrelik bir filtreden geçirin.Filtrelenmiş süpernatantı 300 G ve dört santigrat derecede üç dakika önce santrifüj ettikten sonra, süpernatanı aspire edin. Kalan dokuyu, 30 dakikalık inkübasyondan önce mililitre kollajenaz başına 100 birim ve mililitre dispaz başına bir birim karışıma dengeli bir tuzlu su çözeltisi içinde seyreltin içine yerleştirin. 10 ve 20 dakika sonra iki kez tritüre ve kuvvetli pipetleme yaparak dokuyu mekanik olarak bozar.İşiniz bittiğinde, dokuyu geri kazanın ve pipetleme yoluyla, bir P-1000 mikropipet ucundan geçirin ve 100 mililitrelik bir filtreden süzün. Süzülmüş dokuyu 300 G ve dört santigrat derecede üç dakika boyunca santrifüjleyin, ardından teca hücreleri ve stroma hücreleri ile zenginleştirilmiş hücre peletini etiketleme ve FACS için buz üzerine koyun. Granüloza hücrelerini ve teka hücrelerini tanımlamak için, hücre peletlerini doğrudan konjuge antikorlar içeren bir bloke edici çözelti içinde yeniden askıya alın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Hücreleri yıkadıktan ve santrifüj ettikten sonra, hücreleri 4-6 diamidino-2-fenilindol veya DAPI içeren FACS tamponunda yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu, gating için florofor konjuge antikorlarının floresan yoğunluğunu kullanarak, hücrelerin küçük bir popülasyonunu yakalamak için bir FACS cihazından geçirin. Yumurtalığın geri kalanını ikiye bölün. Medullayı kavisli ince makas ve neşterler kullanarak tüketin ve yumurtalık korteksine zarar vermekten kaçının.Minimal medulla kalana kadar yumurtalık korteksinin işlenmesine ve inceltilmesine hafif kazıma ile devam edin. Kortikal dokuyu yumurtalık uzunluğu boyunca iki ila üç milimetre genişliğinde şeritlere bölün. Yumurtalık dokusunun dondurulması için, dondurma çözeltisini içeren her soğutulmuş kriyojenik şişeye bir kortikal şerit yerleştirin.Kortikal şeritleri içeren kriyojenik şişeleri dönen bir plaka üzerinde dört santigrat derecede 20 dakika çalkalayın. Her kriyo şişesine kısaca sıvı azota batırılmış bir pamuk ucu ile dokunarak buz kristali oluşumunu nüklee edin. Over hücreleri toplandı ve hücre fraksiyonları antral foliküllerden FACS'den% 95'in üzerinde saflığa kadar sıralandı.PVRL1 veya nektin içindeki CD99 spesifik olarak etiketlenmiş granüloza hücreleri, antral foliküllerin boyutu arttıkça oophorus granulosa hücre bölmesine giderek daha fazla lokalize olmuştur. Endoglin veya CD55'e karşı antikorların tüm stroma ve teka hücrelerini spesifik olarak sınırladığı ve alanin aminopeptidazın androjenik teka hücreleri tarafından spesifik olarak eksprese edildiği görüldü. Hücreler, granüloza hücrelerini tanımlamak için CD99'a yönelik bir antikor ile etiketlendi ve hematopoetik hücreleri dışlamak için CD45'e karşı antikorlar kullanıldı.PVRL1'e karşı antikorlar, granüloza hücre popülasyonunu oofor ve duvar bölmelerine ayırdı. Kollajenaz dispaz ile enzimatik sindirimi takiben, CD55, CD34 ve alanin aminopeptidaza karşı antikorlarla etiketlenmiş hücre preparatları, endotel hücrelerinin teka hücrelerinin popülasyonlarından dışlanmasıyla tüm stroma veya teka hücrelerinin veya androjenik teka hücrelerinin yakalanmasını sağlamıştır. İlk folikül izolasyonu sırasında folikül sınırları etrafında güvenli bir marj içinde keserek foliküllerin antrumunu bozmamaya özellikle dikkat edin.Bu prosedürün aşağısında, hücreler moleküler veya tanısal analiz için kullanılabilir veya alternatif olarak toksikoloji çalışmaları, deneysel analiz veya folikül mikroçevresinin özetlenmesi için in vitro olarak kültürlenebilir. Bugüne kadar, bu yöntemler yumurtalık ile ilgili endokrin bozuklukları modellemek ve folikül ile ilişkili hücrelerin yeni alt popülasyonlarını tanımlamak için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Donmuş Hücreler itibaren Kültür: İnsan Embriyonik kök hücrelerin

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Manyetik Rezonans Görüntüleme için in vitro Etiketleme

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Ekstraksiyon ve İnsan ve Maymun Saç gelen Kortizol Analizi

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Görselleştirme ve miktar Mezenkimal hücre Adipojenik farklılaşma potansiyeli bir Lineage belirli Marker ile

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

İnsan Osteoartrit Diz Ekleminden Doku Toplama ve RNA Ekstraksiyonu

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...