Name: a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids at JoVE.com

Forskningen er støttet af CALIPSO-projektet støttet af National Research Foundation, premierministerens kontor, Singapore, under dets Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) program. V.V. anerkender støtten fra NRF-efterforsker NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-frøfinansiering og ANR ADGastrulo. A.B. og G.G. anerkender støtten fra MBI's kernefinansiering. A.B. anerkender Andor Technologies for lånet af BC43-mikroskopet.

BEMÆRK: Den første del af denne protokol beskriver mikrofabrikationen af cellekulturenheden. En original primær form med pyramidehulrum kan produceres internt - hvis mikrofabrikationsfaciliteter er tilgængelige - eller outsources til eksterne virksomheder. Den primære form, der anvendes i dette arbejde, produceres internt, med fabrikationsprocestrin beskrevet andetsteds11,13. En grundlæggende protokol til mikrofabrikation af formen er tilgængelig i <strong...

<ol>
	<li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+by+design.">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li><li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+materials+for+organoid+systems.">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+past+learning+and+future+directions.">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li><li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines.">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 72 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies.">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype.">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification.">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li></ol>

Fremgangsmåden til fremstilling af mikrobrøndkulturskålen, som tillader organoidkultur og differentiering med høj densitet, er beskrevet i dette papir. På grund af geometrien og arrangementet af mikrohulrummene kan tusindvis af sfæroider dyrkes og farves i en enkelt plade i lange perioder (flere uger eller mere) næsten uden tab af materiale. Til sammenligning kan et område på 4 mm x 2 mm på cellekulturpladen indeholde så mange sfæroider som en enkelt 384-brøndplade med et areal på 12 cm x 8 cm. 
<p clas...

I organotypiske 3D-cellekulturer, i det følgende benævnt organoider, differentierer stamceller og selvorganiserer sig i rumlige strukturer, der deler stærke morfologiske og funktionelle ligheder med virkelige organer. Organoider tilbyder værdifulde modeller til at studere menneskelig biologi og udvikling uden for kroppen 1,2,3. Et stigende antal modeller udvikles, der efterligner leveren, hjernen, nyrerne, lungerne og mange andre organer 2,4,5. Differentiering i organoider styres ved tilsætning af opløselige vækstfaktorer og en ekstracellulær matrix i en præcis tidssekvens. I markant modsætning til organer er udviklingen af organoider imidlertid ret heterogen.
Ud over adskillige biologiske udfordringer6,7 udgør organoidkulturer også teknologiske udfordringer med hensyn til cellekulturmetoder, karakterisering af transkriptomik og billeddannelse. In vivo organudvikling sker i et biologisk miljø, der resulterer i en meget stereotyp selvorganisering af cellearrangementer. Enhver fænotypisk ændring kan bruges som en proxy til at diagnosticere en syg tilstand. I modsætning hertil udvikler organoider in vitro i minimalt kontrollerede mikromiljøer, der er kompatible med cellekulturbetingelser, hvilket resulterer i stor variation i udviklingsvejen og formdannelsen for hver enkelt organoid.
En nylig undersøgelse8 viste, at kvantitativ billeddannelse af organoid form (fænotypedeskriptorer) kombineret med vurderingen af nogle få genetiske markører gør det muligt at definere fænotypiske udviklingslandskaber. Evnen til at relatere mangfoldigheden af genomisk ekspression i organoider med deres fænotypiske adfærd er uden tvivl et stort skridt i retning af at frigøre det fulde potentiale i organotypiske kulturer. Således beder det om udvikling af dedikerede, billeddannelsesmetoder med højt indhold, der muliggør karakterisering af organoidfunktioner på subcellulære, multicellulære og helorganoide skalaer i 3D 9,10.
Vi udviklede en alsidig HCS-platform (high-content screening), der muliggør strømlinet organoidkultur (fra isolerede humane embryonale stamceller [hESC'er], humant inducerede pluripotente stamceller [hIPSC'er] eller primære celler til 3D, multicellulære, differentierede organoider) og hurtig, ikke-invasiv 3D-billeddannelse. Det integrerer en næste generations miniaturiseret 3D-cellekulturenhed, kaldet JeWells-chippen ( chippen herefter), der indeholder tusindvis af velarrayed mikrobrønde flankeret med 45 ° spejle, der muliggør hurtig 3D, høj opløsning billeddannelse ved enkeltobjektiv lysarkmikroskopi11. Kompatibel med ethvert standard, kommercielt, omvendt mikroskop, muliggør dette system billeddannelse af 300 organoider i 3D med subcellulær opløsning på <1 time.
Mikrofabrikationen af cellekulturindretningen starter fra en eksisterende mikrostruktureret form, der indeholder hundredvis af mikropyramider (figur 1A) med en firkantet base og sidevægge ved 45 ° i forhold til basen. Figur 1C viser elektronmikroskopbilleder (EM) af sådanne strukturer. Selve formen er lavet af poly (dimethylsiloxan) (PDMS) og kan fremstilles som en replika støbning af en primær form (ikke vist her) med tilsvarende funktioner (som hulrum) ved hjælp af standard blød-litografiske procedurer. Den primære form kan fremstilles ved forskellige procedurer. Den, der blev brugt til denne protokol, blev fremstillet ved hjælp af siliciumvådætsning som rapporteret i Galland et al. 11; Proceduren til fremstilling af den primære form er ikke kritisk for denne protokol. Pyramiderne er arrangeret i et kvadreret array med samme tonehøjde for X- og Y-retningerne (i dette tilfælde er tonehøjden 350 μm).
Som en illustration blev proof-of-concept-eksperimenter12 offentliggjort for at demonstrere, at chippen tillader langsigtet kultur (måneder) og differentieringsprotokoller, samtidig med at antallet af indledende celler i brøndene præcist defineres. Individuel udvikling af et stort antal organoider kan automatisk overvåges live ved hjælp af standard brightfield og 3D lysark fluorescens mikroskoper. Desuden kan organoider hentes for at udføre yderligere biologiske undersøgelser (fx transkriptomisk analyse). Dette papir skitserer detaljerede protokoller til fremstilling af cellekulturdæksedler, sånings- og farvningsproceduren for fluorescensmikroskopi samt hentning af organoiderne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19397K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19392K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etching solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEE Spin Coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer AZ400K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>18441223164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Milliq water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Marienfled</td>
			<td>117650</td>
			<td>1.5H, round 25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>BitPlane</td>
			<td></td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Transmission optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TSF100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic M</td>
			<td>Sartorius Stedium Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>CM5206</td>
			<td>bio-mimetic copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA73</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>17-345</td>
			<td>UV curable adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Thermofisher scientific&#160;</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa Fluor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo Resist AZ5214E</td>
			<td>Merck</td>
			<td>14744719710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Plasma tool</td>
			<td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>Pico Plasma</td>
			<td>For O2 plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Sunjin lab</td>
			<td>RC 152001</td>
			<td>water-soluble clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCT Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>IKA (MY)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching tool</td>
			<td>Samco Inc. (JPN)</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td>culture medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>KLOE</td>
			<td></td>
			<td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV mask aligner</td>
			<td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids

Karakteriseringen af et stort antal tredimensionelle (3D) organotypiske kulturer (organoider) ved forskellige opløsningsskalaer er i øjeblikket begrænset af standard billeddannelsesmetoder. Denne protokol beskriver en måde at forberede mikrofabrikerede organoidkulturchips på, som muliggør multiskala, 3D live imaging på et brugervenligt instrument, der kræver minimal manipulation og er i stand til op til 300 organoider / h billeddannelsesgennemstrømning. Disse kulturchips er kompatible med både luft- og nedsænkningsmål (luft, vand, olie og silikone) og en lang række almindelige mikroskoper (f.eks. Roterende disk, punktscanner konfokal, bredt felt og brightfield). Desuden kan de bruges med lysarkmodaliteter såsom enkeltobjektiv, enkeltplan belysningsmikroskopi (SPIM) teknologi (soSPIM). 
Protokollen beskrevet her giver detaljerede trin til fremstilling af de mikrofabrikerede kulturchips og kultur og farvning af organoider. Der kræves kun kort tid for at blive fortrolig med, og forbrugsstoffer og udstyr kan let findes i normale biolabs. Her vil 3D-billeddannelsesfunktionerne kun blive demonstreret med kommercielle standardmikroskoper (f.eks. Roterende disk til 3D-rekonstruktion og bredfeltmikroskopi til rutinemæssig overvågning).

Figur 8F viser det typiske aspekt af en cellekultur coverslip efter vellykket fabrikation. Det UV-hærdelige klæbende lag ser fladt ud og klæber godt til dækslet. Overførslen af klæbelaget på dæksedlen kan mislykkes, hvis laget på dæksedlen er overhærdet, eller hvis fjernelsen af det flade PDMS-substrat udføres forkert (som vist i figur 8G,H). I begge tilfælde er fejlen tydelig, da der ikke overføres tekstureret film til dæksedlen....

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids at JoVE.com

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Dette papir præsenterer en fabrikationsprotokol for en ny type kultursubstrat med hundredvis af mikrobeholdere pr. mm2, hvor organoider kan dyrkes og observeres ved hjælp af mikroskopi med høj opløsning. Protokollerne for cellesåning og immunfarvning er også detaljerede.

En platform med høj kapacitet til kultur og 3D-billeddannelse af organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Denne protokol demonstrerer en mikroteksturcellekulturskål, der er konstrueret til vækst af hundredvis af organoider med viden om materiale og fuldt kompatibel med mikroskopi. Vores teknik giver effektivt mulighed for at generere tusindvis af organoider, fuldt kompatible med langsigtet billeddannelse og langsigtet cellekultur. Denne protokol er af stor interesse for biomedicinske applikationer såsom lægemiddelscreeningspipeline og kræftforskningsdomæner.Teknikken præsenteret i denne protokol er let at mestre efter et par forsøg fra enhver, der har erfaring med laboratorieprocedurer og optisk mikroskopi. Til at begynde med skal du skære små portioner af PDMS-formen til den dimension, der kræves til den endelige enhed. Skær dem parallelt med XY-retningerne i arrayet.Placer en af de forberedte PDMS-formterninger med forsiden nedad på den flade PDMS-sektion. Brug derefter en pipette til at tilføje ca. 0,1 til 0,2 ml UV-hærdeligt klæbemiddel til den ene side af formen. Følg udviklingen af væsken inde i hulrummet ved hjælp af et omvendt optisk mikroskop ved 10X forstørrelse.Udsæt klæbemidlet for UV-lys for at hærde det. Juster eksponeringstiden afhængigt af UV-kildens effekttæthed som beskrevet i tekstmanuskriptet. Brug den overskydende mængde klæbemiddel i den ene kant til at holde det hærdede klæbemiddel på det flade PDMS-substrat ved forsigtigt at trykke på det med en finger.I mellemtiden skal du bruge pincet til at klemme det ene hjørne af formen ved siden af den samme kant, der holdes nede, og langsomt skrælle formen af, samtidig med at du sikrer, at den teksturerede film ikke løftes. Trim det overskydende klæbemiddel og PDMS-substratet ved hjælp af et barberblad for at efterlade det hærdede, strukturerede og klæbende lag fladt på PDMS med det overskydende substrat kun på den ene kant. Behandl en ren dæksel med en kort iltplasmaproces for at forbedre dens hydrofilicitet.Efter plasmaaktiveringen skal du dreje det tynde lag UV-hærdeligt klæbemiddel ved at placere dækselsedlen på vakuumpatronen på en standard spincoater og hælde en lille dråbe klæbemiddel i midten af dæksedlen. Kør centrifugeringsbelægningsprocessen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Hvis centrifugeringsbelægning ikke er tilgængelig, skal du tabe ca. 0,1 ml UV-hærdeligt klæbemiddel på en ren dæksel ved hjælp af en pipette.Tag en anden dæksel, og læg den oven på den første for at få det flydende klæbemiddel til at sprede sig jævnt mellem de to dæksedler. Når klæbemidlet har nået kanten af dækslerne, skal du forsigtigt adskille dem ved at glide over hinanden. Når de er adskilt, vil begge dæksler være fuldt belagt med et tyndt lag flydende klæbemiddel.Efter centrifugering skal klæbemidlet forhærdes ved udsættelse for UV. Juster eksponeringstiden afhængigt af effekttætheden af den anvendte UV-kilde. Tag en af de teksturerede film og sæt den i kontakt med den klæbende belagte dæksel. Sørg for, at kontakten mellem det delvist hærdede klæbemiddel og den teksturerede film er så ensartet som muligt.På dette trin skal klæbemidlet på dæksedlen være solidt nok til at undgå at flyde igen, og kontakten kan optimeres ved forsigtigt at trykke på dæksedlen. Udsæt dækslerne for UV-lys, indtil det belagte klæbende lag er hærdet helt. Dette forsegler den teksturerede film på dækslet og giver lækagesikker isolering mellem omkredshulrummene.Brug derefter pincet til at klemme PDMS i kanten, hvor det overskydende materiale blev efterladt efter trimning, og skræl PDMS flade substrat af. Dette trin gør det muligt for det teksturerede filmlag at klæbe til dækselen med åben adgang øverst til cellesåning. Før cellesåning dispenseres en milliliter steril PBS i petriskålene med 35 millimeter cellekultur på en enhed, der er passiveret med biometrisk copolymer som beskrevet i manuskriptet.Afgas skålen med steril PBS ved hjælp af vakuumkammeret i 10 minutter, efterfulgt af flere runder pipettering for at fjerne alle boblerne. Udskift PBS med sterilt dyrkningsmedium og steriliser pladen med UV-lys i 30 minutter under en cellekulturhætte. Forbered en cellesuspension ved at følge anbefalingerne til trypsinisering eller forberedelse af cellesuspension for de interessante celler som beskrevet i tekstmanuskriptet.Tæl og juster cellekoncentrationen til 500.000 celler pr. Milliliter i det anbefalede cellekulturmedium. Fjern PBS-bufferen fra 35 millimeter cellekulturskålen, og dispenser derefter en milliliter af den justerede cellesuspension. Placer cellekulturskålen tilbage i celleinkubatoren i 10 minutter.Ca. 80 til 100 celler kommer ind i hvert omkredshulrum. Efter ca. 10 minutters inkubation genvindes cellekulturskålen fra inkubatoren og forsigtigt aspireres den cellulære suspension for at fjerne ufangede celler. Tilsæt en milliliter kulturmedium til kulturskålen og læg den tilbage i celleinkubatoren.For at hente organoiderne, efter at de voksede i brøndene, skal du eventuelt klemme det teksturerede klæbende lag på skærekanten ved hjælp af pincet og forsigtigt skrælle det af glasdækslet, men hold det nedsænket i mediet. Forøgelse af koncentrationen af biometrisk copolymer øgede belægningstykkelsen. Fuldstændig afgasning af cellekulturskålene var afgørende for at fjerne luftbobler fanget i perimeterhulrummene.Organoider blev dannet efter dag to og 15 af dyrkning. Den roterende skivekonfokalmikroskopi viste repræsentative billeder af organoiderne og en 3D-rekonstruktion. Når du tilbereder kulturskålen, er det vigtigt at være opmærksom på samlingen af formen eller substratstakken og sikre god kontakt mellem den teksturerede film og dæksedlen.Indeslutningen, der leveres af vores mikrohulrum og fraværet af materialetab, har tiltrukket sig opmærksomhed fra rumbiologiske forskere, der er interesserede i at studere effekten af mikrogravitation på organoid homeostase.

Research

JoVE Journal

Biology

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biokemisk og High Throughput Mikroskopisk vurdering af Fat Mass i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

High Throughput Microinjections af søpindsvin Zygoter

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

High-throughput Billede Analyse af Tumor Spheroids: Et brugervenligt program til at måle størrelsen af ​​Spheroids automatisk og præcist

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Inddrivelse af voksne zebrafisk Hearts for high-throughput applikationer

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - En High Throughput, Real Time PCR-analysen for Sc2.0 Genotypebestemmelse

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...