Name: a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids at JoVE.com

يتم دعم البحث من قبل مشروع CALIPSO المدعوم من المؤسسة الوطنية للبحوث ، مكتب رئيس الوزراء ، سنغافورة ، في إطار برنامج الحرم الجامعي للتميز البحثي والمشاريع التكنولوجية (CREATE). يقر V.V. بدعم محقق NRF NRF-NRFI2018-07 ، و MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005 ، والتمويل الأولي MBI ، و ANR ADGastrulo. يقر A.B. و G.G. بالدعم المقدم من التمويل الأساسي ل MBI. A.B. تعترف Andor Technologies بقرض مجهر BC43.

ملاحظة: يفصل الجزء الأول من هذا البروتوكول التصنيع الدقيق لجهاز زراعة الخلايا. يمكن إنتاج قالب أولي أصلي مع تجاويف هرمية داخليا - إذا كانت مرافق التصنيع الدقيقة متاحة - أو الاستعانة بمصادر خارجية لشركات خارجية. يتم إنتاج القالب الأساسي المستخدم في هذا العمل داخليا ، مع خطوات عملية التصنيع ...

<ol>
	<li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+by+design.">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li><li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+materials+for+organoid+systems.">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+past+learning+and+future+directions.">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li><li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines.">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 72 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies.">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype.">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification.">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li></ol>

تم وصف الإجراء الخاص بتصنيع طبق استزراع البئر الصغير ، والذي يسمح بالثقافة العضوية عالية الكثافة والتمايز ، في هذه الورقة. نظرا لهندسة وترتيب التجاويف الدقيقة ، يمكن استزراع الآلاف من الأجسام الكروية وتلطيخها في لوحة واحدة لفترات طويلة من الزمن (عدة أسابيع أو أكثر) دون أي فقد للمواد تقريب...

في ثقافات الخلايا العضوية 3D ، المشار إليها فيما يلي باسم organoids ، تتمايز الخلايا الجذعية وتنظم نفسها في هياكل مكانية تشترك في أوجه تشابه مورفولوجية ووظيفية قوية مع الأعضاء الحقيقية. تقدم الكائنات العضوية نماذج قيمة لدراسة البيولوجيا البشرية والتنمية خارج الجسم1،2،3. يتم تطوير عدد متزايد من النماذج التي تحاكي الكبد والدماغ والكلى والرئة والعديد من الأعضاء الأخرى2،4،5. يتم توجيه التمايز في المواد العضوية عن طريق إضافة عوامل نمو قابلة للذوبان ومصفوفة خارج الخلية في تسلسل زمني دقيق. ومع ذلك ، في تناقض ملحوظ مع الأعضاء ، فإن تطور المواد العضوية غير متجانس تماما.
بالإضافة إلى العديد من التحديات البيولوجية6،7 ، تشكل الثقافات العضوية أيضا تحديات تكنولوجية من حيث طرق زراعة الخلايا ، وتوصيف النسخ ، والتصوير. يحدث تطور الأعضاء في الجسم الحي في بيئة بيولوجية تؤدي إلى تنظيم ذاتي نمطي للغاية لترتيبات الخلايا. يمكن استخدام أي تغيير في النمط الظاهري كوكيل لتشخيص حالة مريضة. في المقابل ، تتطور الكائنات العضوية في المختبر في بيئات دقيقة يتم التحكم فيها بالحد الأدنى ومتوافقة مع ظروف زراعة الخلايا ، مما يؤدي إلى تباين كبير في مسار التطوير وتشكيل الشكل لكل عضو عضوي فردي.
أظهرت دراسة حديثة8 أن التصوير الكمي للشكل العضوي (واصفات النمط الظاهري) إلى جانب تقييم عدد قليل من العلامات الجينية يسمح بتعريف المناظر الطبيعية لتطور النمط الظاهري. يمكن القول إن القدرة على ربط تنوع التعبير الجيني في الكائنات العضوية بسلوكها الظاهري هي خطوة رئيسية نحو إطلاق العنان للإمكانات الكاملة للثقافات العضوية. وبالتالي ، فإنه يطرح لتطوير مناهج تصوير مخصصة وعالية المحتوى تسمح بتوصيف الميزات العضوية في المقاييس تحت الخلوية والمتعددة الخلايا والعضوية الكاملة في 3D 9,10.
لقد طورنا منصة فحص عالية المحتوى (HCS) متعددة الاستخدامات تسمح بزراعة عضوية مبسطة (من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المعزولة [hESCs] ، أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان [hIPSCs] ، أو الخلايا الأولية إلى 3D ، متعددة الخلايا ، عضويات متباينة) وتصوير ثلاثي الأبعاد سريع وغير جراحي. إنه يدمج الجيل التالي ، مصغر ، جهاز زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد ، يسمى رقاقة JeWells ( الشريحة فيما بعد) ، والتي تحتوي على الآلاف من الآبار الدقيقة المصفوفة جيدا والمحاطة بمرايا 45 درجة تسمح بتصوير سريع وثلاثي الأبعاد وعالي الدقة بواسطة الفحص المجهريأحادي الهدف 11. متوافق مع أي مجهر قياسي تجاري مقلوب ، يتيح هذا النظام تصوير 300 مادة عضوية ثلاثية الأبعاد بدقة تحت الخلوية في <1 ساعة.
يبدأ التصنيع الدقيق لجهاز زراعة الخلايا من قالب منظم دقيق موجود ، والذي يحتوي على مئات الأهرامات الدقيقة (الشكل 1 أ) مع قاعدة مربعة وجدران جانبية عند 45 درجة فيما يتعلق بالقاعدة. يوضح الشكل 1C صور المجهر الإلكتروني (EM) لمثل هذه الهياكل. القالب نفسه مصنوع من بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) (PDMS) ويمكن صنعه كنسخة طبق الأصل من قالب أولي (غير موضح هنا) مع الميزات المقابلة (كتجاويف) باستخدام إجراءات الطباعة الحجرية اللينة القياسية. يمكن إنتاج القالب الأساسي بإجراءات مختلفة. تم إجراء البروتوكول المستخدم لهذا البروتوكول باستخدام النقش الرطب السيليكوني كما ورد في Galland et al. 11 ؛ إجراء تصنيع القالب الأساسي ليس بالغ الأهمية لهذا البروتوكول. يتم ترتيب الأهرامات في مصفوفة مربعة ، مع نفس الملعب لاتجاهات X و Y (في هذه الحالة تكون درجة الصوت 350 ميكرومتر).
على سبيل التوضيح ، تم نشر تجارب إثبات المفهوم12 لإثبات أن الشريحة تسمح بالزراعة طويلة المدى (أشهر) وبروتوكولات التمايز مع تحديد عدد الخلايا الأولية في الآبار بدقة. يمكن مراقبة التطوير الفردي لعدد كبير من الكائنات العضوية تلقائيا على الهواء مباشرة باستخدام مجاهر مضان ساطعة قياسية و 3D ذات صفائح ضوئية. علاوة على ذلك ، يمكن استرجاع المواد العضوية لإجراء مزيد من التحقيقات البيولوجية (على سبيل المثال ، تحليل النسخ). تحدد هذه الورقة البروتوكولات التفصيلية لتصنيع أغطية زراعة الخلايا ، وإجراء البذر والتلوين للفحص المجهري الفلوري ، وكذلك استرجاع المواد العضوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19397K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19392K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etching solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEE Spin Coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer AZ400K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>18441223164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Milliq water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Marienfled</td>
			<td>117650</td>
			<td>1.5H, round 25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>BitPlane</td>
			<td></td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Transmission optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TSF100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic M</td>
			<td>Sartorius Stedium Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>CM5206</td>
			<td>bio-mimetic copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA73</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>17-345</td>
			<td>UV curable adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Thermofisher scientific&#160;</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa Fluor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo Resist AZ5214E</td>
			<td>Merck</td>
			<td>14744719710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Plasma tool</td>
			<td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>Pico Plasma</td>
			<td>For O2 plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Sunjin lab</td>
			<td>RC 152001</td>
			<td>water-soluble clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCT Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>IKA (MY)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching tool</td>
			<td>Samco Inc. (JPN)</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td>culture medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>KLOE</td>
			<td></td>
			<td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV mask aligner</td>
			<td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids

إن توصيف عدد كبير من الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) (organoids) بمقاييس دقة مختلفة محدود حاليا بواسطة مناهج التصوير القياسية. يصف هذا البروتوكول طريقة لإعداد رقائق الثقافة العضوية الدقيقة ، والتي تتيح التصوير المباشر متعدد المقاييس 3D على أداة سهلة الاستخدام تتطلب الحد الأدنى من التلاعب وقادرة على ما يصل إلى 300 من إنتاجية التصوير العضوي / ساعة. تتوافق رقائق الاستزراع هذه مع كل من أهداف الهواء والغمر (الهواء والماء والزيت والسيليكون) ومجموعة واسعة من المجاهر الشائعة (على سبيل المثال ، القرص الدوار ، والماسح الضوئي المحوري ، والمجال الواسع ، والحقل الساطع). علاوة على ذلك ، يمكن استخدامها مع طرائق ورقة الضوء مثل تقنية مجهر الإضاءة أحادي الهدف أحادي المستوى (SPIM). 
يقدم البروتوكول الموصوف هنا خطوات مفصلة لإعداد رقائق الاستزراع الدقيقة وزراعة وتلطيخ المواد العضوية. لا يلزم سوى فترة زمنية قصيرة للتعرف عليها ، ويمكن العثور بسهولة على المواد الاستهلاكية والمعدات في المختبرات الحيوية العادية. هنا ، سيتم عرض قدرات التصوير ثلاثي الأبعاد فقط باستخدام المجاهر القياسية التجارية (على سبيل المثال ، القرص الدوار لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد والفحص المجهري واسع المجال للمراقبة الروتينية).

يوضح الشكل 8F الجانب النموذجي لغطاء زراعة الخلية بعد التصنيع الناجح. تظهر الطبقة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية مسطحة وتلتصق جيدا بغطاء الغطاء. قد يفشل نقل الطبقة اللاصقة على غطاء الغطاء إذا تم تجاوز الطبقة الموجودة على غطاء الغطاء ، أو إذا تمت إزالة ركيزة ...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids at JoVE.com

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

يقدم هذا البحث بروتوكول تصنيع لنوع جديد من الركيزة المستزرعة مع مئات الحاويات الدقيقة لكل مم2 ، حيث يمكن استزراع الكائنات العضوية ومراقبتها باستخدام الفحص المجهري عالي الدقة. كما يتم تفصيل بروتوكولات بذر الخلايا وتلطيخ المناعة.

منصة عالية الإنتاجية للثقافة والتصوير 3D من المواد العضوية

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

يوضح هذا البروتوكول طبقا لثقافة الخلايا المجهرية مصمم لنمو مئات الكائنات العضوية مع معرفة المواد ومتوافق تماما مع الفحص المجهري. تسمح تقنيتنا بكفاءة بتوليد الآلاف من الكائنات العضوية ، متوافقة تماما مع التصوير طويل المدى وزراعة الخلايا على المدى الطويل. هذا البروتوكول ذو أهمية كبيرة للتطبيقات الطبية الحيوية مثل خط أنابيب فحص الأدوية ومجالات أبحاث السرطان.من السهل إتقان التقنية المقدمة في هذا البروتوكول بعد بضع محاولات من قبل أي شخص لديه خبرة في الإجراءات المختبرية والفحص المجهري الضوئي. للبدء ، قم بقص أجزاء صغيرة من قالب PDMS إلى البعد المطلوب للجهاز النهائي. قصها بالتوازي مع اتجاهات XY للمصفوفة.ضع أحد نرد قالب PDMS المحضر ووجهه لأسفل على قسم PDMS المسطح. ثم باستخدام ماصة ، أضف ما يقرب من 0.1 إلى 0.2 ملليلتر من المادة اللاصقة القابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية إلى جانب واحد من القالب. اتبع تقدم السائل داخل التجويف باستخدام مجهر بصري مقلوب عند تكبير 10X.تعريض المادة اللاصقة لضوء الأشعة فوق البنفسجية لعلاجها. اضبط وقت التعرض اعتمادا على كثافة طاقة مصدر الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح في مخطوطة النص. باستخدام الكمية الزائدة من المادة اللاصقة على حافة واحدة ، أمسك المادة اللاصقة المعالجة على ركيزة PDMS المسطحة عن طريق الضغط عليها برفق بإصبعك.في هذه الأثناء ، باستخدام الملقط ، اضغط على زاوية واحدة من القالب بجوار نفس الحافة التي يتم الضغط عليها لأسفل وقشر القالب ببطء ، مع التأكد من عدم رفع الفيلم المحكم. قم بقص المادة اللاصقة الزائدة وركيزة PDMS باستخدام شفرة حلاقة لترك الطبقة المعالجة والمزخرفة واللاصقة مسطحة على PDMS مع وجود الركيزة الزائدة على حافة واحدة فقط. عالج غطاء نظيف بعملية بلازما أكسجين قصيرة لتحسين حبه للماء.بعد تنشيط البلازما ، قم بلف الطبقة الرقيقة من المادة اللاصقة القابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية عن طريق وضع الغطاء على ظرف الفراغ لطبقة الدوران القياسية وسكب قطرة صغيرة من المادة اللاصقة في وسط غطاء الغطاء. قم بتشغيل عملية طلاء الدوران كما هو موضح في مخطوطة النص. في حالة عدم توفر طلاء الدوران ، قم بإسقاط ما يقرب من 0.1 ملليلتر من المادة اللاصقة القابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية على غطاء نظيف باستخدام ماصة.خذ غطاء ثان وضعه فوق الأول لجعل المادة اللاصقة السائلة تنتشر بالتساوي بين الغطاءين. بمجرد وصول المادة اللاصقة إلى حافة أغطية الغطاء ، افصلها برفق عن طريق تحريك واحدة فوق الأخرى. بمجرد فصلهما ، سيتم طلاء كلا الغطاءين بالكامل بطبقة رقيقة من المادة اللاصقة السائلة.بعد طلاء الدوران ، قم بمعالجة المادة اللاصقة مسبقا عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية. اضبط وقت التعرض اعتمادا على كثافة الطاقة لمصدر الأشعة فوق البنفسجية المستخدم. خذ أحد الأفلام المزخرفة وضعها على اتصال مع الغطاء المطلي اللاصق. تأكد من أن التلامس بين المادة اللاصقة المعالجة جزئيا والفيلم المحكم موحد قدر الإمكان.في هذه المرحلة ، يجب أن تكون المادة اللاصقة الموجودة على غطاء الغطاء صلبة بدرجة كافية لتجنب إعادة التدفق ويمكن تحسين التلامس عن طريق الضغط برفق على غطاء الغطاء. قم بتعريض الأغطية لضوء الأشعة فوق البنفسجية حتى يتم علاج الطبقة اللاصقة المطلية بالكامل. سيؤدي ذلك إلى إغلاق الفيلم المحكم على غطاء الغطاء وتوفير عزل مانع للتسرب بين تجاويف المحيط.ثم باستخدام الملقط ، اضغط على PDMS على الحافة حيث تركت المواد الزائدة بعد التشذيب وتقشير الركيزة المسطحة PDMS. تمكن هذه الخطوة طبقة الفيلم المحكم من الالتصاق بغطاء الغطاء مع وصول مفتوح في الأعلى لبذر الخلية. قبل بذر الخلية ، على جهاز تم تخميله باستخدام البوليمر المشترك البيومتري كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتوزيع ملليلتر واحد من PBS المعقم في أطباق بتري لزراعة الخلايا 35 ملم.قم بإزالة الطبق باستخدام PBS المعقم باستخدام غرفة التفريغ لمدة 10 دقائق ، تليها عدة جولات من السحب لإزالة جميع الفقاعات. استبدل PBS بوسط ثقافة معقم وقم بتعقيم اللوحة بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة تحت غطاء زراعة الخلية. قم بإعداد معلق خلوي باتباع توصيات إعداد التربسين أو تعليق الخلية للخلايا ذات الأهمية كما هو موضح في مخطوطة النص.عد واضبط تركيز الخلية إلى 500،000 خلية لكل ملليلتر في وسط زراعة الخلايا الموصى به. قم بإزالة المخزن المؤقت PBS من طبق زراعة الخلايا 35 ملم ثم قم بتوزيع ملليلتر واحد من تعليق الخلية المعدل. ضع طبق زراعة الخلايا مرة أخرى في حاضنة الخلية لمدة 10 دقائق.ستدخل ما يقرب من 80 إلى 100 خلية إلى كل تجويف محيط. بعد حوالي 10 دقائق من الحضانة ، استرجع طبق زراعة الخلايا من الحاضنة واستنشق المعلق الخلوي برفق لإزالة الخلايا غير المحاصرة. أضف ملليلترا واحدا من وسط الاستزراع إلى طبق الاستزراع وضعه مرة أخرى في حاضنة الخلية.اختياريا ، لاسترداد المواد العضوية بعد نموها في الآبار ، اضغط على الطبقة اللاصقة المحكم على الحافة المقطوعة باستخدام ملاقط وقشرها برفق من الغطاء الزجاجي ، ولكن احتفظ بها مغمورة في الوسط. زيادة تركيز البوليمر المشترك البيومتري زاد من سمك الطلاء. كان التفريغ الكامل لأطباق زراعة الخلايا ضروريا لإزالة فقاعات الهواء المحاصرة في التجاويف المحيطة.تشكلت المواد العضوية بعد اليومين الثاني و 15 من الزراعة. أظهر المجهر البؤري للقرص الدوار صورا تمثيلية للعضويات وإعادة بناء 3D. عند تحضير طبق الاستزراع ، من المهم الانتباه إلى تجميع القالب أو كومة الركيزة وضمان الاتصال الجيد بين الفيلم المحكم وغطاء الغطاء.وقد اجتذب الاحتواء الذي توفره تجاويفنا الدقيقة وغياب الخسارة المادية انتباه الباحثين في مجال بيولوجيا الفضاء المهتمين بدراسة تأثير الجاذبية الصغرى على التوازن العضوي.

Research

JoVE Journal

Biology

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

حجرة متعددة الخلية العصبية الجهاز العصبي المركزي ، الدبقية منهاج ميكروفلويديك المشارك الثقافة

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Lensless على رقاقة التصوير من الخلايا يوفر أداة جديدة للإنتاجية عالية الأحياء الخلوي والتشخيص الطبي

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

عالية الإنتاجية تحليل صورة الأجسام الشبه الكروية ورم: A برمجيات صديقة للمستخدم التطبيق لقياس حجم الأجسام الشبه الكروية تلقائيا وبدقة

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...