Den epigenetiske deaktiveringsteknologien vi utviklet tilhører en større arena av teknologier, som er geninaktiveringsteknologier. Før vi begynte å utvikle epigenetisk silencing behov, var det to mange alternativer i feltet. Den ene er gennedslag av RNA-interferens, og den andre var genforstyrrelser av kunstige nukleaser.
Og genforstyrrelsen av kunstige nukleaser virker på DNA-nivå. Så du har målgenet ditt som du vil inaktivere, og du leverer til cellen noen kunstige nukleaser, som induserer et dobbeltstrengbrudd. Denne typen dobbeltstrengbrudd kan utføre degenerasjonssummen, frameshift-mutasjonen, som til slutt pålegger enten degenerasjon av ikke-funksjonelt protein eller samtidig transkripsjonsnedbrytning.
Så epigenetisk silencing fungerer ved å levere cellen, såkalte konstruerte transkripsjonsrepressorer. Dette er noen små proteiner som er i stand til å binde seg til mål-DNA-et ditt, og deretter bare pålegge målgenet ditt, såkalt epigenetisk marx. Dette er noen kjemiske modifikasjoner, som en gang avsatt på DNA, kan føre til kromatinkomprimering.
Kromatinkomprimering fører da til transkripsjonshemming, slik at du ikke lenger har uttrykket til målgenet ditt. Og veldig viktig, denne typen transkripsjon repressiv tilstand kan forenes forlenges av cellene. For å identifisere cellelinjer som uttrykker målgenet som skal dempes, bla gjennom målgenet i The Human Protein Atlas, og naviger gjennom Cell Line-delen for å identifisere cellelinjer som er representative for det somatiske vevet av interesse.
Fra de identifiserte cellelinjene, prioriter de som effektive forbigående genleveringsprotokoller er tilgjengelige for. Deretter åpner du en genviser og identifiserer regionen av målgenet for å integrere fluoroforuttrykkskassetten. Bruk deretter CHOPCHOP til å identifisere og velge GNRA, som vil skjære i målområdet i det første intronet av Beta-2M-genet.
Deretter designer du en donormal for GNRA-kuttstedet, bestående av en venstre homologiarm, en promotorfri transgen uttrykkskassett og en høyre homologiarm. Lever CRISPR Cas9-nukleasesystemet og donormalen inne i K-562-cellelinjen gjennom nukleofeksjon, i henhold til produsentens instruksjoner. Kultur K-562-cellene i minst 14 dager.
Overvåk ekspresjonsnivåene til den fluorescerende reporteren over tid ved å bruke et flowcytometer. Aktiver FICO etherin-kanalen for å måle fluorescensintensiteten til tdTomato-reporteren. Bla gjennom målgenet i UCSC Genome Browser og trekk ut nukleotidsekvensen av regioner, som potensielt regulerer transkripsjonsaktiviteten, for eksempel CpG-øyer og steder beriket for H3K27-acetylering.
Lim inn de valgte sekvensene i CHOPCHOP online-verktøyet, og velg undertrykkelse som formålet med GNRAene som skal hentes. CHOPCHOP vil gi en liste over GNRAer kartlagt på den genetiske sekvensen av interesse og oppført i henhold til en poengsum, med tanke på antall kamper utenfor målet og den anslåtte måleffektiviteten. Velg minst 10 GNRA-er per målsekvens.
Prøv å velge GNRAer som spenner over hele regionen som skal integreres uten fulle treff med andre intergeniske sekvenser i hele genomet. Etter å ha transformert plasmidene som koder for ETRS i kjemisk kompetente E.coli-celler, screener koloniene for tilstedeværelsen av det ETR-bærende plasmidet ved restriksjonsenzymfordøyelse og Sanger-sekvensering. For å klone GNRAene inne i phU6 GNRA-ryggraden, må du først generere oligoer ved hjelp av molekylærbiologisk designprogramvare.
Legg til en fem nukleotidsekvens oppstrøms for protoavstandsstykket og merk dette 25 nukleotidet langt oligo. På samme måte legger du til en fem nukleotidsekvens av det omvendte komplementet til protoavstandsstykket og et cytosin nedstrøms for det, for å generere et 25 nukleotid langt oligo og merke det. Få disse oligoene syntetisert som saltfrie enkeltstrengede DNA-oligoer resuspendert i vann ved 100 mikromolar.
Tilsett en mikroliter av hver oligo til to mikroliter glødebuffer og 16 mikroliter vann. Utfør oligo glødning ved å plassere løsningen i en termosyklist ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Deretter avkjøles gradvis til 25 grader Celsius over 45 minutter.
Fortynn en mikroliter av de glødde oligoene med 99 mikroliter nukleasefritt vann. Deretter ligerer en mikroliter av denne fortynningen med 50 nanogram phU6 GNRA plasmid, tidligere fordøyd med Bsa1-restriksjonsenzymet. Transformert 20 mikroliter kjemisk kompetente E.coli-celler med to mikroliter av ligeringsproduktet.
Velg flere kolonier for plasmid-DNA-produksjon og bekreft vellykket kloning av protoavstandsstykket ved Sanger-sekvensering. For å levere GNRA-ene og CRISPR dCas9-baserte DTR-er i reportercellelinjen i matrise, må du først forberede separate rør som inneholder 500 nanogram av hver av plasmidene, og tilsett 125 nanogram forskjellige GNRA-kodingsplasmider som skal testes. Inkluder en GNRA og ETR-fri nukleofeksjonstilstand som mock behandlet prøve.
Forbered minst tre tekniske replikater per prøve. Pellet fem ganger 10 til femte Beta-2M tdTomato K-562 celler per rør, og nukleoffect dem med plasmidblandingen. Resuspender cellene i 200 mikroliter av tidligere oppvarmet RPMI 1640 pattedyrcellekulturmedier og plasser dem i inkubatoren.
Bruk flowcytometri til å måle prosentandelen av lydløse celler ved ulike tidspunkter etter levering av ETRene. Bruk villtype celler uten Flora 4 beleggsekvens. For å angi terskelen for negative celler for rapporterer.
Bruk den spottebehandlede prøven til å angi porten for reporterpositive celler. Identifiser de tre beste GNRAene når det gjelder langsiktig deaktiveringseffektivitet. Bruk fakta til å velge de negative underpopulasjonene som rapporterer stabilt i disse utvalgene.
Utfør også fakta om de falske behandlede prøvene under samme behandling for å tillate riktig sammenligning i etterfølgende analyser. En tdTomato fluorescerende reporter ble integrert i det første intronet av det humane Beta-2M-genet ved CRISPR Cas9-indusert tomologirettet reparasjon. Reporterpositive K-562-celler vises i det behandlede utvalget etter integrering.
Ved forbigående levering av trippel ETR-kombinasjonen, sammen med GNRAer, ble det utført longitudinell flowcytometrianalyse for å vurdere ekspresjonen av den fluorescerende reporteren. En topp ble observert i reporterrepressjon ved akutte analyser, som delvis ble reabsorbert på grunn av mitotisk fortynning av de ETR-kodende plasmidene over tid. Effektiv avsetning av CpG-metylering på mållokuset ved ETRs GNRA-kombinasjon ble tydelig ved permanent undertrykkelse av reporteren i en betydelig brøkdel av behandlede celler.
Ulike GNRAer viste variabel langsiktig silencing effektivitet. Et av de viktigste trinnene i å oppnå permanent og effektiv epigenomdeaktivering er identifisering av effektivt enkelt gRNA. For å gjøre det noen form for søknad, må starte med identifisering av de mest responsive sekvensene, inkludert promotor og svar på andre nettsteder for transkripsjonsregulatorer.
Når man er identifisert som kan være den mest responsive og effektive regionen, bør hvem som helst designe forskjellige typer enkelt gRNA en test som individ eller kombinasjon av enkelt gRNA. En av de mest åpenbare anvendelsene av epigenomredigering er sikkert den prekliniske oversettelsen i enhver gevinst av funksjonell mutasjon, der silencing av dette genet kan være nyttig for å kurere spesifikke sykdommer. Alternativt bør vi uansett huske på at evnen til spesifikt å endre den epigenetiske reguleringen av en gitt promotor kan være et supernyttig verktøy for både klinisk og grunnleggende translasjonsvitenskap.